引用本文： 韓芳芳, 劉春龍, 楊常青, 孫元華. SN50 定向誘導小鼠小膠質細胞分化促進缺氧損傷神經元修復的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(4): 509-517. doi: 10.7507/1002-1892.201905131 復制
腦卒中是嚴重危害人類健康的一種常見疾病，其發病率、致殘率以及死亡率都很高，嚴重影響患者生活質量[1]。腦卒中分為缺血性及出血性兩類，可造成腦神經組織細胞缺氧損傷，最終導致不可逆損害。小膠質細胞是腦內固有免疫效應細胞，屬于神經膠質細胞，對外界刺激很敏感，可以被快速激活進而發揮其免疫相關功能。一般認為它是腦內主要免疫效應器，發揮免疫監視作用，并對受損神經組織作出級聯反應，因其免疫效應功能及分布的廣泛性，在維持中樞神經系統穩態和損傷修復中發揮極其重要的作用[2-4]。因此，調控小膠質細胞分化是神經組織損傷修復的一個研究方向。
NF-κB 能調控多種細胞分化，但能否誘導小膠質細胞向修復神經元方向分化尚未明確。本實驗通過建立小膠質細胞和腦神經元共培養體系，用 NF-κB 通路抑制劑 SN50 預處理小膠質細胞抑制 NF-κB 活性，觀察小膠質細胞分化方向，以及對缺氧損傷神經元的修復作用，為進一步尋找定向誘導小膠質細胞分化方法及探索其修復缺氧損傷神經元機制提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生 BALB/c 小鼠 10 只，雌雄不限；孕鼠購自河南省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（豫）2015-0005，于漯河醫學高等專科學校動物房臨時飼養繁殖。
DMEM/F12 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；細胞凋亡試劑盒（CW2574）、SYBR?Green 定量試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase，iNOS）兔單克隆抗體、電離鈣離子結合調節因子 1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）小鼠單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；β-actin 一抗（武漢博士德生物工程有限公司）；Bcl-2 抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；Alexa Fluor 594 標記山羊抗兔熒光二抗、Alexa Fluor 488 標記山羊抗鼠熒光二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）。實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；CO2 細胞培養系統（Thermo 公司，美國）。
1.2 細胞分離培養及鑒定
1.2.1 神經元及小膠質細胞分離培養
將 10 只新生小鼠脫頸處死，乙醇浸泡后轉移至無菌操作臺。用無菌手術器械剝離小鼠大腦半球內腦組織，將其置于 35 mm 無菌細胞培養皿中，剪刀剪碎腦組織，加入 0.25% 胰蛋白酶后反復吹打至勻漿狀。置于 37℃ 細胞培養箱中孵育 5～10 min，期間用移液器吹打 2～3 次。倒置顯微鏡下觀察，待有大量單細胞從組織塊中分散后，加入含血清的細胞培養液中和消化；然后用 200 目濾網過濾細胞，除去消化液中粘連組織。以 1 000×g 離心 10 min，收集細胞并移入細胞培養瓶培養，1 h 后成纖維細胞等易于貼壁的細胞貼壁生長后，將未貼壁的包含神經元、小膠質細胞的細胞懸液轉入另一細胞培養瓶，再培養 4 h 后混合膠質細胞貼壁生長；將含有神經元的未貼壁細胞懸液轉移至多聚賴氨酸預處理的細胞培養瓶，12 h 后待大部分神經元貼壁，更換含 1%B27 的培養液繼續培養，其中大部分細胞為神經元，用于制備神經元缺氧損傷模型。
將上一步貼壁 4 h 獲得的混合膠質細胞繼續培養 7～10 d，待細胞長滿培養瓶底時采用震蕩法收集小膠質細胞。具體方法：75 mL 細胞培養瓶中留下約 3 mL 培養液，將瓶口擰緊，置于 37℃ 恒溫搖床以 200 r/min 水平震蕩約 2 h，倒置顯微鏡下觀察見上層小膠質細胞漂浮、下層星形膠質細胞仍貼壁時終止震蕩，收集懸液中細胞轉移至新的細胞培養瓶繼續培養，即獲得小膠質細胞。
1.2.2 小膠質細胞鑒定
① 免疫熒光染色：收集震蕩分離前混合膠質細胞以及震蕩分離獲得的小膠質細胞，接種至多聚賴氨酸預處理的 24 孔板，每孔 2.5×105 個細胞。置于 37℃、5%CO2 培養箱培養 24 h 后，預冷無水乙醇固定細胞 30 min，棄去無水乙醇；PBS 漂洗后加入 0.1% Triton X-100 溶液孵育 10 min；PBS 漂洗后加入 1% 牛血清白蛋白溶液封閉 30 min；棄去牛血清白蛋白溶液，加入 1∶100 稀釋后的 iNOS 或 Iba1 一抗，4℃ 孵育過夜；次日棄去一抗溶液，PBS 漂洗 3 遍后加入 1∶200 稀釋的熒光二抗，37℃ 孵育 1 h，然后加入 DAPI 繼續染色 10 min，PBS 漂洗后熒光顯微鏡下觀察。
② qRT-PCR 檢測：取震蕩分離前混合膠質細胞以及震蕩分離獲得的小膠質細胞，棄培養基，PBS 清洗后加入 Trizol 室溫裂解細胞，然后提取 RNA 并用 oligo dT 作為下游引物反轉錄，以 β-actin 為內參，檢測小膠質細胞指示基因 iNOS、CD32 和 IL-10 的相對表達量，引物序列見表 1。
表1
qRT-PCR 引物序列及大小
Table1.
Sequence and size of qRT-PCR primers
1.3 小膠質細胞 SN50 處理及觀測
取震蕩分離獲得的小膠質細胞，以 5×105 個/孔接種至 12 孔板中，分別采用 20 μmol/L SN50（實驗組）及無菌蒸餾水（對照組）處理后進行觀測。
1.3.1 Western blot 檢測 SN50 對小膠質細胞 NF-κB 的調控
取兩組處理 12 h 細胞，加入含蛋白酶抑制劑的 RIPA 蛋白裂解液（50 μL/孔），置于冰上裂解 15 min；加入 5×蛋白上樣緩沖液，充分吹打細胞并轉移至 EP 管中，水浴鍋中煮沸 5 min 后備用。取兔源 NF-κB 一抗（1∶500 稀釋）4℃ 孵育過夜，羊抗兔二抗（1∶5 000 稀釋）室溫孵育 2 h，然后以化學發光液發光拍照；內參為鼠源抗 β-actin 一抗（1∶1 000 稀釋）、羊抗鼠二抗（1∶5 000 稀釋）。Image J 軟件分析灰度值，計算 NF-κB 蛋白相對表達量。
1.3.2 qRT-PCR 檢測 SN50 對小膠質細胞相關分化基因表達的影響
取兩組處理 6、12 h 細胞，按照 1.2.2 中方法提取 RNA，以提示小膠質細胞向 M1 型分化的 iNOS、CD11b 和向 M2 型分化的 IL-10、CD206 引物進行 qRT-PCR，檢測 SN50 對小膠質細胞定向分化的影響。引物序列見表 1。
1.3.3 流式細胞術檢測 SN50 對小膠質細胞凋亡的影響
取兩組處理 12 h 細胞，棄細胞培養液，PBS 清洗 2 遍，采用 0.25% 胰蛋白酶于 37℃ 消化 3～5 min。用 PBS 輕輕吹打，將細胞從細胞培養皿洗脫下來，以 1 000×g 離心 3 min；PBS 清洗 1 遍，加入稀釋的 Binding Buffer 溶液重懸細胞；依次添加 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 溶液和 10 μL 碘化丙啶溶液室溫避光孵育 15 min，上機檢測計算細胞凋亡率。
1.4 神經元缺氧損傷模型制備及觀測
1.4.1 神經元缺氧損傷模型制備
將培養神經元的細胞培養皿置于自制的密閉盒子內，盒子上面接 2 個通氣軟管，其中 1 個為進氣口，另外 1 個為排氣口。神經元缺氧損傷模型制備步驟：首先更換無血清基礎培養液；然后從進氣口內注入 N2，待盒子內充滿 N2 后，依次關閉排氣口和進氣口；將密閉盒子置入 CO2 培養箱培養 30 min 后取出細胞培養皿，即獲得神經元缺氧損傷模型。
1.4.2 MTT 檢測缺氧損傷對神經元活力的影響
將神經元以 2×104 個/孔密度接種至 96 孔板，按照上述方法缺氧處理 0、2、6、12、24、48 h 后，各取 9 孔加入 MTT 溶液孵育 4 h，PBS 清洗后每孔加入 150 μL DMSO，搖床震蕩 10 min 后酶標儀測定于 490 nm 波長處吸光度（A）值。以未加 MTT 細胞作為空白對照，按照公式計算細胞存活率，公式：（缺氧損傷細胞 A 值–空白對照細胞 A 值）/（正常對照細胞 A 值–空白對照細胞 A 值）×100%。根據 MTT 檢測結果，選擇細胞發生損傷時間點作為后續缺氧損傷模型制備中缺氧處理時間。
1.4.3 Western blot 檢測缺氧損傷后神經元凋亡相關蛋白的變化
取缺氧損傷 12 h 神經元和正常神經元，參照 1.3.1 方法檢測缺氧損傷對神經元凋亡相關蛋白 Bcl-2 和 Caspase-3、cleaved-Caspase-3 的影響，其中 Bcl-2 一抗 1∶500 稀釋、Caspase-3 一抗 1∶1 000 稀釋。
1.4.4 流式細胞術檢測缺氧損傷對神經元凋亡的影響
取缺氧損傷 12 h 神經元和正常神經元，參照 1.3.3 方法檢測細胞凋亡情況。
1.5 小膠質細胞與神經元共培養觀測
1.5.1 實驗分組及方法
將震蕩分離獲得的小膠質細胞分別采用 20 μmol/L SN50（實驗組）及等量無菌蒸餾水（對照組）處理 12 h 后，PBS 漂洗、1 000×g 離心 3 min，收集細胞更換正常培養液懸浮計數。取 2.5×105 個缺氧損傷 12 h 神經元，分別與 5×105個上述兩組小膠質細胞共培養，于 37℃、5%CO2 培養箱培養 24 h 后進行相關檢測。
1.5.2 觀測指標
① 參照 1.4.2 MTT 檢測方法，觀察共培養體系中 SN50 誘導對細胞活力的影響。② 參照 1.4.3 Western blot 方法，檢測共培養體系中 SN50 誘導對細胞凋亡相關蛋白 Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 表達的影響。③ 參照 1.4.4 流式細胞術方法，檢測共培養體系中 SN50 誘導對細胞凋亡的影響。
1.6 統計學方法
采用 Graphpad Prism5 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 小膠質細胞鑒定
免疫熒光染色顯示與震蕩分離前混合膠質細胞相比，通過震蕩法獲得的細胞大部分為 iNOS、Iba1 陽性細胞。見圖 1、2。qRT-PCR 檢測示震蕩分離后獲得的小膠質細胞 iNOS、CD32 和 IL-10 mRNA 相對表達量分別為 1 035.16±286.06、1 001.79±519.21、965.13±72.20，均顯著高于震蕩分離前混合膠質細胞的 46.45±2.81、179.79±64.09、229.79±30.52，差異均有統計學意義（t=6.314，P=0.003；t=3.115，P=0.036；t=18.010，P=0.000）。以上結果表明，通過震蕩分離得到小膠質細胞。
圖1
iNOS 免疫熒光染色鑒定小膠質細胞（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為 iNOS、DAPI 染色及二者重疊 a. 震蕩分離前混合膠質細胞；b. 震蕩分離后小膠質細胞
Figure1. Immunofluorescence staining of iNOS for microglia identification (Fluorescence microscopy×200)From left to right for iNOS staining, DAPI staining, and merge a. Microglia before separated; b. Microglia after separated
圖2
Iba1 免疫熒光染色鑒定小膠質細胞（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為 Iba1、DAPI 染色及二者重疊 a. 震蕩分離前混合膠質細胞；b. 震蕩分離后小膠質細胞
Figure2. Immunofluorescence staining of Iba1 for microglia identification (Fluorescence microscopy×200)From left to right for Iba1 staining, DAPI staining, and merge a. Microglia before separated; b. Microglia after separated
2.2 SN50 處理小膠質細胞觀測
Western blot 檢測實驗組及對照組 NF-κB 蛋白相對表達量分別為 0.39±0.12 和 1.00±0.05，差異有統計學意義（t=8.883，P=0.001）。見圖 3。
圖3
Western blot 檢測 SN50 處理后小膠質細胞 NF-κB 蛋白表達
1：對照組 2：實驗組
Figure3. Expression of NF-κB protein in microglia before and after treated with SN50 detected by Western blot1: Control group 2: Experimental group
qRT-PCR 檢測顯示，SN50 處理 6、12 h 時與對照組相比，實驗組 iNOS、CD11b mRNA 相對表達量降低，IL-10 和 CD206 mRNA 相對表達量提高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
qRT-PCR 檢測 SN50 處理不同時間后小膠質細胞 iNOS、CD11b、IL-10 和 CD206 mRNA 相對表達量
a. iNOS；b. CD11b；c. IL-10；d. CD206
Figure4. Relative expressions of iNOS, CD11b, IL-10, and CD206 mRNAs in microglia after treated with SN50 detected by qRT-PCRa. iNOS;b. CD11b; c. IL-10; d. CD206
流式細胞術檢測，實驗組及對照組細胞凋亡率分別為 5.41%±2.90% 和 5.52%±0.92%，差異無統計學意義（t=0.062，P=0.954）。見圖 5。
圖5
流式細胞術檢測 SN50 處理前后小膠質細胞凋亡情況a. 對照組；b. 實驗組
Figure5.
The apoptosis of microglia before and after treated with SN50 detected by flow cytometry
a. Control group; b. Experimental group
2.3 神經元缺氧損傷模型觀測
2.3.1 MTT 檢測
隨著缺氧時間延長，細胞活力逐漸降低。其中，缺氧 2、6 h 時細胞 A 值與 0 h 時比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；但缺氧 12 h 后各時間點與 0 h 時比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。故后續實驗選擇缺氧處理 12 h 的神經元缺氧損傷模型。
圖6
MTT 檢測缺氧不同時間點神經元活力
Figure6.
Cell viability of neurons after anoxic treatment detected by MTT assay
2.3.2 Western blot 檢測
正常神經元 Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白相對表達量分別為 0.70±0.03、0.83±0.13、0.19±0.04，缺氧后分別為 0.17±0.06、0.59±0.12、0.37±0.13，差異均有統計學意義（t=15.160，P=0.000；t=3.650，P=0.022；t=3.205，P=0.033）。見圖 7。
圖7
Western blot 檢測缺氧損傷前后神經元 Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白表達
1：正常神經元；2：缺氧損傷神經元
Figure7. Relative expressions of Bcl-2, Caspase-3, and cleaved-Caspase-3 proteins of neurons before and after anoxic treatment detected by Western blot1: Normal neurons 2: Neurons after anoxic treatment
2.3.3 流式細胞術檢測
正常神經元及缺氧損傷神經元凋亡率分別 3.84%±1.03% 及 13.09%±3.13%，差異有統計學意義（t=5.404，P=0.006）。見圖 8。
圖8
流式細胞術檢測缺氧損傷前后神經元凋亡情況
a. 正常神經元；b. 缺氧損傷神經元
Figure8. The apoptosis of neurons before and after anoxic treatment detected by flow cytometrya. Normal neurons; b. Neurons after anoxic treatment
2.4 小膠質細胞與神經元共培養觀測
MTT 檢測示實驗組及對照組 A 值分別為 1.02±0.04 及 0.89±0.06，差異有統計學意義（t=3.837，P=0.019）。
Western blot 檢測示對照組 Bcl-2、Caspase-3 和 cleaved-Caspase-3 蛋白相對表達量分別為 0.72±0.12、0.39±0.01、0.51±0.02，實驗組分別為 1.21±0.03、0.62±0.12、0.28±0.08，差異均有統計學意義（t=5.282，P=0.006；t=3.689，P=0.021；t=4.989，P=0.008）。見圖 9。
圖9
Western blot 檢測共培養后細胞 Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白表達
1：對照組 2：實驗組
Figure9. Relative expressions of Bcl-2, Caspase-3, and cleaved-Caspase-3 proteins after co-culture detected by Western blot1：Control group 2：Experimental group
流式細胞術檢測對照組及實驗組細胞凋亡率分別為 10.60%±2.56% 及 6.16%±1.24%，差異有統計學意義（t=3.615，P=0.022）。見圖 10。
圖10
流式細胞儀檢測共培養后細胞凋亡情況
a. 對照組；b. 實驗組
Figure10. Cells apoptosis after co-culture detected by flow cytometrya. Control group; b. Experimental group
3 討論
腦卒中會導致腦神經缺氧損傷，最終發生神經元凋亡[5-7]。本研究采用自制密室隔斷氧氣供應來誘導神經元缺氧損傷，經檢測發現缺氧神經元發生凋亡，并且隨缺氧時間延長，細胞凋亡程度增加。
小膠質細胞可合成和分泌一系列細胞因子、蛋白質或其他生物活性分子，這些因子及物質中有些發揮神經保護作用，有些具有神經毒性作用[8]，還有許多分子的生物學活性尚未確定。因此，小膠質細胞在腦卒中的作用目前尚未明確[9]。如何將小膠質細胞誘導成發揮神經組織修復作用的特定狀態，具有重要意義。有研究顯示腦組織中 NF-κB 表達量和神經元損傷成正相關[10]。NF-κB 是誘導炎癥調節的一個重要因子，存在于多種神經元中，當神經組織缺氧損傷時，可以被特異性激活[11]。已有研究證明，通過激活 NF-κB 信號通路能夠誘導體外混合培養的神經元損傷[12]；NF-κB 信號通路能夠調節細胞分化[13]，激活 NF-κB 能夠導致巨噬細胞由 M2 型向 M1 型轉變，而 M1 型巨噬細胞能引起炎癥反應和細胞損傷[14-17]。
SN50 能夠特異性作用于 NF-κB 并抑制其激活，因而被廣泛用于抑制細胞的免疫反應[9, 18]。在荷瘤小鼠實驗中，SN50 能夠通過抑制 NF-κB 信號通路激活來增強 5-氟尿嘧啶的抑瘤效果[19]；在呼吸機誘導的大鼠肺損傷模型中，SN50 能夠抑制 NF-κB?信號通路激活，進而減小肺損傷[9]；體外細胞培養模型中，SN50 能夠抑制 P 物質對脊髓星形膠質細胞的活化，降低 NO、TNF-α、IL-1β 表達[20]；在小鼠創傷性腦損傷模型中，SN50 能夠參與腦組織的修復，調控受損細胞的修復[21]。
研究表明，小膠質細胞向 M2 型分化時能起到保護腦組織的作用[1, 22-23]，特定分化的小膠質細胞在腦卒中發生后，對神經元起到保護作用，也能修復脊髓損傷[24]，因此定向誘導小膠質細胞分化可能為治療腦組織缺氧損傷提供一個新方向。但小膠質細胞的分化和調控十分復雜，能夠引起其分化的因素也很多。許多細胞和藥物等均有修復和影響其他細胞再生的作用[24-27]。本研究根據小膠質細胞貼壁不牢的特性，通過機械震蕩法獲得高純度小膠質細胞，該方法操作相對簡單，避免了試劑等對細胞的影響。然后采用 SN50 體外抑制小膠質細胞 NF-κB 信號通路的激活，結果表明 SN50 能抑制小膠質細胞向 M1 型分化，傾向于向 M2 型分化。再將 SN50 處理后的小膠質細胞與缺氧損傷神經元混合培養，結果顯示通過抑制小膠質細胞 NF-κB 信號通路激活，能夠促進小膠質細胞對受損神經元的修復作用。
體內環境中小膠質細胞和神經元是共存的，很難評價藥物是直接修復神經組織，還是先激活小膠質細胞，然后通過小膠質細胞發揮修復神經損傷的作用。本研究通過建立體外模型，單獨探討小膠質細胞對缺氧損傷神經元的修復作用，避免誘導藥物直接作用于受損的神經元，能更好地評價小膠質細胞在神經修復時發揮的作用。本研究結果顯示，SN50 處理后的小膠質細胞傾向于向 M2 型分化，并且和缺氧損傷神經元共培養時，凋亡細胞比例減少，表明此時的小膠質細胞具有了一定的修復神經元損傷能力。
作者貢獻：韓芳芳設計并完成實驗、數據分析及文章撰寫；劉春龍對實驗設計提供指導，針對文章內容進行知識性修正；楊常青參與部分實驗操作以及實驗材料準備，參與部分數據的處理和分析；孫元華參與部分實驗材料的準備以及文字修改工作。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
腦卒中是嚴重危害人類健康的一種常見疾病，其發病率、致殘率以及死亡率都很高，嚴重影響患者生活質量[1]。腦卒中分為缺血性及出血性兩類，可造成腦神經組織細胞缺氧損傷，最終導致不可逆損害。小膠質細胞是腦內固有免疫效應細胞，屬于神經膠質細胞，對外界刺激很敏感，可以被快速激活進而發揮其免疫相關功能。一般認為它是腦內主要免疫效應器，發揮免疫監視作用，并對受損神經組織作出級聯反應，因其免疫效應功能及分布的廣泛性，在維持中樞神經系統穩態和損傷修復中發揮極其重要的作用[2-4]。因此，調控小膠質細胞分化是神經組織損傷修復的一個研究方向。
NF-κB 能調控多種細胞分化，但能否誘導小膠質細胞向修復神經元方向分化尚未明確。本實驗通過建立小膠質細胞和腦神經元共培養體系，用 NF-κB 通路抑制劑 SN50 預處理小膠質細胞抑制 NF-κB 活性，觀察小膠質細胞分化方向，以及對缺氧損傷神經元的修復作用，為進一步尋找定向誘導小膠質細胞分化方法及探索其修復缺氧損傷神經元機制提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生 BALB/c 小鼠 10 只，雌雄不限；孕鼠購自河南省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（豫）2015-0005，于漯河醫學高等專科學校動物房臨時飼養繁殖。
DMEM/F12 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；細胞凋亡試劑盒（CW2574）、SYBR?Green 定量試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthetase，iNOS）兔單克隆抗體、電離鈣離子結合調節因子 1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）小鼠單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；β-actin 一抗（武漢博士德生物工程有限公司）；Bcl-2 抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；Alexa Fluor 594 標記山羊抗兔熒光二抗、Alexa Fluor 488 標記山羊抗鼠熒光二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）。實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；CO2 細胞培養系統（Thermo 公司，美國）。
1.2 細胞分離培養及鑒定
1.2.1 神經元及小膠質細胞分離培養
將 10 只新生小鼠脫頸處死，乙醇浸泡后轉移至無菌操作臺。用無菌手術器械剝離小鼠大腦半球內腦組織，將其置于 35 mm 無菌細胞培養皿中，剪刀剪碎腦組織，加入 0.25% 胰蛋白酶后反復吹打至勻漿狀。置于 37℃ 細胞培養箱中孵育 5～10 min，期間用移液器吹打 2～3 次。倒置顯微鏡下觀察，待有大量單細胞從組織塊中分散后，加入含血清的細胞培養液中和消化；然后用 200 目濾網過濾細胞，除去消化液中粘連組織。以 1 000×g 離心 10 min，收集細胞并移入細胞培養瓶培養，1 h 后成纖維細胞等易于貼壁的細胞貼壁生長后，將未貼壁的包含神經元、小膠質細胞的細胞懸液轉入另一細胞培養瓶，再培養 4 h 后混合膠質細胞貼壁生長；將含有神經元的未貼壁細胞懸液轉移至多聚賴氨酸預處理的細胞培養瓶，12 h 后待大部分神經元貼壁，更換含 1%B27 的培養液繼續培養，其中大部分細胞為神經元，用于制備神經元缺氧損傷模型。
將上一步貼壁 4 h 獲得的混合膠質細胞繼續培養 7～10 d，待細胞長滿培養瓶底時采用震蕩法收集小膠質細胞。具體方法：75 mL 細胞培養瓶中留下約 3 mL 培養液，將瓶口擰緊，置于 37℃ 恒溫搖床以 200 r/min 水平震蕩約 2 h，倒置顯微鏡下觀察見上層小膠質細胞漂浮、下層星形膠質細胞仍貼壁時終止震蕩，收集懸液中細胞轉移至新的細胞培養瓶繼續培養，即獲得小膠質細胞。
1.2.2 小膠質細胞鑒定
① 免疫熒光染色：收集震蕩分離前混合膠質細胞以及震蕩分離獲得的小膠質細胞，接種至多聚賴氨酸預處理的 24 孔板，每孔 2.5×105 個細胞。置于 37℃、5%CO2 培養箱培養 24 h 后，預冷無水乙醇固定細胞 30 min，棄去無水乙醇；PBS 漂洗后加入 0.1% Triton X-100 溶液孵育 10 min；PBS 漂洗后加入 1% 牛血清白蛋白溶液封閉 30 min；棄去牛血清白蛋白溶液，加入 1∶100 稀釋后的 iNOS 或 Iba1 一抗，4℃ 孵育過夜；次日棄去一抗溶液，PBS 漂洗 3 遍后加入 1∶200 稀釋的熒光二抗，37℃ 孵育 1 h，然后加入 DAPI 繼續染色 10 min，PBS 漂洗后熒光顯微鏡下觀察。
② qRT-PCR 檢測：取震蕩分離前混合膠質細胞以及震蕩分離獲得的小膠質細胞，棄培養基，PBS 清洗后加入 Trizol 室溫裂解細胞，然后提取 RNA 并用 oligo dT 作為下游引物反轉錄，以 β-actin 為內參，檢測小膠質細胞指示基因 iNOS、CD32 和 IL-10 的相對表達量，引物序列見表 1。
表1
qRT-PCR 引物序列及大小
Table1.
Sequence and size of qRT-PCR primers
1.3 小膠質細胞 SN50 處理及觀測
取震蕩分離獲得的小膠質細胞，以 5×105 個/孔接種至 12 孔板中，分別采用 20 μmol/L SN50（實驗組）及無菌蒸餾水（對照組）處理后進行觀測。
1.3.1 Western blot 檢測 SN50 對小膠質細胞 NF-κB 的調控
取兩組處理 12 h 細胞，加入含蛋白酶抑制劑的 RIPA 蛋白裂解液（50 μL/孔），置于冰上裂解 15 min；加入 5×蛋白上樣緩沖液，充分吹打細胞并轉移至 EP 管中，水浴鍋中煮沸 5 min 后備用。取兔源 NF-κB 一抗（1∶500 稀釋）4℃ 孵育過夜，羊抗兔二抗（1∶5 000 稀釋）室溫孵育 2 h，然后以化學發光液發光拍照；內參為鼠源抗 β-actin 一抗（1∶1 000 稀釋）、羊抗鼠二抗（1∶5 000 稀釋）。Image J 軟件分析灰度值，計算 NF-κB 蛋白相對表達量。
1.3.2 qRT-PCR 檢測 SN50 對小膠質細胞相關分化基因表達的影響
取兩組處理 6、12 h 細胞，按照 1.2.2 中方法提取 RNA，以提示小膠質細胞向 M1 型分化的 iNOS、CD11b 和向 M2 型分化的 IL-10、CD206 引物進行 qRT-PCR，檢測 SN50 對小膠質細胞定向分化的影響。引物序列見表 1。
1.3.3 流式細胞術檢測 SN50 對小膠質細胞凋亡的影響
取兩組處理 12 h 細胞，棄細胞培養液，PBS 清洗 2 遍，采用 0.25% 胰蛋白酶于 37℃ 消化 3～5 min。用 PBS 輕輕吹打，將細胞從細胞培養皿洗脫下來，以 1 000×g 離心 3 min；PBS 清洗 1 遍，加入稀釋的 Binding Buffer 溶液重懸細胞；依次添加 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 溶液和 10 μL 碘化丙啶溶液室溫避光孵育 15 min，上機檢測計算細胞凋亡率。
1.4 神經元缺氧損傷模型制備及觀測
1.4.1 神經元缺氧損傷模型制備
將培養神經元的細胞培養皿置于自制的密閉盒子內，盒子上面接 2 個通氣軟管，其中 1 個為進氣口，另外 1 個為排氣口。神經元缺氧損傷模型制備步驟：首先更換無血清基礎培養液；然后從進氣口內注入 N2，待盒子內充滿 N2 后，依次關閉排氣口和進氣口；將密閉盒子置入 CO2 培養箱培養 30 min 后取出細胞培養皿，即獲得神經元缺氧損傷模型。
1.4.2 MTT 檢測缺氧損傷對神經元活力的影響
將神經元以 2×104 個/孔密度接種至 96 孔板，按照上述方法缺氧處理 0、2、6、12、24、48 h 后，各取 9 孔加入 MTT 溶液孵育 4 h，PBS 清洗后每孔加入 150 μL DMSO，搖床震蕩 10 min 后酶標儀測定于 490 nm 波長處吸光度（A）值。以未加 MTT 細胞作為空白對照，按照公式計算細胞存活率，公式：（缺氧損傷細胞 A 值–空白對照細胞 A 值）/（正常對照細胞 A 值–空白對照細胞 A 值）×100%。根據 MTT 檢測結果，選擇細胞發生損傷時間點作為后續缺氧損傷模型制備中缺氧處理時間。
1.4.3 Western blot 檢測缺氧損傷后神經元凋亡相關蛋白的變化
取缺氧損傷 12 h 神經元和正常神經元，參照 1.3.1 方法檢測缺氧損傷對神經元凋亡相關蛋白 Bcl-2 和 Caspase-3、cleaved-Caspase-3 的影響，其中 Bcl-2 一抗 1∶500 稀釋、Caspase-3 一抗 1∶1 000 稀釋。
1.4.4 流式細胞術檢測缺氧損傷對神經元凋亡的影響
取缺氧損傷 12 h 神經元和正常神經元，參照 1.3.3 方法檢測細胞凋亡情況。
1.5 小膠質細胞與神經元共培養觀測
1.5.1 實驗分組及方法
將震蕩分離獲得的小膠質細胞分別采用 20 μmol/L SN50（實驗組）及等量無菌蒸餾水（對照組）處理 12 h 后，PBS 漂洗、1 000×g 離心 3 min，收集細胞更換正常培養液懸浮計數。取 2.5×105 個缺氧損傷 12 h 神經元，分別與 5×105個上述兩組小膠質細胞共培養，于 37℃、5%CO2 培養箱培養 24 h 后進行相關檢測。
1.5.2 觀測指標
① 參照 1.4.2 MTT 檢測方法，觀察共培養體系中 SN50 誘導對細胞活力的影響。② 參照 1.4.3 Western blot 方法，檢測共培養體系中 SN50 誘導對細胞凋亡相關蛋白 Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 表達的影響。③ 參照 1.4.4 流式細胞術方法，檢測共培養體系中 SN50 誘導對細胞凋亡的影響。
1.6 統計學方法
采用 Graphpad Prism5 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 小膠質細胞鑒定
免疫熒光染色顯示與震蕩分離前混合膠質細胞相比，通過震蕩法獲得的細胞大部分為 iNOS、Iba1 陽性細胞。見圖 1、2。qRT-PCR 檢測示震蕩分離后獲得的小膠質細胞 iNOS、CD32 和 IL-10 mRNA 相對表達量分別為 1 035.16±286.06、1 001.79±519.21、965.13±72.20，均顯著高于震蕩分離前混合膠質細胞的 46.45±2.81、179.79±64.09、229.79±30.52，差異均有統計學意義（t=6.314，P=0.003；t=3.115，P=0.036；t=18.010，P=0.000）。以上結果表明，通過震蕩分離得到小膠質細胞。
圖1
iNOS 免疫熒光染色鑒定小膠質細胞（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為 iNOS、DAPI 染色及二者重疊 a. 震蕩分離前混合膠質細胞；b. 震蕩分離后小膠質細胞
Figure1. Immunofluorescence staining of iNOS for microglia identification (Fluorescence microscopy×200)From left to right for iNOS staining, DAPI staining, and merge a. Microglia before separated; b. Microglia after separated
圖2
Iba1 免疫熒光染色鑒定小膠質細胞（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為 Iba1、DAPI 染色及二者重疊 a. 震蕩分離前混合膠質細胞；b. 震蕩分離后小膠質細胞
Figure2. Immunofluorescence staining of Iba1 for microglia identification (Fluorescence microscopy×200)From left to right for Iba1 staining, DAPI staining, and merge a. Microglia before separated; b. Microglia after separated
2.2 SN50 處理小膠質細胞觀測
Western blot 檢測實驗組及對照組 NF-κB 蛋白相對表達量分別為 0.39±0.12 和 1.00±0.05，差異有統計學意義（t=8.883，P=0.001）。見圖 3。
圖3
Western blot 檢測 SN50 處理后小膠質細胞 NF-κB 蛋白表達
1：對照組 2：實驗組
Figure3. Expression of NF-κB protein in microglia before and after treated with SN50 detected by Western blot1: Control group 2: Experimental group
qRT-PCR 檢測顯示，SN50 處理 6、12 h 時與對照組相比，實驗組 iNOS、CD11b mRNA 相對表達量降低，IL-10 和 CD206 mRNA 相對表達量提高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
qRT-PCR 檢測 SN50 處理不同時間后小膠質細胞 iNOS、CD11b、IL-10 和 CD206 mRNA 相對表達量
a. iNOS；b. CD11b；c. IL-10；d. CD206
Figure4. Relative expressions of iNOS, CD11b, IL-10, and CD206 mRNAs in microglia after treated with SN50 detected by qRT-PCRa. iNOS;b. CD11b; c. IL-10; d. CD206
流式細胞術檢測，實驗組及對照組細胞凋亡率分別為 5.41%±2.90% 和 5.52%±0.92%，差異無統計學意義（t=0.062，P=0.954）。見圖 5。
圖5
流式細胞術檢測 SN50 處理前后小膠質細胞凋亡情況a. 對照組；b. 實驗組
Figure5.
The apoptosis of microglia before and after treated with SN50 detected by flow cytometry
a. Control group; b. Experimental group
2.3 神經元缺氧損傷模型觀測
2.3.1 MTT 檢測
隨著缺氧時間延長，細胞活力逐漸降低。其中，缺氧 2、6 h 時細胞 A 值與 0 h 時比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；但缺氧 12 h 后各時間點與 0 h 時比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。故后續實驗選擇缺氧處理 12 h 的神經元缺氧損傷模型。
圖6
MTT 檢測缺氧不同時間點神經元活力
Figure6.
Cell viability of neurons after anoxic treatment detected by MTT assay
2.3.2 Western blot 檢測
正常神經元 Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白相對表達量分別為 0.70±0.03、0.83±0.13、0.19±0.04，缺氧后分別為 0.17±0.06、0.59±0.12、0.37±0.13，差異均有統計學意義（t=15.160，P=0.000；t=3.650，P=0.022；t=3.205，P=0.033）。見圖 7。
圖7
Western blot 檢測缺氧損傷前后神經元 Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白表達
1：正常神經元；2：缺氧損傷神經元
Figure7. Relative expressions of Bcl-2, Caspase-3, and cleaved-Caspase-3 proteins of neurons before and after anoxic treatment detected by Western blot1: Normal neurons 2: Neurons after anoxic treatment
2.3.3 流式細胞術檢測
正常神經元及缺氧損傷神經元凋亡率分別 3.84%±1.03% 及 13.09%±3.13%，差異有統計學意義（t=5.404，P=0.006）。見圖 8。
圖8
流式細胞術檢測缺氧損傷前后神經元凋亡情況
a. 正常神經元；b. 缺氧損傷神經元
Figure8. The apoptosis of neurons before and after anoxic treatment detected by flow cytometrya. Normal neurons; b. Neurons after anoxic treatment
2.4 小膠質細胞與神經元共培養觀測
MTT 檢測示實驗組及對照組 A 值分別為 1.02±0.04 及 0.89±0.06，差異有統計學意義（t=3.837，P=0.019）。
Western blot 檢測示對照組 Bcl-2、Caspase-3 和 cleaved-Caspase-3 蛋白相對表達量分別為 0.72±0.12、0.39±0.01、0.51±0.02，實驗組分別為 1.21±0.03、0.62±0.12、0.28±0.08，差異均有統計學意義（t=5.282，P=0.006；t=3.689，P=0.021；t=4.989，P=0.008）。見圖 9。
圖9
Western blot 檢測共培養后細胞 Bcl-2、Caspase-3、cleaved-Caspase-3 蛋白表達
1：對照組 2：實驗組
Figure9. Relative expressions of Bcl-2, Caspase-3, and cleaved-Caspase-3 proteins after co-culture detected by Western blot1：Control group 2：Experimental group
流式細胞術檢測對照組及實驗組細胞凋亡率分別為 10.60%±2.56% 及 6.16%±1.24%，差異有統計學意義（t=3.615，P=0.022）。見圖 10。
圖10
流式細胞儀檢測共培養后細胞凋亡情況
a. 對照組；b. 實驗組
Figure10. Cells apoptosis after co-culture detected by flow cytometrya. Control group; b. Experimental group
3 討論
腦卒中會導致腦神經缺氧損傷，最終發生神經元凋亡[5-7]。本研究采用自制密室隔斷氧氣供應來誘導神經元缺氧損傷，經檢測發現缺氧神經元發生凋亡，并且隨缺氧時間延長，細胞凋亡程度增加。
小膠質細胞可合成和分泌一系列細胞因子、蛋白質或其他生物活性分子，這些因子及物質中有些發揮神經保護作用，有些具有神經毒性作用[8]，還有許多分子的生物學活性尚未確定。因此，小膠質細胞在腦卒中的作用目前尚未明確[9]。如何將小膠質細胞誘導成發揮神經組織修復作用的特定狀態，具有重要意義。有研究顯示腦組織中 NF-κB 表達量和神經元損傷成正相關[10]。NF-κB 是誘導炎癥調節的一個重要因子，存在于多種神經元中，當神經組織缺氧損傷時，可以被特異性激活[11]。已有研究證明，通過激活 NF-κB 信號通路能夠誘導體外混合培養的神經元損傷[12]；NF-κB 信號通路能夠調節細胞分化[13]，激活 NF-κB 能夠導致巨噬細胞由 M2 型向 M1 型轉變，而 M1 型巨噬細胞能引起炎癥反應和細胞損傷[14-17]。
SN50 能夠特異性作用于 NF-κB 并抑制其激活，因而被廣泛用于抑制細胞的免疫反應[9, 18]。在荷瘤小鼠實驗中，SN50 能夠通過抑制 NF-κB 信號通路激活來增強 5-氟尿嘧啶的抑瘤效果[19]；在呼吸機誘導的大鼠肺損傷模型中，SN50 能夠抑制 NF-κB?信號通路激活，進而減小肺損傷[9]；體外細胞培養模型中，SN50 能夠抑制 P 物質對脊髓星形膠質細胞的活化，降低 NO、TNF-α、IL-1β 表達[20]；在小鼠創傷性腦損傷模型中，SN50 能夠參與腦組織的修復，調控受損細胞的修復[21]。
研究表明，小膠質細胞向 M2 型分化時能起到保護腦組織的作用[1, 22-23]，特定分化的小膠質細胞在腦卒中發生后，對神經元起到保護作用，也能修復脊髓損傷[24]，因此定向誘導小膠質細胞分化可能為治療腦組織缺氧損傷提供一個新方向。但小膠質細胞的分化和調控十分復雜，能夠引起其分化的因素也很多。許多細胞和藥物等均有修復和影響其他細胞再生的作用[24-27]。本研究根據小膠質細胞貼壁不牢的特性，通過機械震蕩法獲得高純度小膠質細胞，該方法操作相對簡單，避免了試劑等對細胞的影響。然后采用 SN50 體外抑制小膠質細胞 NF-κB 信號通路的激活，結果表明 SN50 能抑制小膠質細胞向 M1 型分化，傾向于向 M2 型分化。再將 SN50 處理后的小膠質細胞與缺氧損傷神經元混合培養，結果顯示通過抑制小膠質細胞 NF-κB 信號通路激活，能夠促進小膠質細胞對受損神經元的修復作用。
體內環境中小膠質細胞和神經元是共存的，很難評價藥物是直接修復神經組織，還是先激活小膠質細胞，然后通過小膠質細胞發揮修復神經損傷的作用。本研究通過建立體外模型，單獨探討小膠質細胞對缺氧損傷神經元的修復作用，避免誘導藥物直接作用于受損的神經元，能更好地評價小膠質細胞在神經修復時發揮的作用。本研究結果顯示，SN50 處理后的小膠質細胞傾向于向 M2 型分化，并且和缺氧損傷神經元共培養時，凋亡細胞比例減少，表明此時的小膠質細胞具有了一定的修復神經元損傷能力。
作者貢獻：韓芳芳設計并完成實驗、數據分析及文章撰寫；劉春龍對實驗設計提供指導，針對文章內容進行知識性修正；楊常青參與部分實驗操作以及實驗材料準備，參與部分數據的處理和分析；孫元華參與部分實驗材料的準備以及文字修改工作。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
