引用本文： 徐明均, 李曉國, 馬晨, 呂玉珍, 馬曉娜, 馬曉薇. 人胎盤MSCs移植對急性肺損傷小鼠肺血管內皮通透性及肺組織損傷修復的影響. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(3): 387-392. doi: 10.7507/1002-1892.201909070 復制
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指多種肺內、外致病因素導致的進行性、缺氧性呼吸衰竭，甚至發生急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1]。由于缺乏特異性治療手段，ARDS 死亡率高達 40%[2]。目前，ALI/ARDS 發病機制尚未完全明確，但已證實肺泡-毛細血管屏障遭受破壞所致的肺血管內皮通透性增加，在其發生、發展中發揮重要作用[3]。MSCs 是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，可向損傷部位遷徙并分化成損傷細胞[4]。有研究者將 MSCs 通過尾靜脈注入 ALI 模型小鼠體內，發現其不僅能夠向損傷肺組織遷移、定植，還能分化為肺泡上皮細胞發揮組織修復作用，提示 MSCs 移植有望作為一種新的 ALI 治療手段[5]。
目前，MSCs 相關研究多采用 BMSCs，但 BMSCs 存在體內遷移緩慢、增殖效率低、細胞獲取困難等問題，限制了其在臨床或動物模型研究中的應用[6]。相比 BMSCs，人胎盤 MSCs（human placental MSCs，hPMSCs）具有增殖能力強、組織獲取容易、免疫原性小等諸多優勢[7-8]。并且，我們前期研究已證實 hPMSCs 具有與 BMSCs 大致相同的表型特征和較強的分化潛能[9]。本次研究擬通過氣道滴注脂多糖制備 ALI 小鼠模型并尾靜脈注射 hPMSCs，觀察 hPMSCs 對 ALI 小鼠肺血管內皮通透性及肺組織損傷修復的影響，為 hPMSCs 用于臨床治療 ALI 提供理論依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6 周齡雄性 C57BL/6 小鼠 24 只，體質量 18～22 g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供。胎盤由寧夏醫科大學總醫院婦產科提供，產婦及家屬均知情同意。
MSCs Mesencult?-XF 無血清培養基（Stem Cell 公司，加拿大）；DMEM 培養基、FBS、胰蛋白酶、PBS（GIBCO 公司，美國）；脂多糖（Sigma 公司，美國）；流式抗體 CD105-PE、CD90-FITC、CD73-PE、CD45-FITC、CD34-FITC、CD14-FITC（BD 公司，美國）；小鼠抗兔血管內皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）抗體、小鼠抗兔 β-actin 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗（Proteintech 公司，美國）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）。
CO2 培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；干燥箱（上海光華儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械有限公司）；電子天平（Mettler Toledo 公司，瑞士）；多功能酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 hPMSCs 分離、培養及鑒定
參照文獻[10]方法分離培養 hPMSCs。取人胎盤胎兒側約 0.5 cm 厚組織，PBS 漂洗去除殘存血漬，用眼科剪剪成 1 mm×1 mm×1 mm 碎塊，加入 0.1%A 型膠原酶和 1 μg/mL DNA 酶Ⅰ，于 37℃ 水浴消化 2 h。消化后細胞懸液振蕩并過 100 目細胞篩網，以 540×g 離心 10 s，收集上清液；Hank 平衡鹽溶液洗滌 2 次，加入適量完全培養液重懸沉淀，轉入細胞培養皿中；于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。培養 48 h 后更換新鮮培養液，待細胞融合至 80%～90% 時，以 1∶3 比例傳代培養。于倒置顯微鏡下觀察 hPMSCs 培養期間的細胞形態變化。
取第 3 代正常生長 hPMSCs，調節細胞濃度至 1×107個/mL，用流式抗體 CD105-PE、CD90-FITC、CD73-PE、CD45-FITC、CD34-FITC、CD14-FITC 和同型對照抗體各 10 μL 標記，室溫避光孵育 30 min，PBS 清洗 2 次，重懸后用流式細胞儀檢測抗原表型特征。
1.3 實驗分組及方法
將 24 只 C57BL/6 小鼠隨機分成對照組、ALI 模型組、hPMSCs 治療組，每組 8 只。ALI 模型組和 hPMSCs 治療組經氣道緩慢滴注脂多糖（2.5 mg/kg），構建 ALI 小鼠模型[11]；對照組經氣道滴注相應劑量生理鹽水。滴注脂多糖 12 h 后，hPMSCs 治療組每只小鼠經尾靜脈注射 1×106個第 3 代 hPMSCs，ALI 模型組與對照組經尾靜脈注射生理鹽水。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
觀察實驗期間各組小鼠存活、精神、進食、活動、呼吸等情況。
1.4.2 小鼠肺組織病理學觀察
尾靜脈注射后 24 h，各組隨機選取 4 只小鼠采用斷頸法處死。取部分左肺組織，置于 40 g/L 多聚甲醛固定 24 h，經脫水、透明、包埋等處理，制備 5 μm 厚石蠟切片。常規 HE 染色，光鏡下觀察小鼠肺組織病理改變。
1.4.3 小鼠肺組織濕/干質量比（wet/dry mass ratio，W/D）測定
取 1.4.2 中各組小鼠右肺上葉，用濾紙吸去肺組織表面水分，稱其濕質量；置于 60℃ 恒溫烘箱干燥 48 h，至其質量恒定后，稱其干質量；計算肺組織 W/D。
1.4.4 伊文思藍滲漏實驗
參照文獻[12]方法進行實驗。用預冷 PBS 制備伊文思藍染液（100 mg/mL），將染液（30 mg/kg）經尾靜脈注入各組剩余 4 只小鼠體內，1 h 后放血處死小鼠、剖開胸腔，用預冷 PBS 經右心房反復沖洗 5 min。取右側肺組織于甲酰胺中制備組織勻漿，以萃取伊文思藍染液。將組織勻漿以 12 000×g 離心 20 min，60℃ 孵育 24 h 后收集上清液，于 630 nm 波長下檢測吸光度（A）值，根據伊文思藍標準曲線，以 A 值計算肺實質中伊文思藍染液含量。
1.4.5 Western blot 檢測肺組織 VE-cadherin 表達
取 1.4.2 中各組小鼠剩余左肺組織提取總蛋白，測定蛋白濃度。取等量總蛋白經 10%SDS-PAGE 電泳、轉膜，將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h；與小鼠抗兔 VE-cadherin 抗體、小鼠抗兔 β-actin 單克隆抗體（1∶1 000）4℃ 條件下孵育過夜；TBST 洗膜 3 次，與辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗（1∶5 000）室溫下孵育2 h；TBST 洗膜 3 次，化學發光成像系統獲取免疫反應條帶。Quantity One 圖像分析軟件分析各條帶 A 值，以與 β-actin A 值比值作為目的蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hPMSCs 細胞形態觀察及鑒定
培養 24 h，倒置顯微鏡下可見少量貼壁細胞，呈短梭形；培養 1 周后細胞逐漸增多，呈集落樣生長，漩渦狀或放射狀分布；10 d 左右細胞融合達 80%～90%，傳代后形態趨于一致。第 3 代細胞形態均一，呈長梭形，漩渦狀分布。見圖 1a、b。流式細胞儀檢測顯示，分離培養的細胞具有典型 MSCs 表型特征，干細胞表面抗原 CD105、CD90、CD73 高表達，造血干/祖細胞表面標志 CD45、CD34、CD14 低表達。見圖 1c～h。
圖1
hPMSCs 細胞形態觀察及鑒定
a. 培養 24 h 的 hPMSCs（倒置顯微鏡×100）；b. 第 3 代 hPMSCs（倒置顯微鏡×100）；c～h. 流式細胞儀檢測第 3 代 hPMSCs 抗原表型特征
Figure1. Morphological observation and identification of hPMSCsa. hPMSCs after cultured for 24 hours (Inverted microscopy×100); b. The 3rd generation hPMSCs (Inverted microscopy×100); c-h. The phenotypic characteristics of the 3rd generation hPMSCs detected by flow cytometry
2.2 動物實驗
2.2.1 一般情況
實驗期間各組小鼠均存活，其中對照組呼吸平穩，反應靈敏，食欲佳，活動量大；ALI 模型組呼吸頻率明顯加快，反應遲鈍，食欲減退，活動量小；hPMSCs 治療組呼吸相對平穩，反應尚靈敏，食欲一般，活動量大。
2.2.2 小鼠肺組織病理學改變
對照組肺泡結構完整，肺泡視野清晰；ALI 模型組可見肺泡結構明顯塌陷、間隔增厚、大量炎性細胞浸潤、局部肺泡出血、肺泡內透明膜形成等改變；hPMSCs 治療組肺泡塌陷、間隔增厚有明顯改善，炎性細胞浸潤明顯減少，肺泡出血、肺泡內透明膜形成等病理狀態均明顯減輕，肺間質有少許紅細胞。見圖 2。
圖2
各組肺組織 HE 染色觀察（×100）
a. 對照組；b. ALI 模型組；c. hPMSCs 治療組
Figure2. HE staining of lung tissue in each group (×100)a. Control group; b. ALI model group; c. hPMSCs treatment group
2.2.3 小鼠肺組織 W/D 測定
對照組、ALI 模型組、hPMSCs 治療組 W/D 分別為 4.51±0.34、7.36±1.78、5.46±0.86；ALI 模型組明顯高于對照組及 hPMSCs 治療組，hPMSCs 治療組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.4 伊文思藍滲漏實驗
對照組、ALI 模型組、hPMSCs 治療組伊文思藍染液含量分別為 21.41±0.83、74.58±5.91、37.84±2.93 μg/g；ALI 模型組明顯高于對照組及 hPMSCs 治療組，hPMSCs 治療組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.5 Western blot 檢測
對照組、ALI 模型組、hPMSCs 治療組 VE-cadherin 相對表達量分別為 1.00±0.03、0.27±0.02、0.68±0.03；ALI 模型組明顯低于對照組及 hPMSCs 治療組，hPMSCs 治療組低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
Western blot 檢測 VE-cadherin 表達
Mr：相對分子質量 1：對照組 2：ALI 模型組 3：hPMSCs 治療組
Figure3. Expression of VE-cadherin protein detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Control group 2: ALI model group 3: hPMSCs treatment group
3 討論
彌漫性肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷導致肺泡-毛細血管的完整性被破壞，肺血管通透性增加引起肺泡腔塌陷、肺水增多為 ALI/ARDS 的病理學特征[13]。正常的肺血管內皮通透性需要肺血管內皮細胞來維系，其屏障功能的穩定性主要取決于內皮細胞之間的附著、內皮細胞與基底膜之間的連接以及內皮細胞的形態，這三者都高度依賴肺血管內皮結構的完整性[14]。因此，維持肺血管內皮結構完整，修復損傷內皮細胞，降低肺血管內皮通透性可能是治療 ALI/ARDS 的關鍵環節。
研究表明，創傷、感染、休克、藥物損傷等理化因素均能導致 ALI[15]，其中脂多糖為革蘭陰性菌細胞壁的重要成分，具有顯著致病作用[16]。經氣道滴注脂多糖構建 ALI 小鼠模型具有方法簡便、造模時間短的優點，能夠模擬人體 ALI 病理生理過程，可用于誘導 ALI 模型。C57BL/6 小鼠抗病能力強、成活率高，本研究選擇其作為實驗動物載體，實驗期間各組小鼠均無死亡。本研究中，ALI 模型組小鼠經氣道滴入脂多糖（2.5 mg/kg）12 h 后，肺組織病理學觀察見肺泡塌陷、肺泡間隔明顯增厚、大量炎性細胞浸潤、局部肺泡出血、肺泡內透明膜形成等改變，提示經氣道滴入脂多糖方法成功構建小鼠 ALI 模型。尾靜脈注射 hPMSCs 24 h 后，hPMSCs 治療組小鼠上述肺組織病理損傷程度均較 ALI 模型組明顯減輕，提示 hPMSCs 在促進 ALI 小鼠肺組織損傷修復中發揮重要作用，與 Guillamat-Prats 等[17]的研究結果基本一致。
肺血管內皮通透性改變與 ALI 的發展和預后密切相關[18]，ALI 治療過程中肺血管內皮通透性改善與否可作為判斷病情的重要標準之一[19]。肺組織 W/D 能反映肺水腫程度[20]，肺血管伊文思藍滲漏實驗則反映肺血管內皮完整性[21]，兩者能較準確評估肺血管內皮通透性。本研究結果顯示，ALI 模型組小鼠肺組織 W/D、伊文思藍含量均明顯提高，提示脂多糖能夠破壞肺血管內皮完整性，使其通透性增加；hPMSCs 治療組上述兩指標較 ALI 模型組明顯降低，表明 hPMSCs 能夠降低脂多糖誘導的 ALI 肺血管內皮通透性增加。
細胞間連接結構包括緊密連接和黏附連接，兩者共同維持血管內皮結構的完整性[22]。研究表明，當血管內皮細胞間連接結構遭到破壞或者合成減少時，可導致血管內皮細胞間的縫隙增寬，從而引起肺血管通透性增加[23]。VE-cadherin 是一種內皮特異性的黏附連接復合物的跨膜組分，在維持血管完整性方面起著重要作用[24-25]。因此，我們采用 Western blot 進一步檢測了小鼠肺組織 VE-cadherin 表達情況。結果顯示 hPMSCs 治療組肺組織的 VE-cadherin 表達水平明顯高于 ALI 模型組，提示hPMSCs 治療能夠提高 ALI 小鼠肺組織 VE-cadherin 表達量，這可能是 hPMSCs 降低 ALI 肺血管內皮通透性的機制之一。
綜上述，本研究結果提示 hPMSCs 移植能夠減輕脂多糖誘導的 ALI 小鼠肺組織病理損傷，降低肺血管內皮通透性，進而促進損傷肺組織修復，并進一步闡明了 hPMSCs 降低肺血管內皮通透性的可能機制，為臨床應用 hPMSCs 治療 ALI/ARDS 提供了一定理論依據。
作者貢獻：馬曉薇負責實驗設計，徐明均負責實驗實施及文章撰寫，李曉國負責實驗數據收集整理及統計分析，馬晨負責動物實驗部分，呂玉珍負責細胞實驗，馬曉娜協助實驗開展。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經寧夏醫科大學總醫院醫學科研倫理委員會批準（2018-047）。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物倫理學標準。實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（寧）2015-0001。
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指多種肺內、外致病因素導致的進行性、缺氧性呼吸衰竭，甚至發生急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1]。由于缺乏特異性治療手段，ARDS 死亡率高達 40%[2]。目前，ALI/ARDS 發病機制尚未完全明確，但已證實肺泡-毛細血管屏障遭受破壞所致的肺血管內皮通透性增加，在其發生、發展中發揮重要作用[3]。MSCs 是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，可向損傷部位遷徙并分化成損傷細胞[4]。有研究者將 MSCs 通過尾靜脈注入 ALI 模型小鼠體內，發現其不僅能夠向損傷肺組織遷移、定植，還能分化為肺泡上皮細胞發揮組織修復作用，提示 MSCs 移植有望作為一種新的 ALI 治療手段[5]。
目前，MSCs 相關研究多采用 BMSCs，但 BMSCs 存在體內遷移緩慢、增殖效率低、細胞獲取困難等問題，限制了其在臨床或動物模型研究中的應用[6]。相比 BMSCs，人胎盤 MSCs（human placental MSCs，hPMSCs）具有增殖能力強、組織獲取容易、免疫原性小等諸多優勢[7-8]。并且，我們前期研究已證實 hPMSCs 具有與 BMSCs 大致相同的表型特征和較強的分化潛能[9]。本次研究擬通過氣道滴注脂多糖制備 ALI 小鼠模型并尾靜脈注射 hPMSCs，觀察 hPMSCs 對 ALI 小鼠肺血管內皮通透性及肺組織損傷修復的影響，為 hPMSCs 用于臨床治療 ALI 提供理論依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6 周齡雄性 C57BL/6 小鼠 24 只，體質量 18～22 g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供。胎盤由寧夏醫科大學總醫院婦產科提供，產婦及家屬均知情同意。
MSCs Mesencult?-XF 無血清培養基（Stem Cell 公司，加拿大）；DMEM 培養基、FBS、胰蛋白酶、PBS（GIBCO 公司，美國）；脂多糖（Sigma 公司，美國）；流式抗體 CD105-PE、CD90-FITC、CD73-PE、CD45-FITC、CD34-FITC、CD14-FITC（BD 公司，美國）；小鼠抗兔血管內皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）抗體、小鼠抗兔 β-actin 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗（Proteintech 公司，美國）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）。
CO2 培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；干燥箱（上海光華儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械有限公司）；電子天平（Mettler Toledo 公司，瑞士）；多功能酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 hPMSCs 分離、培養及鑒定
參照文獻[10]方法分離培養 hPMSCs。取人胎盤胎兒側約 0.5 cm 厚組織，PBS 漂洗去除殘存血漬，用眼科剪剪成 1 mm×1 mm×1 mm 碎塊，加入 0.1%A 型膠原酶和 1 μg/mL DNA 酶Ⅰ，于 37℃ 水浴消化 2 h。消化后細胞懸液振蕩并過 100 目細胞篩網，以 540×g 離心 10 s，收集上清液；Hank 平衡鹽溶液洗滌 2 次，加入適量完全培養液重懸沉淀，轉入細胞培養皿中；于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。培養 48 h 后更換新鮮培養液，待細胞融合至 80%～90% 時，以 1∶3 比例傳代培養。于倒置顯微鏡下觀察 hPMSCs 培養期間的細胞形態變化。
取第 3 代正常生長 hPMSCs，調節細胞濃度至 1×107個/mL，用流式抗體 CD105-PE、CD90-FITC、CD73-PE、CD45-FITC、CD34-FITC、CD14-FITC 和同型對照抗體各 10 μL 標記，室溫避光孵育 30 min，PBS 清洗 2 次，重懸后用流式細胞儀檢測抗原表型特征。
1.3 實驗分組及方法
將 24 只 C57BL/6 小鼠隨機分成對照組、ALI 模型組、hPMSCs 治療組，每組 8 只。ALI 模型組和 hPMSCs 治療組經氣道緩慢滴注脂多糖（2.5 mg/kg），構建 ALI 小鼠模型[11]；對照組經氣道滴注相應劑量生理鹽水。滴注脂多糖 12 h 后，hPMSCs 治療組每只小鼠經尾靜脈注射 1×106個第 3 代 hPMSCs，ALI 模型組與對照組經尾靜脈注射生理鹽水。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
觀察實驗期間各組小鼠存活、精神、進食、活動、呼吸等情況。
1.4.2 小鼠肺組織病理學觀察
尾靜脈注射后 24 h，各組隨機選取 4 只小鼠采用斷頸法處死。取部分左肺組織，置于 40 g/L 多聚甲醛固定 24 h，經脫水、透明、包埋等處理，制備 5 μm 厚石蠟切片。常規 HE 染色，光鏡下觀察小鼠肺組織病理改變。
1.4.3 小鼠肺組織濕/干質量比（wet/dry mass ratio，W/D）測定
取 1.4.2 中各組小鼠右肺上葉，用濾紙吸去肺組織表面水分，稱其濕質量；置于 60℃ 恒溫烘箱干燥 48 h，至其質量恒定后，稱其干質量；計算肺組織 W/D。
1.4.4 伊文思藍滲漏實驗
參照文獻[12]方法進行實驗。用預冷 PBS 制備伊文思藍染液（100 mg/mL），將染液（30 mg/kg）經尾靜脈注入各組剩余 4 只小鼠體內，1 h 后放血處死小鼠、剖開胸腔，用預冷 PBS 經右心房反復沖洗 5 min。取右側肺組織于甲酰胺中制備組織勻漿，以萃取伊文思藍染液。將組織勻漿以 12 000×g 離心 20 min，60℃ 孵育 24 h 后收集上清液，于 630 nm 波長下檢測吸光度（A）值，根據伊文思藍標準曲線，以 A 值計算肺實質中伊文思藍染液含量。
1.4.5 Western blot 檢測肺組織 VE-cadherin 表達
取 1.4.2 中各組小鼠剩余左肺組織提取總蛋白，測定蛋白濃度。取等量總蛋白經 10%SDS-PAGE 電泳、轉膜，將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h；與小鼠抗兔 VE-cadherin 抗體、小鼠抗兔 β-actin 單克隆抗體（1∶1 000）4℃ 條件下孵育過夜；TBST 洗膜 3 次，與辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗（1∶5 000）室溫下孵育2 h；TBST 洗膜 3 次，化學發光成像系統獲取免疫反應條帶。Quantity One 圖像分析軟件分析各條帶 A 值，以與 β-actin A 值比值作為目的蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hPMSCs 細胞形態觀察及鑒定
培養 24 h，倒置顯微鏡下可見少量貼壁細胞，呈短梭形；培養 1 周后細胞逐漸增多，呈集落樣生長，漩渦狀或放射狀分布；10 d 左右細胞融合達 80%～90%，傳代后形態趨于一致。第 3 代細胞形態均一，呈長梭形，漩渦狀分布。見圖 1a、b。流式細胞儀檢測顯示，分離培養的細胞具有典型 MSCs 表型特征，干細胞表面抗原 CD105、CD90、CD73 高表達，造血干/祖細胞表面標志 CD45、CD34、CD14 低表達。見圖 1c～h。
圖1
hPMSCs 細胞形態觀察及鑒定
a. 培養 24 h 的 hPMSCs（倒置顯微鏡×100）；b. 第 3 代 hPMSCs（倒置顯微鏡×100）；c～h. 流式細胞儀檢測第 3 代 hPMSCs 抗原表型特征
Figure1. Morphological observation and identification of hPMSCsa. hPMSCs after cultured for 24 hours (Inverted microscopy×100); b. The 3rd generation hPMSCs (Inverted microscopy×100); c-h. The phenotypic characteristics of the 3rd generation hPMSCs detected by flow cytometry
2.2 動物實驗
2.2.1 一般情況
實驗期間各組小鼠均存活，其中對照組呼吸平穩，反應靈敏，食欲佳，活動量大；ALI 模型組呼吸頻率明顯加快，反應遲鈍，食欲減退，活動量小；hPMSCs 治療組呼吸相對平穩，反應尚靈敏，食欲一般，活動量大。
2.2.2 小鼠肺組織病理學改變
對照組肺泡結構完整，肺泡視野清晰；ALI 模型組可見肺泡結構明顯塌陷、間隔增厚、大量炎性細胞浸潤、局部肺泡出血、肺泡內透明膜形成等改變；hPMSCs 治療組肺泡塌陷、間隔增厚有明顯改善，炎性細胞浸潤明顯減少，肺泡出血、肺泡內透明膜形成等病理狀態均明顯減輕，肺間質有少許紅細胞。見圖 2。
圖2
各組肺組織 HE 染色觀察（×100）
a. 對照組；b. ALI 模型組；c. hPMSCs 治療組
Figure2. HE staining of lung tissue in each group (×100)a. Control group; b. ALI model group; c. hPMSCs treatment group
2.2.3 小鼠肺組織 W/D 測定
對照組、ALI 模型組、hPMSCs 治療組 W/D 分別為 4.51±0.34、7.36±1.78、5.46±0.86；ALI 模型組明顯高于對照組及 hPMSCs 治療組，hPMSCs 治療組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.4 伊文思藍滲漏實驗
對照組、ALI 模型組、hPMSCs 治療組伊文思藍染液含量分別為 21.41±0.83、74.58±5.91、37.84±2.93 μg/g；ALI 模型組明顯高于對照組及 hPMSCs 治療組，hPMSCs 治療組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.5 Western blot 檢測
對照組、ALI 模型組、hPMSCs 治療組 VE-cadherin 相對表達量分別為 1.00±0.03、0.27±0.02、0.68±0.03；ALI 模型組明顯低于對照組及 hPMSCs 治療組，hPMSCs 治療組低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
Western blot 檢測 VE-cadherin 表達
Mr：相對分子質量 1：對照組 2：ALI 模型組 3：hPMSCs 治療組
Figure3. Expression of VE-cadherin protein detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Control group 2: ALI model group 3: hPMSCs treatment group
3 討論
彌漫性肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷導致肺泡-毛細血管的完整性被破壞，肺血管通透性增加引起肺泡腔塌陷、肺水增多為 ALI/ARDS 的病理學特征[13]。正常的肺血管內皮通透性需要肺血管內皮細胞來維系，其屏障功能的穩定性主要取決于內皮細胞之間的附著、內皮細胞與基底膜之間的連接以及內皮細胞的形態，這三者都高度依賴肺血管內皮結構的完整性[14]。因此，維持肺血管內皮結構完整，修復損傷內皮細胞，降低肺血管內皮通透性可能是治療 ALI/ARDS 的關鍵環節。
研究表明，創傷、感染、休克、藥物損傷等理化因素均能導致 ALI[15]，其中脂多糖為革蘭陰性菌細胞壁的重要成分，具有顯著致病作用[16]。經氣道滴注脂多糖構建 ALI 小鼠模型具有方法簡便、造模時間短的優點，能夠模擬人體 ALI 病理生理過程，可用于誘導 ALI 模型。C57BL/6 小鼠抗病能力強、成活率高，本研究選擇其作為實驗動物載體，實驗期間各組小鼠均無死亡。本研究中，ALI 模型組小鼠經氣道滴入脂多糖（2.5 mg/kg）12 h 后，肺組織病理學觀察見肺泡塌陷、肺泡間隔明顯增厚、大量炎性細胞浸潤、局部肺泡出血、肺泡內透明膜形成等改變，提示經氣道滴入脂多糖方法成功構建小鼠 ALI 模型。尾靜脈注射 hPMSCs 24 h 后，hPMSCs 治療組小鼠上述肺組織病理損傷程度均較 ALI 模型組明顯減輕，提示 hPMSCs 在促進 ALI 小鼠肺組織損傷修復中發揮重要作用，與 Guillamat-Prats 等[17]的研究結果基本一致。
肺血管內皮通透性改變與 ALI 的發展和預后密切相關[18]，ALI 治療過程中肺血管內皮通透性改善與否可作為判斷病情的重要標準之一[19]。肺組織 W/D 能反映肺水腫程度[20]，肺血管伊文思藍滲漏實驗則反映肺血管內皮完整性[21]，兩者能較準確評估肺血管內皮通透性。本研究結果顯示，ALI 模型組小鼠肺組織 W/D、伊文思藍含量均明顯提高，提示脂多糖能夠破壞肺血管內皮完整性，使其通透性增加；hPMSCs 治療組上述兩指標較 ALI 模型組明顯降低，表明 hPMSCs 能夠降低脂多糖誘導的 ALI 肺血管內皮通透性增加。
細胞間連接結構包括緊密連接和黏附連接，兩者共同維持血管內皮結構的完整性[22]。研究表明，當血管內皮細胞間連接結構遭到破壞或者合成減少時，可導致血管內皮細胞間的縫隙增寬，從而引起肺血管通透性增加[23]。VE-cadherin 是一種內皮特異性的黏附連接復合物的跨膜組分，在維持血管完整性方面起著重要作用[24-25]。因此，我們采用 Western blot 進一步檢測了小鼠肺組織 VE-cadherin 表達情況。結果顯示 hPMSCs 治療組肺組織的 VE-cadherin 表達水平明顯高于 ALI 模型組，提示hPMSCs 治療能夠提高 ALI 小鼠肺組織 VE-cadherin 表達量，這可能是 hPMSCs 降低 ALI 肺血管內皮通透性的機制之一。
綜上述，本研究結果提示 hPMSCs 移植能夠減輕脂多糖誘導的 ALI 小鼠肺組織病理損傷，降低肺血管內皮通透性，進而促進損傷肺組織修復，并進一步闡明了 hPMSCs 降低肺血管內皮通透性的可能機制，為臨床應用 hPMSCs 治療 ALI/ARDS 提供了一定理論依據。
作者貢獻：馬曉薇負責實驗設計，徐明均負責實驗實施及文章撰寫，李曉國負責實驗數據收集整理及統計分析，馬晨負責動物實驗部分，呂玉珍負責細胞實驗，馬曉娜協助實驗開展。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經寧夏醫科大學總醫院醫學科研倫理委員會批準（2018-047）。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物倫理學標準。實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（寧）2015-0001。
