引用本文： 蔣昇源, 李丹, 姜建浩, 楊上游, 楊淑野. 鈷鉻顆粒刺激制備小鼠膝關節假體無菌性松動模型的研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(5): 615-620. doi: 10.7507/1002-1892.201909023 復制
隨著人口老齡化進程加劇，終末期骨關節患者人數逐年升高，人工關節置換術已成為治療該疾病最為有效的方法，可大大提高患者生存質量[1]。據統計，接受人工關節置換術患者中約 20% 會二次翻修，導致假體翻修的主要原因之一為術后關節假體無菌性松動[2]。所以，尋求控制假體無菌性松動發生的有效辦法，已成為骨科研究熱點之一。
假體無菌性松動動物模型是研究假體無菌性松動發病機制，深入探討其生物學變化的重要手段。理想動物模型需具備以下 3 個特點：① 模擬假體無菌性松動發生過程；② 能提供活體模型，模擬臨床疾病發展規律；③ 在預防和治療假體無菌性松動方面提供指導[3-5]。既往研究常用山羊[6-7]、犬[8]、兔[9]等大型動物制備模型，其共同優點是可針對動物體型設計關節假體，能較好復制人體關節置換術過程，可進行長期研究。但缺點是動物價格高昂，飼養管理難度較大，大樣本研究受限。
鼠類作為小型動物模型典型代表，由于飼養管理方便、生產繁殖快、不受樣本數量限制、與人類基因具有同源性等優點，廣泛應用于各種研究中。目前已有以磨損顆粒誘導的小鼠顱骨無菌性松動模型報道[10-12]，但此類動物模型具有以下局限性：① 缺乏假體植入，無法進行機械力學方面研究；② 顱骨屬于扁骨，無法模擬股骨、脛骨等長骨的無菌性松動過程；③ 多為急性骨溶解模型，無法用于長期研究。針對其局限性，本研究通過在小鼠膝關節內植入鈦釘并注射鈷鉻顆粒懸液，模擬人工關節置換術后假體無菌性松動過程，通過影像學、生物力學、病理學等方法觀察小鼠膝關節假體周圍骨質變化情況，以期為假體無菌性松動研究提供理想的動物模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 SCID 小鼠 24 只，體質量 203～265 g，由濱州醫學院實驗動物中心提供。分籠管理（每籠 4 只），使用標準小鼠飼料喂養，室溫保持在 18～22℃。實驗前 2 周進行隔離，實驗前適應性喂養 1 周。
PBS（Sigma 公司，美國）；鈷鉻顆粒（Wright Medical 公司，美國），使用時采用 PBS 配置成濃度為 50 mg/mL 的懸液；鈦釘（Stryker 公司，美國）；Micro-CT（SCANCO Medical 公司，瑞士）；微小力拉扭試驗機、 WinTest?軟件（Bose 公司，美國）；Evaluation Program V6.5-1 軟件（Scanco Medical 公司，瑞士）。
1.2 實驗分組及方法
24 只小鼠隨機分為實驗組及對照組，每組 12 只。術前兩組小鼠禁飲食 12 h。經腹腔注射氯胺酮（120 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）混合液麻醉后，小鼠仰臥位固定，右后肢備皮、消毒并鋪巾。先使小鼠右后肢屈膝 90° 并固定，沿膝關節內側即髕韌帶內側縱行切開皮膚約 5 mm，顯露髕韌帶；然后沿髕韌帶內側切開髕旁支持帶，顯露脛骨平臺。使用 11 號尖刀片刮除脛骨平臺周圍的關節軟骨，然后使用牙科電動鉆（鉆頭直徑 0.7 mm）沿脛骨平臺中央，順脛骨近端骨髓腔方向鉆入約 5 mm，用顯微血管鉗將鈦釘（長度 5.0 mm，尾帽直徑 1.2 mm，釘軸直徑 0.8 mm）植入脛骨近端髓腔。實驗組植入鈦釘之前，在脛骨近端髓腔內注射 10 μL 濃度為 50 mg/mL 的鈷鉻顆粒懸液，對照組不注射鈷鉻顆粒懸液。壓緊鈦釘尾帽，使其與脛骨平臺齊平。使用含 100 U/mL 青霉素及 100 mg/mL 鏈霉素的 PBS 溶液沖洗切口后，依次縫合各層組織。
術后小鼠單籠飼養，室溫保持 18～22℃，使用標準小鼠飼料喂養，不限制活動。術后 5 周引頸處死兩組小鼠取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察小鼠存活、切口愈合以及下肢活動情況。
1.3.2 影像學檢查
術后即刻兩組行 X 線片及 CT 檢查，確定脛骨近端植入鈦釘位置是否正確。術后 2 d 行右后肢膝關節脛骨近端 Micro-CT 掃描及膝關節 X 線片檢查；術后 5 周處死小鼠前再次對脛骨近端行 Micro-CT 掃描，處死小鼠后離斷膝關節并攝 X 線片。比較各時間點影像學圖像，觀察植入的鈦釘位置是否變化；利用 Evaluation Program V6.5-1 軟件測量術后 5 周時脛骨近端骨密度值，以其與正常骨密度基線值的百分比作為最終骨密度值，進行統計分析。
1.3.3 生物力學試驗
影像學檢查后，刀片刮除兩組小鼠脛骨近端周圍軟組織，顯露脛骨平臺以及鈦釘尾帽，進行拔釘試驗。將標本脛骨遠端固定于盛有石膏粉的容器槽內，將鈦釘尾帽置于夾持刀片中間，連接固定架與微小力拉扭試驗機，使機器長軸與鈦釘長軸保持平行，以 1.0 mm/min 速度進行緩慢牽拉，直至鈦釘被拔除后停止。采用 WinTest?軟件測定鈦釘-骨界面最大剪切力。
1.3.4 組織學染色
生物力學試驗后收集脛骨近端周圍軟組織，依次脫鈣處理，制作石蠟切片，片厚 0.5 μm。常規 HE 染色，光鏡下觀察鈦釘周圍組織大體形態。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism5.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗組 2 只小鼠分別于術后 7、12 d 死亡，切口未見明顯感染跡象，術后活動量少、飲食情況不佳，考慮死亡可能與小鼠體質以及手術耐受性有關。剩余 22 只小鼠均存活至實驗完成。小鼠麻醉清醒后即開始患肢不負重爬行，飲食正常；2 d 后開始負重爬行；1 周后切口愈合，未出現感染征象；5 周時右后肢膝關節活動良好。
2.2 影像學檢查
X 線片及 CT 檢查顯示術后即刻兩組鈦釘均位于髓腔內，術后 2 d 與 5 周時鈦釘無明顯移位。Micro-CT 掃描顯示對照組脛骨近端髓腔內鈦釘固定良好，5 周時鈦釘周圍有新生骨痂；實驗組隨時間延長，鈦釘周圍存在明顯骨溶解現象。實驗組小鼠脛骨近端骨密度值為 91.25%±0.67%，對照組為 102.07%±1.87%，差異有統計學意義（t=5.462，P=0.041）。見圖 1～3。
圖1
兩組 X 線片檢查
從左至右分別為術后即刻、2 d 及 5 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure1. X-ray films of the two groupsFrom left to right for immediately, 2 days, and 5 weeks after operation a. Control group; b. Experimental group
圖2
兩組 Micro-CT 檢查
從左至右分別為術后即刻、2 d 及 5 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure2. Micro-CT examination of the two groupsFrom left to right for immediately, 2 days, and 5 weeks after operation a. Control group; b. Experimental group
圖3
兩組術后即刻 CT 檢查
從左至右分別為脛骨近端矢狀位、橫截面及三維重建圖像 a. 對照組；b. 實驗組
Figure3. CT of the two groups at immediate after operationFrom left to right for sagittal position, cross section, and three-dimensional reconstruction of proximal tibia a. Control group; b. Experimental group
2.3 生物力學試驗
實驗組鈦釘-骨界面最大剪切力為（5.93±0.85）N，明顯低于對照組的（16.76±3.09）N，差異有統計學意義（t=3.760，P=0.046）。
2.4 組織學觀察
對照組脛骨髓腔內鈦釘周圍有明顯骨組織生成，無明顯炎癥細胞浸潤。實驗組鈦釘周圍可見明顯炎癥反應膜形成，大量炎癥細胞浸潤。見圖 4。
圖4
兩組 HE 染色觀察（×100）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure4. HE staining of the two groups (×100)a. Control group; b. Experimental group
3 討論
人工關節假體無菌性松動的發生機制尚存爭議，目前大量研究表明該結果是由若干因素共同導致[13]，主要分為兩方面：一是機械性因素，主要體現在假體與骨組織的嵌合、固定裝置的質量以及肌肉的協調性與強度；二是生物性因素，關節微動摩擦產生的磨損顆粒與組織細胞反應所產生的一系列炎癥因子作用于骨細胞，使得假體周圍骨組織含量減少，最終導致假體松動[14-15]。研究表明，無菌性松動的病理學本質是假體周圍凈骨量的減少，其原因包括以下方面：① 破骨前體細胞大量浸入及破骨細胞的生成大量增加；② 破骨細胞的生命周期延長；③ 成骨前體細胞及成骨細胞數量減少，正常功能受到損傷；④ 成骨細胞生命周期縮短[16-17]。相關臨床研究表明，應力遮擋與假體松動也存在一定聯系，其導致假體周圍承受的負荷遠低于其他部位，更容易出現骨溶解現象[18]。武文等[19]認為假體-骨界面血供減少可能是假體無菌性松動的另一個重要原因。
相關基因學檢測提示小鼠基因序列與人類相似，且小鼠間個體差異較小，同時小鼠價格低廉，可以進行大樣本研究。基于以上優點，小鼠模型成為越來越多實驗研究的首選[20]。6～8 周齡小鼠身體各器官已發育成熟，因此本研究選擇了 8 周齡雄性 SCID 小鼠作為造模對象。隨著人工關節活動及其與體液的接觸，假體磨損不可避免會產生磨損顆粒。研究證明，人工關節假體的磨損程度與人體活動度以及假體與骨質界面的微動有關[21]。Ren 等[22]研究了巨噬細胞在磨損顆粒誘導的骨溶解中的作用，建立了巨噬細胞凋亡小鼠模型，但是該模型無假體植入，缺少機械性刺激。Warme 等[23]為研究假體無菌性松動的發生機制，將克氏針植入小鼠股骨并將金屬顆粒灌注于克氏針上。該實驗一定程度上模擬了承重條件下磨損顆粒誘導骨溶解的微環境，但是動物模型選取的實驗部位為股骨干，缺乏關節解剖模型，與臨床中人工關節置換術仍有一定差異。為此，本研究選擇在小鼠膝關節內植入鈦釘，盡可能模擬臨床中人工關節置換術的操作過程，手術完成后及術后 2 d 行影像學檢查，確保鈦釘位于脛骨髓腔內。此外，術后不限制小鼠膝關節活動，使得鈦釘與骨質充分接觸反應。
人體內假體無菌性松動的產生多為磨損顆粒對脛骨、股骨等長骨的長期作用所致，構建長期、有效的動物模型是研究假體松動的關鍵。但目前研究制備的多為急性骨溶解與骨重塑動物模型，無法有效模擬假體周圍慢性炎癥反應發生過程。Ma 等[24]發明了一種可以連續向小鼠股骨髓腔內輸送磨損顆粒的滲透泵，采用該項技術制備的動物模型可以用來研究磨損顆粒在體內的生物學變化。雖然該滲透泵制備的動物模型解決了既往模型主要為急性骨溶解的問題，然而在實驗中并未觀察到明確骨溶解現象。為此，我們將實驗周期設定為 5 周，小鼠在術后第 2 天便可部分負重爬行，至 2 周后活動已無障礙，但仍與臨床中假體佩戴周期有一定差異。
一系列研究表明，高濃度鈷鉻顆粒可激活不同細胞釋放 TNF-α、IL-1β，促進假體周圍破骨細胞生成、抑制 ALP 活性[25-27]。同時不同濃度鈷鉻顆粒也會對成骨前體細胞產生一定影響，我們前期體外實驗發現濃度為 50 mg/mL 的鈷鉻顆粒懸液毒性較其他濃度更大。因此，我們在植入鈦釘之前向實驗組小鼠脛骨髓腔內注入 10 μL 濃度 50 mg/mL 鈷鉻顆粒懸液。術后 5 周 Micro-CT 檢測提示實驗組小鼠膝關節假體周圍存在骨溶解現象；進一步行骨密度值測量提示，實驗組小鼠膝關節假體周圍骨密度遠低于對照組；生物力學測試顯示，實驗組鈦釘被拔出的最大剪切力明顯低于對照組。上述結果均提示與對照組相比，實驗組小鼠膝關節假體周圍存在明顯松動現象，進一步證實了骨溶解現象的存在。
磨損顆粒刺激假體周圍骨質產生一系列炎癥反應，在假體與骨組織之間形成一種膜性結構，稱為界膜。同時，磨損顆粒對巨噬細胞的毒性作用也可促進不同炎癥因子的釋放，分別作用于成骨、破骨細胞，破壞二者之間平衡，最終導致骨溶解[28]。病理學檢查可直觀發現假體周圍是否存在炎癥反應膜，有研究雖成功建立了負重膝關節假體動物模型，但這些動物模型實驗較為局限，僅進行了生物力學與機械學方面研究，缺乏組織學相關實驗，無法驗證假體周圍炎癥反應變化[29-30]。為此，我們對小鼠膝關節進行 HE 染色觀察，結果顯示實驗組小鼠鈦釘周圍可見明顯炎癥細胞浸潤，進一步證實了磨顆粒被假體周圍 BMSCs、巨噬細胞、成骨細胞、淋巴細胞、成纖維細胞等吞噬，釋放出 IL-1、IL-6、TNF-α 等細胞因子與炎癥介質這一機制[31]。
理想的人工關節假體無菌性松動動物模型應最大程度模仿臨床中假體松動過程，該過程包括生物力學、病理學、組織學等方面的變化，并非由單一因素構成。因此，在既往人工關節假體無菌性松動研究中采用的動物模型，均存在一定局限性。本研究構建的小鼠膝關節假體無菌性松動模型，分別從生物力學、組織學等方面進行了觀測，印證了鈷鉻顆粒在假體無菌性松動過程中的作用，提示該模型可以模擬各種磨損顆粒引發的假體無菌性松動發展過程。同時該模型還具備實驗成本低、可大樣本研究以及適合長期研究等優勢。其缺點是小鼠體質量、步態等與人類有較大差異，假體的設計及植入方法與臨床人工關節置換術不同。上述缺點使得該模型在研究機械應力對假體磨損及松動的影響方面存在一定缺陷。同時，小鼠骨骼過于細小，鈦釘植入操作較為精細，對研究者的外科操作技術要求較高，也是該模型制備方法不足之處。
作者貢獻：楊淑野、楊上游負責實驗設計及協助實驗開展；蔣昇源、李丹負責實驗實施及文章撰寫；姜建浩負責實驗數據收集整理及統計分析。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經濱州醫學院附屬醫院醫學科研倫理委員會批準（20190520-01）。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物倫理學標準，實驗動物生產許可證號：SCXK（魯）2014-0007，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）20180022。
隨著人口老齡化進程加劇，終末期骨關節患者人數逐年升高，人工關節置換術已成為治療該疾病最為有效的方法，可大大提高患者生存質量[1]。據統計，接受人工關節置換術患者中約 20% 會二次翻修，導致假體翻修的主要原因之一為術后關節假體無菌性松動[2]。所以，尋求控制假體無菌性松動發生的有效辦法，已成為骨科研究熱點之一。
假體無菌性松動動物模型是研究假體無菌性松動發病機制，深入探討其生物學變化的重要手段。理想動物模型需具備以下 3 個特點：① 模擬假體無菌性松動發生過程；② 能提供活體模型，模擬臨床疾病發展規律；③ 在預防和治療假體無菌性松動方面提供指導[3-5]。既往研究常用山羊[6-7]、犬[8]、兔[9]等大型動物制備模型，其共同優點是可針對動物體型設計關節假體，能較好復制人體關節置換術過程，可進行長期研究。但缺點是動物價格高昂，飼養管理難度較大，大樣本研究受限。
鼠類作為小型動物模型典型代表，由于飼養管理方便、生產繁殖快、不受樣本數量限制、與人類基因具有同源性等優點，廣泛應用于各種研究中。目前已有以磨損顆粒誘導的小鼠顱骨無菌性松動模型報道[10-12]，但此類動物模型具有以下局限性：① 缺乏假體植入，無法進行機械力學方面研究；② 顱骨屬于扁骨，無法模擬股骨、脛骨等長骨的無菌性松動過程；③ 多為急性骨溶解模型，無法用于長期研究。針對其局限性，本研究通過在小鼠膝關節內植入鈦釘并注射鈷鉻顆粒懸液，模擬人工關節置換術后假體無菌性松動過程，通過影像學、生物力學、病理學等方法觀察小鼠膝關節假體周圍骨質變化情況，以期為假體無菌性松動研究提供理想的動物模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 SCID 小鼠 24 只，體質量 203～265 g，由濱州醫學院實驗動物中心提供。分籠管理（每籠 4 只），使用標準小鼠飼料喂養，室溫保持在 18～22℃。實驗前 2 周進行隔離，實驗前適應性喂養 1 周。
PBS（Sigma 公司，美國）；鈷鉻顆粒（Wright Medical 公司，美國），使用時采用 PBS 配置成濃度為 50 mg/mL 的懸液；鈦釘（Stryker 公司，美國）；Micro-CT（SCANCO Medical 公司，瑞士）；微小力拉扭試驗機、 WinTest?軟件（Bose 公司，美國）；Evaluation Program V6.5-1 軟件（Scanco Medical 公司，瑞士）。
1.2 實驗分組及方法
24 只小鼠隨機分為實驗組及對照組，每組 12 只。術前兩組小鼠禁飲食 12 h。經腹腔注射氯胺酮（120 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）混合液麻醉后，小鼠仰臥位固定，右后肢備皮、消毒并鋪巾。先使小鼠右后肢屈膝 90° 并固定，沿膝關節內側即髕韌帶內側縱行切開皮膚約 5 mm，顯露髕韌帶；然后沿髕韌帶內側切開髕旁支持帶，顯露脛骨平臺。使用 11 號尖刀片刮除脛骨平臺周圍的關節軟骨，然后使用牙科電動鉆（鉆頭直徑 0.7 mm）沿脛骨平臺中央，順脛骨近端骨髓腔方向鉆入約 5 mm，用顯微血管鉗將鈦釘（長度 5.0 mm，尾帽直徑 1.2 mm，釘軸直徑 0.8 mm）植入脛骨近端髓腔。實驗組植入鈦釘之前，在脛骨近端髓腔內注射 10 μL 濃度為 50 mg/mL 的鈷鉻顆粒懸液，對照組不注射鈷鉻顆粒懸液。壓緊鈦釘尾帽，使其與脛骨平臺齊平。使用含 100 U/mL 青霉素及 100 mg/mL 鏈霉素的 PBS 溶液沖洗切口后，依次縫合各層組織。
術后小鼠單籠飼養，室溫保持 18～22℃，使用標準小鼠飼料喂養，不限制活動。術后 5 周引頸處死兩組小鼠取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察小鼠存活、切口愈合以及下肢活動情況。
1.3.2 影像學檢查
術后即刻兩組行 X 線片及 CT 檢查，確定脛骨近端植入鈦釘位置是否正確。術后 2 d 行右后肢膝關節脛骨近端 Micro-CT 掃描及膝關節 X 線片檢查；術后 5 周處死小鼠前再次對脛骨近端行 Micro-CT 掃描，處死小鼠后離斷膝關節并攝 X 線片。比較各時間點影像學圖像，觀察植入的鈦釘位置是否變化；利用 Evaluation Program V6.5-1 軟件測量術后 5 周時脛骨近端骨密度值，以其與正常骨密度基線值的百分比作為最終骨密度值，進行統計分析。
1.3.3 生物力學試驗
影像學檢查后，刀片刮除兩組小鼠脛骨近端周圍軟組織，顯露脛骨平臺以及鈦釘尾帽，進行拔釘試驗。將標本脛骨遠端固定于盛有石膏粉的容器槽內，將鈦釘尾帽置于夾持刀片中間，連接固定架與微小力拉扭試驗機，使機器長軸與鈦釘長軸保持平行，以 1.0 mm/min 速度進行緩慢牽拉，直至鈦釘被拔除后停止。采用 WinTest?軟件測定鈦釘-骨界面最大剪切力。
1.3.4 組織學染色
生物力學試驗后收集脛骨近端周圍軟組織，依次脫鈣處理，制作石蠟切片，片厚 0.5 μm。常規 HE 染色，光鏡下觀察鈦釘周圍組織大體形態。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism5.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗組 2 只小鼠分別于術后 7、12 d 死亡，切口未見明顯感染跡象，術后活動量少、飲食情況不佳，考慮死亡可能與小鼠體質以及手術耐受性有關。剩余 22 只小鼠均存活至實驗完成。小鼠麻醉清醒后即開始患肢不負重爬行，飲食正常；2 d 后開始負重爬行；1 周后切口愈合，未出現感染征象；5 周時右后肢膝關節活動良好。
2.2 影像學檢查
X 線片及 CT 檢查顯示術后即刻兩組鈦釘均位于髓腔內，術后 2 d 與 5 周時鈦釘無明顯移位。Micro-CT 掃描顯示對照組脛骨近端髓腔內鈦釘固定良好，5 周時鈦釘周圍有新生骨痂；實驗組隨時間延長，鈦釘周圍存在明顯骨溶解現象。實驗組小鼠脛骨近端骨密度值為 91.25%±0.67%，對照組為 102.07%±1.87%，差異有統計學意義（t=5.462，P=0.041）。見圖 1～3。
圖1
兩組 X 線片檢查
從左至右分別為術后即刻、2 d 及 5 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure1. X-ray films of the two groupsFrom left to right for immediately, 2 days, and 5 weeks after operation a. Control group; b. Experimental group
圖2
兩組 Micro-CT 檢查
從左至右分別為術后即刻、2 d 及 5 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure2. Micro-CT examination of the two groupsFrom left to right for immediately, 2 days, and 5 weeks after operation a. Control group; b. Experimental group
圖3
兩組術后即刻 CT 檢查
從左至右分別為脛骨近端矢狀位、橫截面及三維重建圖像 a. 對照組；b. 實驗組
Figure3. CT of the two groups at immediate after operationFrom left to right for sagittal position, cross section, and three-dimensional reconstruction of proximal tibia a. Control group; b. Experimental group
2.3 生物力學試驗
實驗組鈦釘-骨界面最大剪切力為（5.93±0.85）N，明顯低于對照組的（16.76±3.09）N，差異有統計學意義（t=3.760，P=0.046）。
2.4 組織學觀察
對照組脛骨髓腔內鈦釘周圍有明顯骨組織生成，無明顯炎癥細胞浸潤。實驗組鈦釘周圍可見明顯炎癥反應膜形成，大量炎癥細胞浸潤。見圖 4。
圖4
兩組 HE 染色觀察（×100）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure4. HE staining of the two groups (×100)a. Control group; b. Experimental group
3 討論
人工關節假體無菌性松動的發生機制尚存爭議，目前大量研究表明該結果是由若干因素共同導致[13]，主要分為兩方面：一是機械性因素，主要體現在假體與骨組織的嵌合、固定裝置的質量以及肌肉的協調性與強度；二是生物性因素，關節微動摩擦產生的磨損顆粒與組織細胞反應所產生的一系列炎癥因子作用于骨細胞，使得假體周圍骨組織含量減少，最終導致假體松動[14-15]。研究表明，無菌性松動的病理學本質是假體周圍凈骨量的減少，其原因包括以下方面：① 破骨前體細胞大量浸入及破骨細胞的生成大量增加；② 破骨細胞的生命周期延長；③ 成骨前體細胞及成骨細胞數量減少，正常功能受到損傷；④ 成骨細胞生命周期縮短[16-17]。相關臨床研究表明，應力遮擋與假體松動也存在一定聯系，其導致假體周圍承受的負荷遠低于其他部位，更容易出現骨溶解現象[18]。武文等[19]認為假體-骨界面血供減少可能是假體無菌性松動的另一個重要原因。
相關基因學檢測提示小鼠基因序列與人類相似，且小鼠間個體差異較小，同時小鼠價格低廉，可以進行大樣本研究。基于以上優點，小鼠模型成為越來越多實驗研究的首選[20]。6～8 周齡小鼠身體各器官已發育成熟，因此本研究選擇了 8 周齡雄性 SCID 小鼠作為造模對象。隨著人工關節活動及其與體液的接觸，假體磨損不可避免會產生磨損顆粒。研究證明，人工關節假體的磨損程度與人體活動度以及假體與骨質界面的微動有關[21]。Ren 等[22]研究了巨噬細胞在磨損顆粒誘導的骨溶解中的作用，建立了巨噬細胞凋亡小鼠模型，但是該模型無假體植入，缺少機械性刺激。Warme 等[23]為研究假體無菌性松動的發生機制，將克氏針植入小鼠股骨并將金屬顆粒灌注于克氏針上。該實驗一定程度上模擬了承重條件下磨損顆粒誘導骨溶解的微環境，但是動物模型選取的實驗部位為股骨干，缺乏關節解剖模型，與臨床中人工關節置換術仍有一定差異。為此，本研究選擇在小鼠膝關節內植入鈦釘，盡可能模擬臨床中人工關節置換術的操作過程，手術完成后及術后 2 d 行影像學檢查，確保鈦釘位于脛骨髓腔內。此外，術后不限制小鼠膝關節活動，使得鈦釘與骨質充分接觸反應。
人體內假體無菌性松動的產生多為磨損顆粒對脛骨、股骨等長骨的長期作用所致，構建長期、有效的動物模型是研究假體松動的關鍵。但目前研究制備的多為急性骨溶解與骨重塑動物模型，無法有效模擬假體周圍慢性炎癥反應發生過程。Ma 等[24]發明了一種可以連續向小鼠股骨髓腔內輸送磨損顆粒的滲透泵，采用該項技術制備的動物模型可以用來研究磨損顆粒在體內的生物學變化。雖然該滲透泵制備的動物模型解決了既往模型主要為急性骨溶解的問題，然而在實驗中并未觀察到明確骨溶解現象。為此，我們將實驗周期設定為 5 周，小鼠在術后第 2 天便可部分負重爬行，至 2 周后活動已無障礙，但仍與臨床中假體佩戴周期有一定差異。
一系列研究表明，高濃度鈷鉻顆粒可激活不同細胞釋放 TNF-α、IL-1β，促進假體周圍破骨細胞生成、抑制 ALP 活性[25-27]。同時不同濃度鈷鉻顆粒也會對成骨前體細胞產生一定影響，我們前期體外實驗發現濃度為 50 mg/mL 的鈷鉻顆粒懸液毒性較其他濃度更大。因此，我們在植入鈦釘之前向實驗組小鼠脛骨髓腔內注入 10 μL 濃度 50 mg/mL 鈷鉻顆粒懸液。術后 5 周 Micro-CT 檢測提示實驗組小鼠膝關節假體周圍存在骨溶解現象；進一步行骨密度值測量提示，實驗組小鼠膝關節假體周圍骨密度遠低于對照組；生物力學測試顯示，實驗組鈦釘被拔出的最大剪切力明顯低于對照組。上述結果均提示與對照組相比，實驗組小鼠膝關節假體周圍存在明顯松動現象，進一步證實了骨溶解現象的存在。
磨損顆粒刺激假體周圍骨質產生一系列炎癥反應，在假體與骨組織之間形成一種膜性結構，稱為界膜。同時，磨損顆粒對巨噬細胞的毒性作用也可促進不同炎癥因子的釋放，分別作用于成骨、破骨細胞，破壞二者之間平衡，最終導致骨溶解[28]。病理學檢查可直觀發現假體周圍是否存在炎癥反應膜，有研究雖成功建立了負重膝關節假體動物模型，但這些動物模型實驗較為局限，僅進行了生物力學與機械學方面研究，缺乏組織學相關實驗，無法驗證假體周圍炎癥反應變化[29-30]。為此，我們對小鼠膝關節進行 HE 染色觀察，結果顯示實驗組小鼠鈦釘周圍可見明顯炎癥細胞浸潤，進一步證實了磨顆粒被假體周圍 BMSCs、巨噬細胞、成骨細胞、淋巴細胞、成纖維細胞等吞噬，釋放出 IL-1、IL-6、TNF-α 等細胞因子與炎癥介質這一機制[31]。
理想的人工關節假體無菌性松動動物模型應最大程度模仿臨床中假體松動過程，該過程包括生物力學、病理學、組織學等方面的變化，并非由單一因素構成。因此，在既往人工關節假體無菌性松動研究中采用的動物模型，均存在一定局限性。本研究構建的小鼠膝關節假體無菌性松動模型，分別從生物力學、組織學等方面進行了觀測，印證了鈷鉻顆粒在假體無菌性松動過程中的作用，提示該模型可以模擬各種磨損顆粒引發的假體無菌性松動發展過程。同時該模型還具備實驗成本低、可大樣本研究以及適合長期研究等優勢。其缺點是小鼠體質量、步態等與人類有較大差異，假體的設計及植入方法與臨床人工關節置換術不同。上述缺點使得該模型在研究機械應力對假體磨損及松動的影響方面存在一定缺陷。同時，小鼠骨骼過于細小，鈦釘植入操作較為精細，對研究者的外科操作技術要求較高，也是該模型制備方法不足之處。
作者貢獻：楊淑野、楊上游負責實驗設計及協助實驗開展；蔣昇源、李丹負責實驗實施及文章撰寫；姜建浩負責實驗數據收集整理及統計分析。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經濱州醫學院附屬醫院醫學科研倫理委員會批準（20190520-01）。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物倫理學標準，實驗動物生產許可證號：SCXK（魯）2014-0007，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）20180022。
