引用本文： 葛子路, 周兵華, 鄭小龍, 楊明宇, 呂晶同, 鄧泓鄗, 唐康來, 陳萬. 肩袖腱病環狀 RNA 表達特征與內源競爭 RNA 調控網絡構建的研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(5): 608-614. doi: 10.7507/1002-1892.201911094 復制
肩袖腱病是臨床常見的引起肩關節疼痛的骨骼肌肉系統疾病[1]，但發病機制尚不明確，通常認為是肩關節外在因素、環境因素及內在因素綜合作用導致[2-3]。盡管近年臨床對于肩袖腱病的認識有所提高，手術方式也不斷改良，但由于具體發生機制不明確，無法進行針對性治療，造成保守治療方式有限，且存在術后肩袖再斷裂率較高的問題[4]。
環狀 RNA（circular RNA，circRNA）通常是指一類具有共價閉合環狀結構，且沒有游離的 5’末端和 3’尾端的內源性非編碼 RNA[5]。近年來，越來越多疾病相關的 circRNA 表達譜被報道，通過生物信息學分析發現了許多與疾病發生、發展及轉歸相關的特異 circRNA[6-7]。circRNA 通常通過吸附在 miRNA 形成內源競爭 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制[8]，以調控軸的方式參與疾病發生、發展[9-10]。
已有研究表明，部分長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）參與肌腱的修復愈合[11]。然而，目前尚無針對肩袖腱病發病過程中 circRNA 表達情況的研究，circRNA 的 ceRNA 機制在肩袖腱病發生轉歸中的作用也有待探究。本研究采用高通量測序對正常肩袖及肩袖腱病組織進行研究，尋找差異表達的 circRNA，并對其靶基因進行預測，建立 circRNA 的 ceRNA 網絡，探索肩袖腱病發生的潛在分子機制，為臨床有效治療肩袖腱病提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 標本收集及選擇標準
肩袖組織樣本由 2018 年 6 月—2019 年 6 月于中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院骨科運動醫學中心因岡上肌腱損傷行手術治療的患者捐贈。排除合并高血壓、糖尿病等全身綜合性疾病患者，MRI 及關節鏡檢查提示肩袖斷緣鈣化者，局部存在感染者，以及其他不適合本研究條件患者。
本研究共納入 10 例患者，獲得正常及肩袖腱病組織各 5 個。其中男 2 例，女 8 例；年齡 44～71 歲，平均 55.4 歲。體質量指數 18.6～27.0 kg/m2，平均 23.6 kg/m2。病程 1～24 個月，平均 8.2 個月。Bonar 評分 1～10 分，平均 5.4 分。有肩關節外傷史 5 例。術中關節鏡下行岡上肌腱斷緣新鮮化時，用刨刀清除肩袖邊緣增生滑膜組織后，用籃鉗夾取兩塊 2 mm×2 mm 大小的肩袖組織，1 塊置于液氮中冷凍保存用于高通量測序，1 塊置于 4% 甲醛固定用于組織學觀察（HE、阿爾新藍染色）。通過 MRI、關節鏡檢查以及組織學觀察，確定肩袖為正常或腱病組織，再依據患者年齡、體質量以及 Bonar 評分[12]進行配伍分組。
1.2 主要試劑與儀器
RNeasy Mini Kit 試劑盒（Qiagen 公司，德國）；VAHTS Total RNA-seq（H/M/R）（南京諾唯贊生物科技有限公司）。光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Agilent2100 生物分析儀、IIIumina HiSeqTM2500 測序系統（Agilent Technologies 公司，美國）；Qubit?3.0 熒光計（Life Technologies 公司，美國）；NanoDrop One 分光光度計（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 測序文庫構建
① 總 RNA 提取及檢測：將肩袖組織剪碎后，按照 RNeasy Mini Kit 試劑盒說明書提取總 RNA，Agilent2100 生物分析儀進行質量檢測、Qubit?3.0 熒光計和 NanoDrop One 分光光度計對總 RNA 進行純度定量，評估 RNA 完整度后用于測序建庫。
② circRNA 建庫及測序：所有測序均按照南京諾唯贊生物科技有限公司提供的標準步驟執行。將 RNA 樣本與探針雜交，用 RNase H 和 DNaseⅠ酶分別消化 DNA-RNA 雜鏈中的 RNA 和單雙鏈的 DNA，純化后回收剩余 RNA。依次完成第 1 鏈 cDNA 合成、第 2 鏈合成和末端修復、3’端加堿基腺嘌呤和接頭連接以及尿嘧啶降解。最后進行 PCR 擴增建庫和測序分析。此部分委托上海鯨舟基因科技有限公司完成。
1.3.2 差異 circRNA 篩選
依據肩袖腱病與正常肩袖組織 circRNA 差異表達倍數（fold change，FC），將篩選標準定為 P<0.05、|log2FC|>2。使用 SPSS22.0 統計軟件采用獨立樣本 t 檢驗進行數據分析，篩選差異 circRNA；對表達上調及下調的差異 circRNA 進一步以 |log2FC| 降序排列。
1.3.3 生物信息學分析
對差異表達的 circRNA 親本基因進行基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。GO 分析主要包括生物學過程、細胞組分和分子功能 3 組分類，基于 GO 數據庫進行顯著性分析。KEGG 通路分析是依據 KEGG 數據庫對差異的親本基因進行通路顯著性分析。
circRNA 可以通過與 miRNA 的海綿吸附作用發揮調控功能。基于此，通過預測 miRNA 構建 ceRNA 網絡，探究潛在的核心 ceRNA。應用 TargetScan 和 miRanda 對差異表達 circRNA 進行 circRNA-miRNA 關系預測，用 Cytoscape 可視化構建 circRNA-miRNA-mRNA 作用網絡（ceRNA）。
2 結果
2.1 差異表達的 circRNA 聚類結果分析
肩袖腱病和正常肩袖組織中共檢測到 10 990 條 circRNA，其中差異表達 circRNA 94 條。肩袖腱病組織中共 31 條表達上調、63 條表達下調，表達上調的 circRNA 中，log2 FC 最高為 circRNA.3431；表達下調的 circRNA 中，log2 FC 最高為 circRNA.4724。進一步以 log2 FC 絕對值降序排列，上調及下調前 5 位的 circRNA 見表1 及圖1、2。
表1
正常肩袖及肩袖腱病組織表達差異排名前 5 位的 circRNA
Table1.
The top five significantly up- and down-regulated circRNAs in rotator cuff tendinopathy
圖1
正常肩袖及肩袖腱病組織差異表達 circRNA 熱圖
紅色表示上調，綠色表示下調 1～5：肩袖腱病樣本 6～10：正常肩袖樣本
Figure1. Cluster analysis of differentially expressed circRNAs in rotator cuff tendinopathy and normal tendonThe red for the up-regulated and the green for down-regulated differentially expressed circRNAs 1-5: Rotator cuff tendinopathy 6-10: Normal tendon
圖2
正常肩袖及肩袖腱病組織差異表達 circRNA 火山圖
Figure2.
Volcano plots of differentially expressed circRNAs in rotator cuff tendinopathy and normal tendon
2.2 GO 和 KEGG 分析
通過對 circRNA 的親本基因進行 GO 富集分析發現，與肩袖腱病相關的基因最顯著富集于環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）應答。通過 KEGG 通路分析發現，基因主要富集于細胞基質-受體交互、蛋白消化與吸收、細胞循環、B 細胞受體信號通路、FoxO 信號通路、NF-κB 信號通路和 T 細胞受體信號通路等。見圖3。
圖3
差異基因 GO 和 KEGG 分析
a. GO 富集；b. KEGG 富集
Figure3. GO and KEGG analysis of differentially expressed parental genesa. GO enrichment; b. KEGG enrichment
2.3 ceRNA 網絡分析
在構建的 ceRNA 網絡中（圖4），共有 28 個 circRNA、13 個 miRNA、46 個 mRNA，其中交聯最多的 circRNA、miRNA 以及 mRNA 分別是 circRNA.8442、has-miR-6089、GOLGA3。自由能最高的 ceRNA 調控軸為 circRNA.8951-has-miR-6089-DNMT3B。上述結果提示這些核心編碼與非編碼 RNA 可能在肩袖腱病發生過程中起著重要作用。
圖4
circRNA‐miRNA‐mRNA (ceRNA) 調節網絡
黃色線條表示上調，藍色線條表示下調
Figure4. circRNA‐miRNA‐mRNA (ceRNA) regulatory networkYellow line for upregulation and blue line for downregulation
3 討論
目前，對于肩袖腱病發病機制尚不清楚，可能與外在因素、內在因素均有關。其中外在因素包括肩袖過度使用、過度載荷以及與肩峰反復摩擦。但有組織學研究表明，肩袖腱病及斷裂通常發生于關節腔側而非滑囊側[13]。一項多中心研究發現，肩袖腱病患者經肩峰下減壓術治療后，療效無顯著改善[14]。上述研究結果提示，包括肩峰外撞擊理論在內的外在因素可能不是肩袖腱病發生發展的重要機制，內在因素可能更關鍵。因此，我們期望通過高通量測序和生物信息學分析，發現疾病發展過程中相對完整的小分子表達情況及其可能的相互作用關系，從而探究肩袖腱病潛在發病機制。
除了肩袖腱病的編碼 RNA 表達譜[15]，非編碼 RNA，如 lncRNA 和 miRNA 在肌腱病中的表達譜已有研究報道。Plachel 等[16]對退變肩袖 miRNA 表達譜分析，發現了 187 條差異表達的 miRNA，提示其中一些差異表達的 miRNA 可以作為疾病診斷以及預后判斷的標志物。Zhang 等[17]通過對 23 對不同部位肌腱病組織標本進行 lncRNA 表達譜分析，發現了 40 條差異表達的 lncRNA。以上研究提示非編碼 RNA 在肌腱病發生過程中可能發揮重要作用。circRNA 是一類新的具有調控功能的非編碼 RNA，我們希望通過分析肩袖腱病 circRNA 表達譜，為非編碼 RNA 在肌腱病發生中的作用提供補充，同時也為相關疾病的診治提供新思路。
本研究通過對 circRNA 的親本基因進行 GO 富集分析，發現與肩袖腱病相關的基因最顯著富集于 cAMP 應答。cAMP 作為細胞內的“第 2 信使”，通過調節下游靶分子廣泛參與細胞內物質代謝和生物功能調節[18]。Tucci 等[19]在一項針對手屈肌腱研究中發現，cAMP 表達增加抑制了肌腱對炎癥的免疫應答。在另一項關于骨骼肌的研究中，研究者們發現 cAMP 應答與骨骼肌的脂肪化相關[20]。而肌腱的成脂變化是肩袖腱病組織學特征之一，提示相關富集的 circRNA 可能在肌腱成脂機制中扮演了重要角色。
通過 KEGG 通路分析發現，基因主要富集于細胞基質-受體交互、蛋白消化與吸收、細胞循環、B 細胞信號通路、FoxO 信號通路、NF-κB 信號通路和 T 細胞信號通路等。關于 NF-κB 信號通路在肌腱病中的作用值得探討。NF-κB 信號通路主要包括了細胞質內一系列快反應蛋白家族復合體和這些蛋白的特異性二聚體抑制劑[21]。已有臨床研究證明，NF-κB 信號通路與肌腱病術后疼痛癥狀相關[22]。Abraham 等[23]的研究證實人和鼠的肩袖腱病組織中，NF-κB 信號通路表達增高，IKKβ 是這一通路里重要的支點，當過表達 IKKβ 時，鼠的肩袖纖維化程度加重，而抑制 IKKβ 后肩袖腱病損傷愈合加速。這一研究也進一步證實了 NF-κB 信號通路在肩袖腱病發生發展中的重要作用。此外，FoxO 信號通路在肌腱細胞相關的壓力應答中的表達變化也有文獻報道[24]。這些富集在相關通路中差異表達的 circRNA，為進一步闡述這些通路機制在肩袖腱病發病中的作用提供了一些新思路。盡管目前尚無關于肌腱和肌腱病的相關 ceRNA 作用研究，但部分 circRNA 在肌肉疾病發生發展中的作用已有報道。circLMO7 能通過吸附 miR-378a-3p 來調節成肌細胞的分化以及增殖[25]。另外，其他非編碼 RNA，如 lncRNA 在肌腱疾病的海綿吸附作用也有報道。lncH19 可以通過吸附 miR-29b-3p 來介導 TGF-β1 信號通路，從而加速肌腱分化以及愈合[26]。我們通過構建 circRNA 的 ceRNA 網絡，發現了幾個核心的 RNA 與相應的 ceRNA 調控軸。而自由能最高的 ceRNA 調控軸 circRNA.8951-has-miR-6089-DNMT3B 可能在肩袖腱病發生機制中扮演重要作用，但這一結果有待進一步驗證。
此外，炎癥在肩袖腱病的發生發展中扮演的角色一直沒有得到有效探究。肩袖腱病組織學研究表明，腱病組織膠原纖維厚薄不均、排列無序紊亂，周圍基質玻璃樣變形，纖維間脂肪細胞沉積，而經典的炎癥細胞缺乏光鏡下征象[27]。因此，傳統觀點認為炎癥和肩袖腱病發生無必然聯系。然而，隨著研究進展，這一觀點受到質疑。Dakin 等[28]研究發現跟腱腱病組織中存在大量 CD14+、CD68+細胞以及大量炎癥相關通路，如 NF-κB、干擾素、STAT-6 等。本研究中同樣發現了大量炎癥相關通路。通過 circRNA 的親本基因 KEGG 分析，發現基因富集于 NF-κB、T 細胞受體信號通路、B 細胞受體信號通路等相關的炎癥通路。這些結果提示炎癥可能在肩袖腱病發生發展中起著重要作用。而 circRNA 在相關疾病炎癥發生發展中的作用已有大量報道[29-30]。基于此，肩袖腱病中這些差異表達的 circRNA，可能在肩袖腱病炎癥發生發展過程中扮演著重要角色。
但是本研究仍存在許多不足。首先，由于倫理原因，無法獲得完全正常的對照標本。盡管所取標本經過組織學觀察驗證是相對正常標本，但由于來源于岡上肌腱損傷患者，故標本存在一定退變或病理性改變，這可能對最終測序結果造成一定影響。其次，盡管樣本依據患者年齡、體質量以及 Bonar 評分進行配伍，但仍然存在個體差異。最后，通過生物信息學分析獲得的 ceRNA 機制及其他相關差異基因，有待進一步在轉錄及蛋白水平驗證。
作者貢獻：葛子路負責撰寫文章初稿及數據分析；周兵華、鄭小龍、楊明宇負責患者招募及標本采集；呂晶同、鄧泓鄗負責組織學染色；唐康來、陳萬負責課題設計、實驗及文章審核。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究及文章撰寫過程中不存在任何利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和研究數據的統計分析。
機構倫理問題：研究方案經中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（KY201838）。患者均簽署知情同意書。
肩袖腱病是臨床常見的引起肩關節疼痛的骨骼肌肉系統疾病[1]，但發病機制尚不明確，通常認為是肩關節外在因素、環境因素及內在因素綜合作用導致[2-3]。盡管近年臨床對于肩袖腱病的認識有所提高，手術方式也不斷改良，但由于具體發生機制不明確，無法進行針對性治療，造成保守治療方式有限，且存在術后肩袖再斷裂率較高的問題[4]。
環狀 RNA（circular RNA，circRNA）通常是指一類具有共價閉合環狀結構，且沒有游離的 5’末端和 3’尾端的內源性非編碼 RNA[5]。近年來，越來越多疾病相關的 circRNA 表達譜被報道，通過生物信息學分析發現了許多與疾病發生、發展及轉歸相關的特異 circRNA[6-7]。circRNA 通常通過吸附在 miRNA 形成內源競爭 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制[8]，以調控軸的方式參與疾病發生、發展[9-10]。
已有研究表明，部分長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）參與肌腱的修復愈合[11]。然而，目前尚無針對肩袖腱病發病過程中 circRNA 表達情況的研究，circRNA 的 ceRNA 機制在肩袖腱病發生轉歸中的作用也有待探究。本研究采用高通量測序對正常肩袖及肩袖腱病組織進行研究，尋找差異表達的 circRNA，并對其靶基因進行預測，建立 circRNA 的 ceRNA 網絡，探索肩袖腱病發生的潛在分子機制，為臨床有效治療肩袖腱病提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 標本收集及選擇標準
肩袖組織樣本由 2018 年 6 月—2019 年 6 月于中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院骨科運動醫學中心因岡上肌腱損傷行手術治療的患者捐贈。排除合并高血壓、糖尿病等全身綜合性疾病患者，MRI 及關節鏡檢查提示肩袖斷緣鈣化者，局部存在感染者，以及其他不適合本研究條件患者。
本研究共納入 10 例患者，獲得正常及肩袖腱病組織各 5 個。其中男 2 例，女 8 例；年齡 44～71 歲，平均 55.4 歲。體質量指數 18.6～27.0 kg/m2，平均 23.6 kg/m2。病程 1～24 個月，平均 8.2 個月。Bonar 評分 1～10 分，平均 5.4 分。有肩關節外傷史 5 例。術中關節鏡下行岡上肌腱斷緣新鮮化時，用刨刀清除肩袖邊緣增生滑膜組織后，用籃鉗夾取兩塊 2 mm×2 mm 大小的肩袖組織，1 塊置于液氮中冷凍保存用于高通量測序，1 塊置于 4% 甲醛固定用于組織學觀察（HE、阿爾新藍染色）。通過 MRI、關節鏡檢查以及組織學觀察，確定肩袖為正常或腱病組織，再依據患者年齡、體質量以及 Bonar 評分[12]進行配伍分組。
1.2 主要試劑與儀器
RNeasy Mini Kit 試劑盒（Qiagen 公司，德國）；VAHTS Total RNA-seq（H/M/R）（南京諾唯贊生物科技有限公司）。光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Agilent2100 生物分析儀、IIIumina HiSeqTM2500 測序系統（Agilent Technologies 公司，美國）；Qubit?3.0 熒光計（Life Technologies 公司，美國）；NanoDrop One 分光光度計（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 測序文庫構建
① 總 RNA 提取及檢測：將肩袖組織剪碎后，按照 RNeasy Mini Kit 試劑盒說明書提取總 RNA，Agilent2100 生物分析儀進行質量檢測、Qubit?3.0 熒光計和 NanoDrop One 分光光度計對總 RNA 進行純度定量，評估 RNA 完整度后用于測序建庫。
② circRNA 建庫及測序：所有測序均按照南京諾唯贊生物科技有限公司提供的標準步驟執行。將 RNA 樣本與探針雜交，用 RNase H 和 DNaseⅠ酶分別消化 DNA-RNA 雜鏈中的 RNA 和單雙鏈的 DNA，純化后回收剩余 RNA。依次完成第 1 鏈 cDNA 合成、第 2 鏈合成和末端修復、3’端加堿基腺嘌呤和接頭連接以及尿嘧啶降解。最后進行 PCR 擴增建庫和測序分析。此部分委托上海鯨舟基因科技有限公司完成。
1.3.2 差異 circRNA 篩選
依據肩袖腱病與正常肩袖組織 circRNA 差異表達倍數（fold change，FC），將篩選標準定為 P<0.05、|log2FC|>2。使用 SPSS22.0 統計軟件采用獨立樣本 t 檢驗進行數據分析，篩選差異 circRNA；對表達上調及下調的差異 circRNA 進一步以 |log2FC| 降序排列。
1.3.3 生物信息學分析
對差異表達的 circRNA 親本基因進行基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。GO 分析主要包括生物學過程、細胞組分和分子功能 3 組分類，基于 GO 數據庫進行顯著性分析。KEGG 通路分析是依據 KEGG 數據庫對差異的親本基因進行通路顯著性分析。
circRNA 可以通過與 miRNA 的海綿吸附作用發揮調控功能。基于此，通過預測 miRNA 構建 ceRNA 網絡，探究潛在的核心 ceRNA。應用 TargetScan 和 miRanda 對差異表達 circRNA 進行 circRNA-miRNA 關系預測，用 Cytoscape 可視化構建 circRNA-miRNA-mRNA 作用網絡（ceRNA）。
2 結果
2.1 差異表達的 circRNA 聚類結果分析
肩袖腱病和正常肩袖組織中共檢測到 10 990 條 circRNA，其中差異表達 circRNA 94 條。肩袖腱病組織中共 31 條表達上調、63 條表達下調，表達上調的 circRNA 中，log2 FC 最高為 circRNA.3431；表達下調的 circRNA 中，log2 FC 最高為 circRNA.4724。進一步以 log2 FC 絕對值降序排列，上調及下調前 5 位的 circRNA 見表1 及圖1、2。
表1
正常肩袖及肩袖腱病組織表達差異排名前 5 位的 circRNA
Table1.
The top five significantly up- and down-regulated circRNAs in rotator cuff tendinopathy
圖1
正常肩袖及肩袖腱病組織差異表達 circRNA 熱圖
紅色表示上調，綠色表示下調 1～5：肩袖腱病樣本 6～10：正常肩袖樣本
Figure1. Cluster analysis of differentially expressed circRNAs in rotator cuff tendinopathy and normal tendonThe red for the up-regulated and the green for down-regulated differentially expressed circRNAs 1-5: Rotator cuff tendinopathy 6-10: Normal tendon
圖2
正常肩袖及肩袖腱病組織差異表達 circRNA 火山圖
Figure2.
Volcano plots of differentially expressed circRNAs in rotator cuff tendinopathy and normal tendon
2.2 GO 和 KEGG 分析
通過對 circRNA 的親本基因進行 GO 富集分析發現，與肩袖腱病相關的基因最顯著富集于環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）應答。通過 KEGG 通路分析發現，基因主要富集于細胞基質-受體交互、蛋白消化與吸收、細胞循環、B 細胞受體信號通路、FoxO 信號通路、NF-κB 信號通路和 T 細胞受體信號通路等。見圖3。
圖3
差異基因 GO 和 KEGG 分析
a. GO 富集；b. KEGG 富集
Figure3. GO and KEGG analysis of differentially expressed parental genesa. GO enrichment; b. KEGG enrichment
2.3 ceRNA 網絡分析
在構建的 ceRNA 網絡中（圖4），共有 28 個 circRNA、13 個 miRNA、46 個 mRNA，其中交聯最多的 circRNA、miRNA 以及 mRNA 分別是 circRNA.8442、has-miR-6089、GOLGA3。自由能最高的 ceRNA 調控軸為 circRNA.8951-has-miR-6089-DNMT3B。上述結果提示這些核心編碼與非編碼 RNA 可能在肩袖腱病發生過程中起著重要作用。
圖4
circRNA‐miRNA‐mRNA (ceRNA) 調節網絡
黃色線條表示上調，藍色線條表示下調
Figure4. circRNA‐miRNA‐mRNA (ceRNA) regulatory networkYellow line for upregulation and blue line for downregulation
3 討論
目前，對于肩袖腱病發病機制尚不清楚，可能與外在因素、內在因素均有關。其中外在因素包括肩袖過度使用、過度載荷以及與肩峰反復摩擦。但有組織學研究表明，肩袖腱病及斷裂通常發生于關節腔側而非滑囊側[13]。一項多中心研究發現，肩袖腱病患者經肩峰下減壓術治療后，療效無顯著改善[14]。上述研究結果提示，包括肩峰外撞擊理論在內的外在因素可能不是肩袖腱病發生發展的重要機制，內在因素可能更關鍵。因此，我們期望通過高通量測序和生物信息學分析，發現疾病發展過程中相對完整的小分子表達情況及其可能的相互作用關系，從而探究肩袖腱病潛在發病機制。
除了肩袖腱病的編碼 RNA 表達譜[15]，非編碼 RNA，如 lncRNA 和 miRNA 在肌腱病中的表達譜已有研究報道。Plachel 等[16]對退變肩袖 miRNA 表達譜分析，發現了 187 條差異表達的 miRNA，提示其中一些差異表達的 miRNA 可以作為疾病診斷以及預后判斷的標志物。Zhang 等[17]通過對 23 對不同部位肌腱病組織標本進行 lncRNA 表達譜分析，發現了 40 條差異表達的 lncRNA。以上研究提示非編碼 RNA 在肌腱病發生過程中可能發揮重要作用。circRNA 是一類新的具有調控功能的非編碼 RNA，我們希望通過分析肩袖腱病 circRNA 表達譜，為非編碼 RNA 在肌腱病發生中的作用提供補充，同時也為相關疾病的診治提供新思路。
本研究通過對 circRNA 的親本基因進行 GO 富集分析，發現與肩袖腱病相關的基因最顯著富集于 cAMP 應答。cAMP 作為細胞內的“第 2 信使”，通過調節下游靶分子廣泛參與細胞內物質代謝和生物功能調節[18]。Tucci 等[19]在一項針對手屈肌腱研究中發現，cAMP 表達增加抑制了肌腱對炎癥的免疫應答。在另一項關于骨骼肌的研究中，研究者們發現 cAMP 應答與骨骼肌的脂肪化相關[20]。而肌腱的成脂變化是肩袖腱病組織學特征之一，提示相關富集的 circRNA 可能在肌腱成脂機制中扮演了重要角色。
通過 KEGG 通路分析發現，基因主要富集于細胞基質-受體交互、蛋白消化與吸收、細胞循環、B 細胞信號通路、FoxO 信號通路、NF-κB 信號通路和 T 細胞信號通路等。關于 NF-κB 信號通路在肌腱病中的作用值得探討。NF-κB 信號通路主要包括了細胞質內一系列快反應蛋白家族復合體和這些蛋白的特異性二聚體抑制劑[21]。已有臨床研究證明，NF-κB 信號通路與肌腱病術后疼痛癥狀相關[22]。Abraham 等[23]的研究證實人和鼠的肩袖腱病組織中，NF-κB 信號通路表達增高，IKKβ 是這一通路里重要的支點，當過表達 IKKβ 時，鼠的肩袖纖維化程度加重，而抑制 IKKβ 后肩袖腱病損傷愈合加速。這一研究也進一步證實了 NF-κB 信號通路在肩袖腱病發生發展中的重要作用。此外，FoxO 信號通路在肌腱細胞相關的壓力應答中的表達變化也有文獻報道[24]。這些富集在相關通路中差異表達的 circRNA，為進一步闡述這些通路機制在肩袖腱病發病中的作用提供了一些新思路。盡管目前尚無關于肌腱和肌腱病的相關 ceRNA 作用研究，但部分 circRNA 在肌肉疾病發生發展中的作用已有報道。circLMO7 能通過吸附 miR-378a-3p 來調節成肌細胞的分化以及增殖[25]。另外，其他非編碼 RNA，如 lncRNA 在肌腱疾病的海綿吸附作用也有報道。lncH19 可以通過吸附 miR-29b-3p 來介導 TGF-β1 信號通路，從而加速肌腱分化以及愈合[26]。我們通過構建 circRNA 的 ceRNA 網絡，發現了幾個核心的 RNA 與相應的 ceRNA 調控軸。而自由能最高的 ceRNA 調控軸 circRNA.8951-has-miR-6089-DNMT3B 可能在肩袖腱病發生機制中扮演重要作用，但這一結果有待進一步驗證。
此外，炎癥在肩袖腱病的發生發展中扮演的角色一直沒有得到有效探究。肩袖腱病組織學研究表明，腱病組織膠原纖維厚薄不均、排列無序紊亂，周圍基質玻璃樣變形，纖維間脂肪細胞沉積，而經典的炎癥細胞缺乏光鏡下征象[27]。因此，傳統觀點認為炎癥和肩袖腱病發生無必然聯系。然而，隨著研究進展，這一觀點受到質疑。Dakin 等[28]研究發現跟腱腱病組織中存在大量 CD14+、CD68+細胞以及大量炎癥相關通路，如 NF-κB、干擾素、STAT-6 等。本研究中同樣發現了大量炎癥相關通路。通過 circRNA 的親本基因 KEGG 分析，發現基因富集于 NF-κB、T 細胞受體信號通路、B 細胞受體信號通路等相關的炎癥通路。這些結果提示炎癥可能在肩袖腱病發生發展中起著重要作用。而 circRNA 在相關疾病炎癥發生發展中的作用已有大量報道[29-30]。基于此，肩袖腱病中這些差異表達的 circRNA，可能在肩袖腱病炎癥發生發展過程中扮演著重要角色。
但是本研究仍存在許多不足。首先，由于倫理原因，無法獲得完全正常的對照標本。盡管所取標本經過組織學觀察驗證是相對正常標本，但由于來源于岡上肌腱損傷患者，故標本存在一定退變或病理性改變，這可能對最終測序結果造成一定影響。其次，盡管樣本依據患者年齡、體質量以及 Bonar 評分進行配伍，但仍然存在個體差異。最后，通過生物信息學分析獲得的 ceRNA 機制及其他相關差異基因，有待進一步在轉錄及蛋白水平驗證。
作者貢獻：葛子路負責撰寫文章初稿及數據分析；周兵華、鄭小龍、楊明宇負責患者招募及標本采集；呂晶同、鄧泓鄗負責組織學染色；唐康來、陳萬負責課題設計、實驗及文章審核。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究及文章撰寫過程中不存在任何利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和研究數據的統計分析。
機構倫理問題：研究方案經中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（KY201838）。患者均簽署知情同意書。
