引用本文： 王一名, 魏文鑫, 韓巖. 脂肪脫細胞基質聯合封閉式負壓引流對豬創面炎癥反應的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(3): 373-381. doi: 10.7507/1002-1892.201904010 復制
近年來，脫細胞基質材料成為修復創傷組織的重要材料之一。美國食品藥品監督管理局（FDA）已批準脫細胞真皮基質、脫細胞羊膜/絨毛膜、脫細胞豬膀胱等用于臨床創面修復[1]，研究證明其效果優于常規換藥[2-3]。但這些材料很難滿足皮下軟組織再生需求，而且存在來源有限、材料致密且孔徑較小不利于細胞遷移和增殖的問題。脂肪組織結構疏松、來源豐富，切取后對機體無明顯影響。本課題組前期研究發現脂肪脫細胞基質（decellularized adipose tissue，DAT）具有良好組織相容性、細胞黏附性以及較完整的三維結構[4]。同時，DAT 保留了天然細胞外基質中的多種膠原蛋白、層粘連蛋白[5]、彈力蛋白、糖胺聚糖[6]以及 VEGF、EGF 等生長因子[7]，具備促進皮下脂肪再生的潛力[8-9]。目前有關 DAT 的研究主要集中在軟組織再生和脂肪組織工程方面，有關 DAT 對創面愈合的影響罕見報道。
創面愈合包括止血、炎癥、增殖和組織成熟 4 個經典階段，其中炎癥反應在整個過程中發揮關鍵作用。失控的炎癥反應可影響細胞外基質的沉積和創面內細胞活動，產生大量促炎因子，阻礙組織修復，是慢性創面主要誘發因素之一[10]。有研究表明，在體外模擬慢性創面過度炎癥反應條件下，經發泡技術處理的 DAT 珠粒泡沫可以提高人成纖維細胞成活率，與同樣發泡處理后的牛跟腱膠原相比效果更顯著[11]。在創面開放環境中使用 DAT 存在容易干結和污染的問題，從而失去生物活性，甚至誘發組織異物反應，阻礙創面愈合。為此，我們提出將其與封閉式負壓引流（vacuum sealing drainage，VSD）聯合應用，利用 VSD 保持創面清潔濕潤的作用，以期解決這一問題。本次研究旨在將 DAT 與 VSD 聯合用于豬皮膚軟組織創面，通過觀察創面中性粒細胞浸潤和炎癥因子、巨噬細胞表型相關因子表達水平，探明 DAT 聯合 VSD 對創面炎癥反應的影響，為該治療方法用于臨床奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
雄性巴馬小型豬 18 只，體質量 10～12 kg，由中國人民解放軍總醫院第一醫學中心動物實驗中心提供。實驗用脂肪組織由 2017 年 3 月—9 月在中國人民解放軍總醫院第一醫學中心整形修復科行腹部或大腿脂肪抽吸術的健康成年女性自愿捐贈，獲取后于無菌條件下使用 50 mL 離心管分裝，每管 20 mL，?80℃ 保存。
0.25% 胰蛋白酶/EDTA、青霉素/鏈霉素（中國醫學科學院生物醫學工程研究所）；異丙醇（北京化工廠）； RNase、DNase、Lipase（Sigma 公司，美國）；RNAlater、TRIzol、cDNA Synthesis Kit（Thermo 公司，美國）；SYBR GREEN Mix（TOYOBO 公司，日本）；豬誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase，iNOS）ELISA 試劑盒、精氨酸酶 1（arginase 1，ARG-1）ELISA 試劑盒（Cusabio 公司，美國）。
ZW-240 恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；VSD 一次性護創材料、負壓傷口治療機（武漢維斯第醫用科技股份有限公司）；光學顯微鏡 DM4M（Leica 公司，德國）；實時熒光定量 PCR 系統 ABI7500、分光光度計 NanoDrop2000（Thermo 公司，美國）。
1.2 DAT 制備及觀察
1.2.1 DAT 制備
參照文獻[12]方法制備 DAT。首先制備實驗用凍融緩沖液及消化緩沖液。① 凍融緩沖液：制備 10×溶液，稱取 12.1 g 三羥甲基氨基甲烷及 14.6 g EDTA，加入 1 L 雙蒸水，溶解后常溫保存；使用時取 100 mL，加入 900 mL 雙蒸水，調節 pH 值至 8。② 消化緩沖液：制備 10×溶液，稱取 147 g Na2HPO4·7H2O、23 g KH2PO4 和 12 g MgSO4·7H2O，加入 1 L 雙蒸水，溶解后常溫保存；使用時取出 100 mL，加入 900 mL 雙蒸水，調節 pH 值至 7.3。
取脂肪組織以 0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，去除血液和腫脹液；置于凍融緩沖液，以–80℃、37℃ 反復凍融 3 次；置于 0.25% 胰蛋白酶/0.1%EDTA 溶液混勻，37℃ 消化過夜后，0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，30 min/次；異丙醇萃取 36 h，每 12 小時更換 1 次異丙醇，0.25% 胰蛋白酶/0.1% EDTA 溶液消化 4 h，0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，30 min/次；置于含 2.5 mg RNase、2 500 U DNase、4 000 U Lipase 的消化緩沖液，消化過夜；0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，30 min/次；異丙醇萃取 6 h，0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，30 min/次。最后將獲得的 DAT 勻漿后置于培養皿，–20℃ 過夜后于–80℃ 真空凍干 24 h。上述消化和萃取操作過程均在 37℃、100 r/min 恒溫搖床中進行，胰蛋白酶及酶消化液、PBS 洗滌液及異丙醇萃取液中均加入青霉素/鏈霉素雙抗和 0.25 μg/mL 苯甲基磺酰氟。DAT 使用前置于 70% 乙醇浸泡過夜，0.1 mmol/L 無菌 PBS 清洗。
1.2.2 DAT 觀察
大體觀察凍干前及凍干后 DAT 的外觀、性狀；制備切片后常規 HE 染色，鏡下觀察其結構和脫細胞效果。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為 DAT/VSD 組、DAT 組、VSD 組及對照組。取 18 只巴馬小型豬肌肉注射速眠新 Ⅱ（0.08 mL/kg）及氯胺酮（6 mg/kg）全麻后，背部備皮、消毒、鋪無菌單。用 10 號手術刀片于每只豬背部距離脊柱 6 cm 處、左右對稱各制備 2 個直徑 4 cm 圓形創面，切除全層皮膚和皮下組織，直達肌膜層表面，共 72 個創面；將同一只豬背部 4 個創面隨機分為上述 4 組后對應處理。
DAT/VSD 組：將直徑 4 cm 圓形 DAT 直接平鋪于創面，VSD 敷料覆蓋于 DAT 表面；持續負壓吸引，負壓設置 16.4 kPa，直至無殘留創面。DAT 組：將直徑 4 cm 圓形 DAT 覆蓋創面，無菌紗布包扎。VSD 組：VSD 敷料覆蓋創面，負壓設置及處理同 DAT/VSD 組。對照組：無菌紗布覆蓋創面。為減少創緣皮膚收縮對實驗的干擾，使用 3-0 Prolene 縫線鎖邊縫合固定內徑為 4 cm 的滅菌尼龍制圓環。
術后將豬固定于自制固定吊床。DAT/VSD 組和 VSD 組每 6 小時檢查 1 次負壓裝置氣密性，如有漏氣及時更換 VSD 敷料和貼膜。DAT 組與對照組創面每日更換無菌紗布。18 只小型豬中 6 只用于組織學觀察，6 只用于實時熒光定量 PCR 檢測，6 只用于 ELISA 檢測。治療后第 3、7、10、14 天，同上法全麻后，各組取大小為 0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 創面組織用于觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
治療后觀察各組創面愈合情況。
1.4.2 組織學觀察
治療后第 3、7、10、14 天，各組創面組織 PBS 沖洗后置于 4% 多聚甲醛中固定 24 h，石蠟包埋，切片，片厚 8 μm。常規 HE 染色后光鏡下觀察。高倍（×400）視野下，根據細胞形態鑒定中性粒細胞。每張切片隨機取 8 個視野，計數視野范圍內中性粒細胞，取均值。
1.4.3 實時熒光定量 PCR 檢測
取治療前以及治療后第 3、7、10、14 天創面組織，采用實時熒光定量 PCR 法檢測炎癥反應相關因子 IL-1β、IL-6、TNF-α，以及 M1 型巨噬細胞相關因子 iNOS、M2 型巨噬細胞相關因子 ARG-1 的表達，以表征創面炎癥反應程度。使用 TRIzol 提取各組創面組織總 RNA，反轉錄為 cDNA 后，按照 SYBR GREEN Mix 說明書順序加入反應試劑、引物及 cDNA，進行 PCR 反應。各基因引物序列見表 1。采用 2–ΔΔCt 法計算目的基因相對表達量，以 GAPDH 作為內參。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列
Table1.
Prime sequences for qRT-PCR
1.4.4 ELISA 檢測
取治療前以及治療后第 3、7、10、14 天創面組織，按照 ELISA 試劑盒說明書操作，測定創面組織中 M1 型巨噬細胞標記物 iNOS、M2 型巨噬細胞標記物 ARG-1 含量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS23.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 DAT 觀察
制備的 DAT 凍干前呈乳白色疏松凝膠狀，經真空凍干后形成海綿狀疏松組織塊。HE 染色顯示 DAT 中無明顯細胞結構及藍染細胞核，可見紅染膠原及網格狀孔隙結構，提示脫細胞徹底。見圖 1。
圖1
DAT 觀察
a、b. 大體觀察凍干前后 DAT 外觀；c. HE 染色（×200）
Figure1. DAT observationa, b. General observation of DAT before and after freeze-drying; c. HE staining (×200)
2.2 動物實驗觀察
2.2.1 大體觀察
治療后第 7 天，4 組創面均可見新鮮肉芽組織，DAT/VSD 組、DAT 組創面表面鮮紅肉芽組織與乳白色半透明 DAT 相間分布。治療后第 14 天，4 組創面邊緣均可見新生上皮，DAT/VSD 組創面表面的 DAT 轉為鮮紅色，被肉芽組織充填，外觀飽滿；DAT 組創面表面仍有散在乳白色島狀 DAT；VSD 組創面表面為新鮮肉芽組織，并填充至與周圍正常皮膚等高；對照組創面肉芽組織水腫明顯，新生上皮邊緣腫脹。見圖 2。
圖2
各時間點各組創面大體觀察
從左至右分別為 DAT/VSD 組、DAT 組、VSD 組及對照組 a. 治療前；b. 治療后第 7 天；c. 治療后第 10 天；d. 治療后第 14 天
Figure2. General observation of wound at each time pointFrom left to right for DAT/VSD group, DAT group, VSD group, and control groupa. Before treatment; b. At 7 days after treatment; c. At 10 days after treatment; d. At 14 days after treatment
2.2.2 組織學觀察
治療后第 3、7 天，DAT/VSD 組和 DAT 組創面中 DAT 內填充中性粒細胞以及淋巴細胞，而 VSD 組和對照組創面組織內以中性粒細胞浸潤為主。治療后第 10、14 天，DAT/VSD 組和 DAT 組淋巴細胞浸潤明顯減輕，巨噬細胞增多，可見較多微血管生成；對照組中性粒細胞浸潤較其他組明顯。見圖 3。
圖3
治療后各組創面 HE 染色觀察（×400）
從左至右分別為 DAT/VSD 組、DAT 組、VSD 組及對照組 a. 第 3 天；b. 第 7 天；c. 第 10 天；d. 第 14 天
Figure3. HE staining of wound after treatment in each group (×400)From left to right for DAT/VSD group, DAT group, VSD group, and control groupa. At 3 days; b. At 7 days; c. At 10 days; d. At 14 days
治療后第 3 天，DAT/VSD 組中性粒細胞計數低于對照組和 DAT 組（P<0.05），與 VSD 組差異無統計學意義（P>0.05）；DAT 組、VSD 組及對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。第 7、10、14 天，DAT/VSD 組中性粒細胞計數明顯低于其他組、DAT 組及 VSD 組低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；DAT 組與 VSD 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
治療后各時間點各組創面組織中性粒細胞計數比較（n=6，
，個/視野）
Table2.
Comparison of neutrophil count of the wounds between groups at each time point (n=6,
, /field)
2.2.3 實時熒光定量 PCR 檢測
各組治療前 IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 及 ARG-1 mRNA 相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。治療后第 3、7、10、14 天，DAT/VSD 組創面組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 iNOS mRNA 相對表達量均低于其他組，而 ARG-1mRNA 相對表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；DAT 組及 VSD 組 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 iNOS mRNA 相對表達量均低于對照組，ARG-1 升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。治療后第 10、14 天 VSD 組 IL-6 和 TNF-α mRNA 相對表達量低于 DAT 組（P<0.05），第 14 天 ARG-1 mRNA 相對表達量高于 DAT 組（P<0.05）；其余時間點兩組間各指標差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測各組創面組織中炎癥反應以及巨噬細胞表型相關因子 mRNA 相對表達量
a. IL-1β；b. IL-6；c. TNF-α；d. iNOS；e. ARG-1
Figure4. The mRNA relative expressions of inflammation and macrophage phenotypic markers detected by qRT-PCRa. IL-1β; b. IL-6; c. TNF-α; d. iNOS;e. ARG-1
2.2.4 ELISA 檢測
各組治療前 iNOS 及 ARG-1 含量差異均無統計學意義（P>0.05）。各組創面 iNOS 含量均在治療后第 3 天達峰值，此后呈下降趨勢。第 3、7、10、14 天，DAT/VSD 組、DAT 組及 VSD 組創面 iNOS 含量均低于對照組，DAT/VSD 組低于 DAT 組及 VSD 組，VSD 組低于 DAT 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
各組創面 ARG-1 含量均呈先升高后下降趨勢，在治療后第 7 天達峰值。治療后第 3、7、10、14 天 DAT/VSD 組創面 ARG-1 含量高于其他組（P<0.05）。治療后第 3、7、10 天，對照組創面 ARG-1 含量明顯低于 DAT 組與 VSD 組（P<0.05）；第 14 天明顯低于 VSD 組（P<0.05），但與 DAT 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。治療后第 3、7 天 DAT 組與 VSD 組差異無統計學意義（P>0.05）；第 10 天 DAT 組高于 VSD 組、第 14 天低于 VSD 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
ELISA 檢測各組創面巨噬細胞表型相關因子含量
a. iNOS；b. ARG-1
Figure5. The contents of macrophage phenotypic markers detected by ELISAa. iNOS; b. ARG-1
3 討論
皮膚軟組織損傷后，炎癥反應是機體應對創傷最基本的防御反應。早期炎癥反應發生在創傷后 72 h 以內，以中性粒細胞為代表的炎癥細胞趨化、聚集至受損組織周圍，清除細菌并抑制細菌增殖[13]。在此階段創面炎癥因子大多來源于中性粒細胞，這些因子除了具備抵御感染侵襲作用外，也能與細菌多種脂多糖成分協同作用，誘導機體表達更多炎癥介質，導致炎癥反應加重[14]。Abdollahi 等[12]報道創面組織中中性粒細胞持續大量浸潤將激活基質金屬蛋白酶 9（metalloproteinases 9，MMP-9），及其調節因子中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，從而破壞創面愈合過程。本研究中性粒細胞計數結果表明，聯合使用 DAT 和 VSD 能減輕炎癥轉歸階段，即創傷發生 3 d 后的中性粒細胞浸潤，預防炎癥狀態異常持續，使創傷組織盡快進入修復狀態。
當巨噬細胞處于不同微環境時，其吞噬、抗原提呈、分泌細胞因子的能力均不同。研究人員根據巨噬細胞的不同功能和活化狀態，將其分為兩個亞群，即 M1 型和 M2 型巨噬細胞[15]。創面愈合初期，以抗感染、促進炎癥反應的 M1 型（經典活化型）巨噬細胞為主，隨后向促進組織修復的 M2 型（替代活化型）巨噬細胞過渡[16]。M1 型巨噬細胞可通過釋放大量 VEGF 啟動新生血管生成過程[17]。然而，當過多 M1 型巨噬細胞長期浸潤于創面組織時，將誘導活性氧產生，合成大量一氧化氮[18]，同時釋放各種炎癥相關因子，如 TNF-α、IL-6、IL-1β 等，并合成、活化 MMP，使之在創面內過量積聚，嚴重干擾正常創面愈合過程[19]。M2 型巨噬細胞可通過分泌 TGF-β、VEGF、ARG-1、PDGF 及部分細胞外基質蛋白等促進細胞增殖、血管生成、膠原沉積[20]。因此，可誘導創面組織巨噬細胞表型從 M1 型轉變為 M2 型的生物材料有利于創面愈合。細胞外基質由組織內細胞分泌的結構和功能分子構成，動態、雙向地影響細胞行為。當細胞與細胞外基質結構成分，如膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等接觸時，細胞的形態、生長因子效能和基因表達調控均被調節[21]。Slivka 等[22]研究發現，豬膀胱脫細胞基質凝膠可改變巨噬細胞行為，使 MMP-2、MMP-9 和尿激酶型纖溶酶原激活劑表達下降，抑制 TNF-α、IL-1β 等促炎介質產生。
VSD 可減少創面感染的發生，同時能下調創面組織內促炎因子表達[23]。Bassetto 等[24]發現 VSD 對皮膚軟組織創面的作用不局限于淺層的肉芽組織，對深層組織同樣有影響，其作用還包括緩解炎癥反應，使局部組織趨向穩定的狀態。有學者研究發現 VSD 治療時，通過機體組織中機械受體和化學感受器共同作用于細胞信號傳導，創面組織細胞因子和生長因子表達譜發生轉變，將細胞因子調節為以“抗炎譜”為主[25]。
本研究結果顯示，DAT/VSD 組創面組織炎癥因子 IL-6、IL-β1、TNF-α 及 M1 型巨噬細胞標志物 iNOS 表達較其他組減少，iNOS 蛋白含量亦低于其他組，變化趨勢與中性粒細胞浸潤減輕結果吻合。相反創面組織中 M2 型巨噬細胞標志物 ARG-1 mRNA 表達及蛋白含量增加。雖然創面單用 DAT 和 VSD 后也得到類似結果，但二者聯合使用時效果更加顯著。因此，我們認為 DAT 聯合 VSD 使用能減少創面促炎因子表達，同時促使組織中巨噬細胞從 M1 型向 M2 型轉化。
綜上述，本研究結果初步提示 DAT 聯合 VSD 治療皮膚軟組織創面，可以減少中性粒細胞浸潤，調節炎癥反應以及巨噬細胞表型，有利于創面組織修復再生。本研究不足之處在于，實驗使用的 DAT 是僅經過脫細胞和凍干處理制品，未實現內部結構均一化。此外，本研究中對炎癥反應的檢測指標僅限于以中性粒細胞為主的普通炎癥，未對淋巴細胞為主的免疫排斥相關炎癥反應進行充分探討，還需細胞學以及分子生物學實驗進一步驗證其對免疫反應的調節作用，并深入研究異種組織對 DAT 的免疫排斥相關炎癥反應。
作者貢獻：王一名負責實驗設計及實施、數據收集整理與統計分析、文章撰寫；魏文鑫負責實驗設計、數據收集整理與統計分析；韓巖負責實驗設計及對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國人民解放軍總醫院動物實驗倫理委員會批準（2017-D13-16）。動物使用許可證號：SYXX（軍）2017-0017。
近年來，脫細胞基質材料成為修復創傷組織的重要材料之一。美國食品藥品監督管理局（FDA）已批準脫細胞真皮基質、脫細胞羊膜/絨毛膜、脫細胞豬膀胱等用于臨床創面修復[1]，研究證明其效果優于常規換藥[2-3]。但這些材料很難滿足皮下軟組織再生需求，而且存在來源有限、材料致密且孔徑較小不利于細胞遷移和增殖的問題。脂肪組織結構疏松、來源豐富，切取后對機體無明顯影響。本課題組前期研究發現脂肪脫細胞基質（decellularized adipose tissue，DAT）具有良好組織相容性、細胞黏附性以及較完整的三維結構[4]。同時，DAT 保留了天然細胞外基質中的多種膠原蛋白、層粘連蛋白[5]、彈力蛋白、糖胺聚糖[6]以及 VEGF、EGF 等生長因子[7]，具備促進皮下脂肪再生的潛力[8-9]。目前有關 DAT 的研究主要集中在軟組織再生和脂肪組織工程方面，有關 DAT 對創面愈合的影響罕見報道。
創面愈合包括止血、炎癥、增殖和組織成熟 4 個經典階段，其中炎癥反應在整個過程中發揮關鍵作用。失控的炎癥反應可影響細胞外基質的沉積和創面內細胞活動，產生大量促炎因子，阻礙組織修復，是慢性創面主要誘發因素之一[10]。有研究表明，在體外模擬慢性創面過度炎癥反應條件下，經發泡技術處理的 DAT 珠粒泡沫可以提高人成纖維細胞成活率，與同樣發泡處理后的牛跟腱膠原相比效果更顯著[11]。在創面開放環境中使用 DAT 存在容易干結和污染的問題，從而失去生物活性，甚至誘發組織異物反應，阻礙創面愈合。為此，我們提出將其與封閉式負壓引流（vacuum sealing drainage，VSD）聯合應用，利用 VSD 保持創面清潔濕潤的作用，以期解決這一問題。本次研究旨在將 DAT 與 VSD 聯合用于豬皮膚軟組織創面，通過觀察創面中性粒細胞浸潤和炎癥因子、巨噬細胞表型相關因子表達水平，探明 DAT 聯合 VSD 對創面炎癥反應的影響，為該治療方法用于臨床奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
雄性巴馬小型豬 18 只，體質量 10～12 kg，由中國人民解放軍總醫院第一醫學中心動物實驗中心提供。實驗用脂肪組織由 2017 年 3 月—9 月在中國人民解放軍總醫院第一醫學中心整形修復科行腹部或大腿脂肪抽吸術的健康成年女性自愿捐贈，獲取后于無菌條件下使用 50 mL 離心管分裝，每管 20 mL，?80℃ 保存。
0.25% 胰蛋白酶/EDTA、青霉素/鏈霉素（中國醫學科學院生物醫學工程研究所）；異丙醇（北京化工廠）； RNase、DNase、Lipase（Sigma 公司，美國）；RNAlater、TRIzol、cDNA Synthesis Kit（Thermo 公司，美國）；SYBR GREEN Mix（TOYOBO 公司，日本）；豬誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxidesynthase，iNOS）ELISA 試劑盒、精氨酸酶 1（arginase 1，ARG-1）ELISA 試劑盒（Cusabio 公司，美國）。
ZW-240 恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；VSD 一次性護創材料、負壓傷口治療機（武漢維斯第醫用科技股份有限公司）；光學顯微鏡 DM4M（Leica 公司，德國）；實時熒光定量 PCR 系統 ABI7500、分光光度計 NanoDrop2000（Thermo 公司，美國）。
1.2 DAT 制備及觀察
1.2.1 DAT 制備
參照文獻[12]方法制備 DAT。首先制備實驗用凍融緩沖液及消化緩沖液。① 凍融緩沖液：制備 10×溶液，稱取 12.1 g 三羥甲基氨基甲烷及 14.6 g EDTA，加入 1 L 雙蒸水，溶解后常溫保存；使用時取 100 mL，加入 900 mL 雙蒸水，調節 pH 值至 8。② 消化緩沖液：制備 10×溶液，稱取 147 g Na2HPO4·7H2O、23 g KH2PO4 和 12 g MgSO4·7H2O，加入 1 L 雙蒸水，溶解后常溫保存；使用時取出 100 mL，加入 900 mL 雙蒸水，調節 pH 值至 7.3。
取脂肪組織以 0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，去除血液和腫脹液；置于凍融緩沖液，以–80℃、37℃ 反復凍融 3 次；置于 0.25% 胰蛋白酶/0.1%EDTA 溶液混勻，37℃ 消化過夜后，0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，30 min/次；異丙醇萃取 36 h，每 12 小時更換 1 次異丙醇，0.25% 胰蛋白酶/0.1% EDTA 溶液消化 4 h，0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，30 min/次；置于含 2.5 mg RNase、2 500 U DNase、4 000 U Lipase 的消化緩沖液，消化過夜；0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，30 min/次；異丙醇萃取 6 h，0.1 mmol/L PBS 洗滌 3 次，30 min/次。最后將獲得的 DAT 勻漿后置于培養皿，–20℃ 過夜后于–80℃ 真空凍干 24 h。上述消化和萃取操作過程均在 37℃、100 r/min 恒溫搖床中進行，胰蛋白酶及酶消化液、PBS 洗滌液及異丙醇萃取液中均加入青霉素/鏈霉素雙抗和 0.25 μg/mL 苯甲基磺酰氟。DAT 使用前置于 70% 乙醇浸泡過夜，0.1 mmol/L 無菌 PBS 清洗。
1.2.2 DAT 觀察
大體觀察凍干前及凍干后 DAT 的外觀、性狀；制備切片后常規 HE 染色，鏡下觀察其結構和脫細胞效果。
1.3 實驗分組及方法
實驗分為 DAT/VSD 組、DAT 組、VSD 組及對照組。取 18 只巴馬小型豬肌肉注射速眠新 Ⅱ（0.08 mL/kg）及氯胺酮（6 mg/kg）全麻后，背部備皮、消毒、鋪無菌單。用 10 號手術刀片于每只豬背部距離脊柱 6 cm 處、左右對稱各制備 2 個直徑 4 cm 圓形創面，切除全層皮膚和皮下組織，直達肌膜層表面，共 72 個創面；將同一只豬背部 4 個創面隨機分為上述 4 組后對應處理。
DAT/VSD 組：將直徑 4 cm 圓形 DAT 直接平鋪于創面，VSD 敷料覆蓋于 DAT 表面；持續負壓吸引，負壓設置 16.4 kPa，直至無殘留創面。DAT 組：將直徑 4 cm 圓形 DAT 覆蓋創面，無菌紗布包扎。VSD 組：VSD 敷料覆蓋創面，負壓設置及處理同 DAT/VSD 組。對照組：無菌紗布覆蓋創面。為減少創緣皮膚收縮對實驗的干擾，使用 3-0 Prolene 縫線鎖邊縫合固定內徑為 4 cm 的滅菌尼龍制圓環。
術后將豬固定于自制固定吊床。DAT/VSD 組和 VSD 組每 6 小時檢查 1 次負壓裝置氣密性，如有漏氣及時更換 VSD 敷料和貼膜。DAT 組與對照組創面每日更換無菌紗布。18 只小型豬中 6 只用于組織學觀察，6 只用于實時熒光定量 PCR 檢測，6 只用于 ELISA 檢測。治療后第 3、7、10、14 天，同上法全麻后，各組取大小為 0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 創面組織用于觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
治療后觀察各組創面愈合情況。
1.4.2 組織學觀察
治療后第 3、7、10、14 天，各組創面組織 PBS 沖洗后置于 4% 多聚甲醛中固定 24 h，石蠟包埋，切片，片厚 8 μm。常規 HE 染色后光鏡下觀察。高倍（×400）視野下，根據細胞形態鑒定中性粒細胞。每張切片隨機取 8 個視野，計數視野范圍內中性粒細胞，取均值。
1.4.3 實時熒光定量 PCR 檢測
取治療前以及治療后第 3、7、10、14 天創面組織，采用實時熒光定量 PCR 法檢測炎癥反應相關因子 IL-1β、IL-6、TNF-α，以及 M1 型巨噬細胞相關因子 iNOS、M2 型巨噬細胞相關因子 ARG-1 的表達，以表征創面炎癥反應程度。使用 TRIzol 提取各組創面組織總 RNA，反轉錄為 cDNA 后，按照 SYBR GREEN Mix 說明書順序加入反應試劑、引物及 cDNA，進行 PCR 反應。各基因引物序列見表 1。采用 2–ΔΔCt 法計算目的基因相對表達量，以 GAPDH 作為內參。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列
Table1.
Prime sequences for qRT-PCR
1.4.4 ELISA 檢測
取治療前以及治療后第 3、7、10、14 天創面組織，按照 ELISA 試劑盒說明書操作，測定創面組織中 M1 型巨噬細胞標記物 iNOS、M2 型巨噬細胞標記物 ARG-1 含量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS23.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 DAT 觀察
制備的 DAT 凍干前呈乳白色疏松凝膠狀，經真空凍干后形成海綿狀疏松組織塊。HE 染色顯示 DAT 中無明顯細胞結構及藍染細胞核，可見紅染膠原及網格狀孔隙結構，提示脫細胞徹底。見圖 1。
圖1
DAT 觀察
a、b. 大體觀察凍干前后 DAT 外觀；c. HE 染色（×200）
Figure1. DAT observationa, b. General observation of DAT before and after freeze-drying; c. HE staining (×200)
2.2 動物實驗觀察
2.2.1 大體觀察
治療后第 7 天，4 組創面均可見新鮮肉芽組織，DAT/VSD 組、DAT 組創面表面鮮紅肉芽組織與乳白色半透明 DAT 相間分布。治療后第 14 天，4 組創面邊緣均可見新生上皮，DAT/VSD 組創面表面的 DAT 轉為鮮紅色，被肉芽組織充填，外觀飽滿；DAT 組創面表面仍有散在乳白色島狀 DAT；VSD 組創面表面為新鮮肉芽組織，并填充至與周圍正常皮膚等高；對照組創面肉芽組織水腫明顯，新生上皮邊緣腫脹。見圖 2。
圖2
各時間點各組創面大體觀察
從左至右分別為 DAT/VSD 組、DAT 組、VSD 組及對照組 a. 治療前；b. 治療后第 7 天；c. 治療后第 10 天；d. 治療后第 14 天
Figure2. General observation of wound at each time pointFrom left to right for DAT/VSD group, DAT group, VSD group, and control groupa. Before treatment; b. At 7 days after treatment; c. At 10 days after treatment; d. At 14 days after treatment
2.2.2 組織學觀察
治療后第 3、7 天，DAT/VSD 組和 DAT 組創面中 DAT 內填充中性粒細胞以及淋巴細胞，而 VSD 組和對照組創面組織內以中性粒細胞浸潤為主。治療后第 10、14 天，DAT/VSD 組和 DAT 組淋巴細胞浸潤明顯減輕，巨噬細胞增多，可見較多微血管生成；對照組中性粒細胞浸潤較其他組明顯。見圖 3。
圖3
治療后各組創面 HE 染色觀察（×400）
從左至右分別為 DAT/VSD 組、DAT 組、VSD 組及對照組 a. 第 3 天；b. 第 7 天；c. 第 10 天；d. 第 14 天
Figure3. HE staining of wound after treatment in each group (×400)From left to right for DAT/VSD group, DAT group, VSD group, and control groupa. At 3 days; b. At 7 days; c. At 10 days; d. At 14 days
治療后第 3 天，DAT/VSD 組中性粒細胞計數低于對照組和 DAT 組（P<0.05），與 VSD 組差異無統計學意義（P>0.05）；DAT 組、VSD 組及對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。第 7、10、14 天，DAT/VSD 組中性粒細胞計數明顯低于其他組、DAT 組及 VSD 組低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；DAT 組與 VSD 組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
治療后各時間點各組創面組織中性粒細胞計數比較（n=6，，個/視野）
Table2.
Comparison of neutrophil count of the wounds between groups at each time point (n=6,, /field)
2.2.3 實時熒光定量 PCR 檢測
各組治療前 IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 及 ARG-1 mRNA 相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。治療后第 3、7、10、14 天，DAT/VSD 組創面組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 iNOS mRNA 相對表達量均低于其他組，而 ARG-1mRNA 相對表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；DAT 組及 VSD 組 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 iNOS mRNA 相對表達量均低于對照組，ARG-1 升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。治療后第 10、14 天 VSD 組 IL-6 和 TNF-α mRNA 相對表達量低于 DAT 組（P<0.05），第 14 天 ARG-1 mRNA 相對表達量高于 DAT 組（P<0.05）；其余時間點兩組間各指標差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測各組創面組織中炎癥反應以及巨噬細胞表型相關因子 mRNA 相對表達量
a. IL-1β；b. IL-6；c. TNF-α；d. iNOS；e. ARG-1
Figure4. The mRNA relative expressions of inflammation and macrophage phenotypic markers detected by qRT-PCRa. IL-1β; b. IL-6; c. TNF-α; d. iNOS;e. ARG-1
2.2.4 ELISA 檢測
各組治療前 iNOS 及 ARG-1 含量差異均無統計學意義（P>0.05）。各組創面 iNOS 含量均在治療后第 3 天達峰值，此后呈下降趨勢。第 3、7、10、14 天，DAT/VSD 組、DAT 組及 VSD 組創面 iNOS 含量均低于對照組，DAT/VSD 組低于 DAT 組及 VSD 組，VSD 組低于 DAT 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
各組創面 ARG-1 含量均呈先升高后下降趨勢，在治療后第 7 天達峰值。治療后第 3、7、10、14 天 DAT/VSD 組創面 ARG-1 含量高于其他組（P<0.05）。治療后第 3、7、10 天，對照組創面 ARG-1 含量明顯低于 DAT 組與 VSD 組（P<0.05）；第 14 天明顯低于 VSD 組（P<0.05），但與 DAT 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。治療后第 3、7 天 DAT 組與 VSD 組差異無統計學意義（P>0.05）；第 10 天 DAT 組高于 VSD 組、第 14 天低于 VSD 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
ELISA 檢測各組創面巨噬細胞表型相關因子含量
a. iNOS；b. ARG-1
Figure5. The contents of macrophage phenotypic markers detected by ELISAa. iNOS; b. ARG-1
3 討論
皮膚軟組織損傷后，炎癥反應是機體應對創傷最基本的防御反應。早期炎癥反應發生在創傷后 72 h 以內，以中性粒細胞為代表的炎癥細胞趨化、聚集至受損組織周圍，清除細菌并抑制細菌增殖[13]。在此階段創面炎癥因子大多來源于中性粒細胞，這些因子除了具備抵御感染侵襲作用外，也能與細菌多種脂多糖成分協同作用，誘導機體表達更多炎癥介質，導致炎癥反應加重[14]。Abdollahi 等[12]報道創面組織中中性粒細胞持續大量浸潤將激活基質金屬蛋白酶 9（metalloproteinases 9，MMP-9），及其調節因子中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，從而破壞創面愈合過程。本研究中性粒細胞計數結果表明，聯合使用 DAT 和 VSD 能減輕炎癥轉歸階段，即創傷發生 3 d 后的中性粒細胞浸潤，預防炎癥狀態異常持續，使創傷組織盡快進入修復狀態。
當巨噬細胞處于不同微環境時，其吞噬、抗原提呈、分泌細胞因子的能力均不同。研究人員根據巨噬細胞的不同功能和活化狀態，將其分為兩個亞群，即 M1 型和 M2 型巨噬細胞[15]。創面愈合初期，以抗感染、促進炎癥反應的 M1 型（經典活化型）巨噬細胞為主，隨后向促進組織修復的 M2 型（替代活化型）巨噬細胞過渡[16]。M1 型巨噬細胞可通過釋放大量 VEGF 啟動新生血管生成過程[17]。然而，當過多 M1 型巨噬細胞長期浸潤于創面組織時，將誘導活性氧產生，合成大量一氧化氮[18]，同時釋放各種炎癥相關因子，如 TNF-α、IL-6、IL-1β 等，并合成、活化 MMP，使之在創面內過量積聚，嚴重干擾正常創面愈合過程[19]。M2 型巨噬細胞可通過分泌 TGF-β、VEGF、ARG-1、PDGF 及部分細胞外基質蛋白等促進細胞增殖、血管生成、膠原沉積[20]。因此，可誘導創面組織巨噬細胞表型從 M1 型轉變為 M2 型的生物材料有利于創面愈合。細胞外基質由組織內細胞分泌的結構和功能分子構成，動態、雙向地影響細胞行為。當細胞與細胞外基質結構成分，如膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等接觸時，細胞的形態、生長因子效能和基因表達調控均被調節[21]。Slivka 等[22]研究發現，豬膀胱脫細胞基質凝膠可改變巨噬細胞行為，使 MMP-2、MMP-9 和尿激酶型纖溶酶原激活劑表達下降，抑制 TNF-α、IL-1β 等促炎介質產生。
VSD 可減少創面感染的發生，同時能下調創面組織內促炎因子表達[23]。Bassetto 等[24]發現 VSD 對皮膚軟組織創面的作用不局限于淺層的肉芽組織，對深層組織同樣有影響，其作用還包括緩解炎癥反應，使局部組織趨向穩定的狀態。有學者研究發現 VSD 治療時，通過機體組織中機械受體和化學感受器共同作用于細胞信號傳導，創面組織細胞因子和生長因子表達譜發生轉變，將細胞因子調節為以“抗炎譜”為主[25]。
本研究結果顯示，DAT/VSD 組創面組織炎癥因子 IL-6、IL-β1、TNF-α 及 M1 型巨噬細胞標志物 iNOS 表達較其他組減少，iNOS 蛋白含量亦低于其他組，變化趨勢與中性粒細胞浸潤減輕結果吻合。相反創面組織中 M2 型巨噬細胞標志物 ARG-1 mRNA 表達及蛋白含量增加。雖然創面單用 DAT 和 VSD 后也得到類似結果，但二者聯合使用時效果更加顯著。因此，我們認為 DAT 聯合 VSD 使用能減少創面促炎因子表達，同時促使組織中巨噬細胞從 M1 型向 M2 型轉化。
綜上述，本研究結果初步提示 DAT 聯合 VSD 治療皮膚軟組織創面，可以減少中性粒細胞浸潤，調節炎癥反應以及巨噬細胞表型，有利于創面組織修復再生。本研究不足之處在于，實驗使用的 DAT 是僅經過脫細胞和凍干處理制品，未實現內部結構均一化。此外，本研究中對炎癥反應的檢測指標僅限于以中性粒細胞為主的普通炎癥，未對淋巴細胞為主的免疫排斥相關炎癥反應進行充分探討，還需細胞學以及分子生物學實驗進一步驗證其對免疫反應的調節作用，并深入研究異種組織對 DAT 的免疫排斥相關炎癥反應。
作者貢獻：王一名負責實驗設計及實施、數據收集整理與統計分析、文章撰寫；魏文鑫負責實驗設計、數據收集整理與統計分析；韓巖負責實驗設計及對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國人民解放軍總醫院動物實驗倫理委員會批準（2017-D13-16）。動物使用許可證號：SYXX（軍）2017-0017。
