引用本文： 嚴玉勇, 潘新元, 林博杰, 林冠宇, 殷國前. 天然水蛭素對大鼠缺血皮瓣血管生成作用的 Micro-CT 觀察. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(3): 382-386. doi: 10.7507/1002-1892.201907030 復制
創面修復是外科醫生經常面臨的挑戰[1]，修復方法包括直接拉攏縫合、游離植皮、局部任意皮瓣、游離皮瓣移植、皮膚擴張器修復等[2]。局部任意皮瓣由于取材方便、顏色與創面周圍更匹配、并發癥較少，因而在創面修復中占據重要地位[3-4]。由于任意皮瓣不含知名動、靜脈，僅有真皮層及真皮下層血管網，術后早期皮瓣血供主要來自蒂部，因缺血再灌注損傷、血管栓塞等原因，血流沿皮瓣向遠端逐漸減少，所以皮瓣易發生缺血壞死，尤其是遠端部分[5-8]，因而早期微循環的建立尤為重要。既往研究已證實，天然水蛭素是高效的凝血酶拮抗劑，通過對血管生成或抑制因子的調控，抑制炎癥反應同時促進皮瓣組織毛細血管再生[9-12]，從而提高皮瓣成活面積。但這些實驗均是從微觀角度間接證明水蛭素對皮瓣微循環建立的促進作用，未能直觀揭示皮瓣血管再生的整體情況。Micro-CT 又稱顯微 CT、微焦點 CT[13]，是利用微聚焦 X 射線源和光學顯微鏡技術，分辨率高達微米級[14]，結合血管灌注技術及三維成像技術可以清晰顯示標本血管的三維影像，還可通過機器自帶的分析軟件將血管再生情況進行量化。因此，本研究利用 Micro-CT 及三維重建技術分析皮瓣術后血管再生情況，旨在直觀揭示天然水蛭素在促進皮瓣術后微循環建立中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年 SD 大鼠 32 只，雌雄不限，體質量（300±10）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。
天然水蛭素凍干粉（專利號：ZL03113566.8，編號：KK-001；南寧凈雪皇生物工程有限公司）；肝素鈉注射液（2 mL∶12 500 U；上海上藥第一生化藥業有限公司）；4% 組織細胞固定液（北京索萊寶科技有限公司）；明膠（Sigma 公司，美國）；紅色氧化鉛（天津大茂化學試劑廠）。BRUKER SkyScan 1176 小動物活體 Micro-CT 成像系統（Bruker 公司，德國）；Image Pro-Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 大鼠缺血皮瓣模型制備及分組
取 32 只 SD 大鼠，經腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，在其背部設計一8.0 cm×1.8 cm 大小的超長隨意皮瓣模擬缺血皮瓣[15]。無菌條件下，按設計線切開皮膚至深筋膜層，分離并掀起皮瓣，如有軸型血管將其切斷并結扎，保證皮瓣不攜帶軸型血管，徹底止血后皮瓣原位縫合，所有手術操作均由同一人完成。將造模后大鼠按先后順序編號，采用隨機數字表法隨機分為水蛭素組和對照組，每組 16 只。水蛭素組術后即刻及之后 3 d 內每天同一時間，于皮瓣中央距蒂部 2、4、6 cm 處皮下注射天然水蛭素，每處各 1 個點，每個點注射 0.1 mL，3 個點共注射天然水蛭素 6 ATU；對照組同法注射等量生理鹽水。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
造模術后 6 d，觀察兩組大鼠皮瓣顏色，有無水腫、滲出、破潰以及皮瓣成活情況。每組隨機取 8 只大鼠同上法麻醉后，數碼相機攝背部皮瓣照片，采用 Image Pro-Plus 6.0 軟件計算皮瓣成活率，公式為：皮瓣成活面積/皮瓣總面積×100%。
1.3.2 組織學觀察
造模術后 6 d，兩組取上述拍攝背部皮瓣照片后的大鼠，切取皮瓣中間處組織，置于 10% 甲醛固定 24 h，脫水、包埋、切片，片厚 3 μm，取部分切片行 HE 染色，光鏡下觀察皮瓣組織中微血管結構、炎性細胞數量及壞死情況。
1.3.3 Micro-CT 檢測
造模術后 6 d，兩組分別取剩余 8 只大鼠行心臟-主動脈穿刺術，之后依次用 10 U/mL 肝素鈉注射液[16]200 mL、4% 多聚甲醛溶液 100 mL 及 5% 明膠氧化鉛混合液 20 mL 灌注全身血管，灌注速度為 1 mL/s；以上液體均水浴加熱并保持在 40℃，灌注完成后沖洗皮瓣周圍造影劑，4℃ 冷藏 24 h。24 h 后切取皮瓣及其周圍 1 cm 組織行 Micro-CT 三維重建，然后僅保留皮瓣組織再次行 Micro-CT 三維重建。Micro-CT 主要參數設置如下：電壓 50 kV，電流 500 μA，曝光時間 880 ms，過濾片為 0.5 mm，圖像像素為 8.75 μm。將原始數據重建后導入機器自帶分析軟件 CTAn 中，計算血管容積、長度及數量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后兩組大鼠均存活至實驗完成，無感染發生。術后 6 d，兩組皮瓣遠端均出現壞死，呈灰黑色，組織質地變硬，部分皺縮，皮瓣出現明顯壞死分界，對照組皮瓣壞死面積更大。見圖 1。水蛭素組皮瓣成活率為 72.11%±8.97%，顯著高于對照組的 58.94%±4.02%，組間比較差異有統計學意義（t=3.280，P=0.008）。
圖1
術后 6 d 兩組皮瓣大體觀察
a. 水蛭素組；b. 對照組
Figure1. General observation of skin flap in each group at 6 days after operationa. Hirudin group; b. Control group
2.2 組織學觀察
術后 6 d HE 染色示，水蛭素組和對照組均可見炎癥細胞浸潤，對照組部分細胞出現核皺縮和碎裂；水蛭素組炎癥細胞浸潤較輕，組織層次結構更清楚，且有較多微血管形成。見圖 2。
圖2
術后 6 d 兩組 HE 染色觀察
從左至右分別為×50、×100 a. 水蛭素組；b. 對照組
Figure2. HE staining observation of each group at 6 days after operationFrom left to right for ×50 and ×100, respectively a. Hirudin group; b. Control group
2.3 Micro-CT 檢測
術后 6 d，皮瓣及其周圍 1 cm 組織 Micro-CT 三維重建顯示，兩組皮瓣血管和周圍組織血管均有部分連接，越靠近皮瓣蒂部連接越緊密，其中水蛭素組較對照組連接密度更大，切緣處形成了與四周組織血管方向大體一致的新生血管。僅保留皮瓣組織 Micro-CT 三維重建顯示，水蛭素組皮瓣遠端有較多新生血管形成，血管的分布密度及連續性均優于對照組。見圖 3。水蛭素組血管容積、血管長度及血管數量均顯著大于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
兩組 Micro-CT 檢測指標比較（n=8，
）
Table1.
Comparison of Micro-CT indexes between two groups (n=8, 
)
圖3
兩組 Micro-CT 三維重建
從左至右分別為對照組和水蛭素組 a. 皮瓣及周圍組織；b. 皮瓣組織
Figure3. Micro-CT 3D reconstruction of the two groupsFrom left to right for control group and hirudin group, respectively a. Skin flap and the tissue around the skin flap; b. Skin flap
3 討論
任意皮瓣具有取材豐富、操作簡便等諸多優點，在整形外科應用廣泛。當皮瓣長寬比超過 2∶1 時，皮瓣遠端容易發生缺血壞死[17-18]。本研究采用了長寬比超過 4∶1 的超長任意皮瓣構建缺血皮瓣模型，通過水蛭素藥物干預，以期進一步了解天然水蛭素對皮瓣成活的影響；同時明膠氧化鉛灌注結合 Micro-CT 和三維重建技術，可在不破壞標本情況下直觀顯示皮瓣內部整體血管網結構，并進行相關血管參數計算[19]，為后期臨床應用提供實驗依據及參考。
皮瓣移植后，切口及周邊組織會合成并釋放大量凝血酶，并通過凝血酶受體誘導一系列病理生理反應，最終抑制血管生成[20]。天然水蛭素作為凝血酶的特異性拮抗劑，通過拮抗凝血酶的相關信號通路，對血管生成因子（如 VEGF）與抗血管生成因子（如血小板反應蛋白 1、內皮抑素）進行調節，進而促進皮瓣血管再生[21]。本研究中，水蛭素組術后皮瓣成活率及血管長度、容積和數量均顯著大于對照組，與既往研究結果一致[9-10, 12]，說明天然水蛭素在改善皮瓣成活及促進血管再生方面效果顯著。
皮瓣遠端壞死常見原因有循環血供來源改變、血供不足導致的灌注壓顯著下降、炎癥反應和氧化應激導致的微循環內血流淤滯、微血栓形成等[22-25]；而皮瓣成活有賴于血供及時恢復和重建以及皮瓣遠端組織有效血液灌注[26]。有研究證實，任意皮瓣術后成活除通過蒂部供血外，還必須通過暴露的真皮下血管網及四周創緣吸取營養[27-28]。我們發現術后 6 d 皮瓣除最遠端均有血管與周圍組織血管連通外，還表現為皮瓣血管與周圍組織血管走行一致，并跨過切緣，說明此處已有新生血管形成，或是原有閉塞的管腔被打通；同時水蛭素組和對照組均有連續性血管跨過切緣，這些血管走行方向與皮瓣周圍血管方向大體一致。由于各種調節因子都需依賴功能性的血管網絡運輸到相關目的地才能最終發揮作用[29]，所以我們分析這種大體一致的方向性，可能與切緣兩側各種調節因子隨血液循環能到達的最遠處距離及血流方向有關。
皮瓣及其周圍 1 cm 組織 Micro-CT 檢測三維重建顯示，水蛭素組形成的連通血管較對照組更多，說明天然水蛭素在皮瓣與周圍組織的血管再通或血管再生中起關鍵作用。同時，水蛭素組不僅皮瓣組織血管較對照組多，皮瓣周圍組織的血管也較對照組更密集，提示天然水蛭素不僅能促進局部血管再生，也能在一定程度上促進損傷部位周圍（切緣兩側）組織血管再生。這可能是由于其抗凝水平的發揮依賴于血液循環及損傷部位[29]，但這一結論還需要進一步實驗驗證。由于天然水蛭素局部皮下注射生物利用度高[30]，本研究結論對后期缺血組織的臨床處理具有一定指導意義。但本研究對灌注和取材的操作要求較高，若操作不熟練，會影響實驗結果的可靠性。
綜上述，局部皮下注射天然水蛭素能夠減輕組織炎癥，通過增加新生血管形成或促進閉塞血管再通，改善缺血區血供，從而提高皮瓣成活率。
作者貢獻：嚴玉勇直接參與實驗設計、實施及文章起草；潘新元參與實驗設計與統計分析；林博杰參與實驗設計；林冠宇參與數據收集整理；殷國前對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：動物實驗均經廣西醫科大學（廣西實驗動物中心）實驗動物倫理委員會批準（201803051），實驗動物使用許可證批準號：SYXK桂2014-0003。
創面修復是外科醫生經常面臨的挑戰[1]，修復方法包括直接拉攏縫合、游離植皮、局部任意皮瓣、游離皮瓣移植、皮膚擴張器修復等[2]。局部任意皮瓣由于取材方便、顏色與創面周圍更匹配、并發癥較少，因而在創面修復中占據重要地位[3-4]。由于任意皮瓣不含知名動、靜脈，僅有真皮層及真皮下層血管網，術后早期皮瓣血供主要來自蒂部，因缺血再灌注損傷、血管栓塞等原因，血流沿皮瓣向遠端逐漸減少，所以皮瓣易發生缺血壞死，尤其是遠端部分[5-8]，因而早期微循環的建立尤為重要。既往研究已證實，天然水蛭素是高效的凝血酶拮抗劑，通過對血管生成或抑制因子的調控，抑制炎癥反應同時促進皮瓣組織毛細血管再生[9-12]，從而提高皮瓣成活面積。但這些實驗均是從微觀角度間接證明水蛭素對皮瓣微循環建立的促進作用，未能直觀揭示皮瓣血管再生的整體情況。Micro-CT 又稱顯微 CT、微焦點 CT[13]，是利用微聚焦 X 射線源和光學顯微鏡技術，分辨率高達微米級[14]，結合血管灌注技術及三維成像技術可以清晰顯示標本血管的三維影像，還可通過機器自帶的分析軟件將血管再生情況進行量化。因此，本研究利用 Micro-CT 及三維重建技術分析皮瓣術后血管再生情況，旨在直觀揭示天然水蛭素在促進皮瓣術后微循環建立中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年 SD 大鼠 32 只，雌雄不限，體質量（300±10）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。
天然水蛭素凍干粉（專利號：ZL03113566.8，編號：KK-001；南寧凈雪皇生物工程有限公司）；肝素鈉注射液（2 mL∶12 500 U；上海上藥第一生化藥業有限公司）；4% 組織細胞固定液（北京索萊寶科技有限公司）；明膠（Sigma 公司，美國）；紅色氧化鉛（天津大茂化學試劑廠）。BRUKER SkyScan 1176 小動物活體 Micro-CT 成像系統（Bruker 公司，德國）；Image Pro-Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 大鼠缺血皮瓣模型制備及分組
取 32 只 SD 大鼠，經腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，在其背部設計一8.0 cm×1.8 cm 大小的超長隨意皮瓣模擬缺血皮瓣[15]。無菌條件下，按設計線切開皮膚至深筋膜層，分離并掀起皮瓣，如有軸型血管將其切斷并結扎，保證皮瓣不攜帶軸型血管，徹底止血后皮瓣原位縫合，所有手術操作均由同一人完成。將造模后大鼠按先后順序編號，采用隨機數字表法隨機分為水蛭素組和對照組，每組 16 只。水蛭素組術后即刻及之后 3 d 內每天同一時間，于皮瓣中央距蒂部 2、4、6 cm 處皮下注射天然水蛭素，每處各 1 個點，每個點注射 0.1 mL，3 個點共注射天然水蛭素 6 ATU；對照組同法注射等量生理鹽水。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
造模術后 6 d，觀察兩組大鼠皮瓣顏色，有無水腫、滲出、破潰以及皮瓣成活情況。每組隨機取 8 只大鼠同上法麻醉后，數碼相機攝背部皮瓣照片，采用 Image Pro-Plus 6.0 軟件計算皮瓣成活率，公式為：皮瓣成活面積/皮瓣總面積×100%。
1.3.2 組織學觀察
造模術后 6 d，兩組取上述拍攝背部皮瓣照片后的大鼠，切取皮瓣中間處組織，置于 10% 甲醛固定 24 h，脫水、包埋、切片，片厚 3 μm，取部分切片行 HE 染色，光鏡下觀察皮瓣組織中微血管結構、炎性細胞數量及壞死情況。
1.3.3 Micro-CT 檢測
造模術后 6 d，兩組分別取剩余 8 只大鼠行心臟-主動脈穿刺術，之后依次用 10 U/mL 肝素鈉注射液[16]200 mL、4% 多聚甲醛溶液 100 mL 及 5% 明膠氧化鉛混合液 20 mL 灌注全身血管，灌注速度為 1 mL/s；以上液體均水浴加熱并保持在 40℃，灌注完成后沖洗皮瓣周圍造影劑，4℃ 冷藏 24 h。24 h 后切取皮瓣及其周圍 1 cm 組織行 Micro-CT 三維重建，然后僅保留皮瓣組織再次行 Micro-CT 三維重建。Micro-CT 主要參數設置如下：電壓 50 kV，電流 500 μA，曝光時間 880 ms，過濾片為 0.5 mm，圖像像素為 8.75 μm。將原始數據重建后導入機器自帶分析軟件 CTAn 中，計算血管容積、長度及數量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后兩組大鼠均存活至實驗完成，無感染發生。術后 6 d，兩組皮瓣遠端均出現壞死，呈灰黑色，組織質地變硬，部分皺縮，皮瓣出現明顯壞死分界，對照組皮瓣壞死面積更大。見圖 1。水蛭素組皮瓣成活率為 72.11%±8.97%，顯著高于對照組的 58.94%±4.02%，組間比較差異有統計學意義（t=3.280，P=0.008）。
圖1
術后 6 d 兩組皮瓣大體觀察
a. 水蛭素組；b. 對照組
Figure1. General observation of skin flap in each group at 6 days after operationa. Hirudin group; b. Control group
2.2 組織學觀察
術后 6 d HE 染色示，水蛭素組和對照組均可見炎癥細胞浸潤，對照組部分細胞出現核皺縮和碎裂；水蛭素組炎癥細胞浸潤較輕，組織層次結構更清楚，且有較多微血管形成。見圖 2。
圖2
術后 6 d 兩組 HE 染色觀察
從左至右分別為×50、×100 a. 水蛭素組；b. 對照組
Figure2. HE staining observation of each group at 6 days after operationFrom left to right for ×50 and ×100, respectively a. Hirudin group; b. Control group
2.3 Micro-CT 檢測
術后 6 d，皮瓣及其周圍 1 cm 組織 Micro-CT 三維重建顯示，兩組皮瓣血管和周圍組織血管均有部分連接，越靠近皮瓣蒂部連接越緊密，其中水蛭素組較對照組連接密度更大，切緣處形成了與四周組織血管方向大體一致的新生血管。僅保留皮瓣組織 Micro-CT 三維重建顯示，水蛭素組皮瓣遠端有較多新生血管形成，血管的分布密度及連續性均優于對照組。見圖 3。水蛭素組血管容積、血管長度及血管數量均顯著大于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
兩組 Micro-CT 檢測指標比較（n=8，）
Table1.
Comparison of Micro-CT indexes between two groups (n=8, )
圖3
兩組 Micro-CT 三維重建
從左至右分別為對照組和水蛭素組 a. 皮瓣及周圍組織；b. 皮瓣組織
Figure3. Micro-CT 3D reconstruction of the two groupsFrom left to right for control group and hirudin group, respectively a. Skin flap and the tissue around the skin flap; b. Skin flap
3 討論
任意皮瓣具有取材豐富、操作簡便等諸多優點，在整形外科應用廣泛。當皮瓣長寬比超過 2∶1 時，皮瓣遠端容易發生缺血壞死[17-18]。本研究采用了長寬比超過 4∶1 的超長任意皮瓣構建缺血皮瓣模型，通過水蛭素藥物干預，以期進一步了解天然水蛭素對皮瓣成活的影響；同時明膠氧化鉛灌注結合 Micro-CT 和三維重建技術，可在不破壞標本情況下直觀顯示皮瓣內部整體血管網結構，并進行相關血管參數計算[19]，為后期臨床應用提供實驗依據及參考。
皮瓣移植后，切口及周邊組織會合成并釋放大量凝血酶，并通過凝血酶受體誘導一系列病理生理反應，最終抑制血管生成[20]。天然水蛭素作為凝血酶的特異性拮抗劑，通過拮抗凝血酶的相關信號通路，對血管生成因子（如 VEGF）與抗血管生成因子（如血小板反應蛋白 1、內皮抑素）進行調節，進而促進皮瓣血管再生[21]。本研究中，水蛭素組術后皮瓣成活率及血管長度、容積和數量均顯著大于對照組，與既往研究結果一致[9-10, 12]，說明天然水蛭素在改善皮瓣成活及促進血管再生方面效果顯著。
皮瓣遠端壞死常見原因有循環血供來源改變、血供不足導致的灌注壓顯著下降、炎癥反應和氧化應激導致的微循環內血流淤滯、微血栓形成等[22-25]；而皮瓣成活有賴于血供及時恢復和重建以及皮瓣遠端組織有效血液灌注[26]。有研究證實，任意皮瓣術后成活除通過蒂部供血外，還必須通過暴露的真皮下血管網及四周創緣吸取營養[27-28]。我們發現術后 6 d 皮瓣除最遠端均有血管與周圍組織血管連通外，還表現為皮瓣血管與周圍組織血管走行一致，并跨過切緣，說明此處已有新生血管形成，或是原有閉塞的管腔被打通；同時水蛭素組和對照組均有連續性血管跨過切緣，這些血管走行方向與皮瓣周圍血管方向大體一致。由于各種調節因子都需依賴功能性的血管網絡運輸到相關目的地才能最終發揮作用[29]，所以我們分析這種大體一致的方向性，可能與切緣兩側各種調節因子隨血液循環能到達的最遠處距離及血流方向有關。
皮瓣及其周圍 1 cm 組織 Micro-CT 檢測三維重建顯示，水蛭素組形成的連通血管較對照組更多，說明天然水蛭素在皮瓣與周圍組織的血管再通或血管再生中起關鍵作用。同時，水蛭素組不僅皮瓣組織血管較對照組多，皮瓣周圍組織的血管也較對照組更密集，提示天然水蛭素不僅能促進局部血管再生，也能在一定程度上促進損傷部位周圍（切緣兩側）組織血管再生。這可能是由于其抗凝水平的發揮依賴于血液循環及損傷部位[29]，但這一結論還需要進一步實驗驗證。由于天然水蛭素局部皮下注射生物利用度高[30]，本研究結論對后期缺血組織的臨床處理具有一定指導意義。但本研究對灌注和取材的操作要求較高，若操作不熟練，會影響實驗結果的可靠性。
綜上述，局部皮下注射天然水蛭素能夠減輕組織炎癥，通過增加新生血管形成或促進閉塞血管再通，改善缺血區血供，從而提高皮瓣成活率。
作者貢獻：嚴玉勇直接參與實驗設計、實施及文章起草；潘新元參與實驗設計與統計分析；林博杰參與實驗設計；林冠宇參與數據收集整理；殷國前對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：動物實驗均經廣西醫科大學（廣西實驗動物中心）實驗動物倫理委員會批準（201803051），實驗動物使用許可證批準號：SYXK桂2014-0003。
