引用本文： 陳聞波, 蔡江瑜, 孫亞英, 陳俊, 陳世益. 應用干細胞旁分泌效應治療膝部骨關節炎的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(11): 1446-1451. doi: 10.7507/1002-1892.201903074 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是最常見的慢性疾病之一，可導致關節軟骨及軟骨下骨退行性改變[1]。年齡、體質量、運動損傷是導致 OA 的主要病因[2]。隨著老齡化人口及肥胖人口數目的增加、人民群眾體育運動參與度的提升，預計在 2020 年，OA 將成為全球范圍第四大致殘誘因[3]。
OA 對患者勞動能力，乃至生活自理能力的損害，源于病程中關節軟骨的退變。而現階段研究認為，上述病理過程是關節腔內炎性反應、軟骨細胞凋亡、軟骨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）喪失以及軟骨下骨微結構改變等多因素共同作用的結果。由此導致患者受累關節伴隨活動出現疼痛、腫脹、僵硬及活動度受限等癥狀，且癥狀隨病程進展而加重，嚴重影響患者生活質量[4]。迄今為止，臨床實踐中尚沒有能有效延緩 OA 進展的藥物治療手段。常規使用的非甾體類抗炎藥及皮質類固醇激素只能暫時緩解癥狀，有研究報道該治療可能間接促使患者在癥狀緩解后過度活動受累關節，從而進一步加重病情[5]。并且，考慮到老年患者同時患 OA 和心血管疾病等基礎疾病的概率較高，治療時常因顧慮病患的身體狀況，使得所用藥物的劑量與種類受限，以致影響療效[6]。此外，根據國際骨關節炎研究協會（OARSI）于 2014 年發布的膝部 OA 非手術治療指南，關節腔內注射玻璃酸鈉、口服氨基葡萄糖及針灸、電療等物理治療手段對于膝部 OA 癥狀的緩解效果并不明確，更難以延緩疾病發展[7]。在膝部 OA 的手術治療方案中，膝關節置換術的療效顯著，但僅適用于病情處于終末期的老年患者[8]。其余手術方式，包括馬賽克鑲嵌成形術、微骨折術、自體軟骨移植術等不僅無法避免供區病變，術后的再生軟骨也多為性能不佳的纖維軟骨[9]。綜上，當下亟需一種能有效逆轉或阻滯膝關節 OA 進展的治療手段，以應對逐漸老齡化、肥胖化的社會人口結構改變。
干細胞療法近年來被廣泛應用于再生醫學領域[10]，并在治療膝關節 OA 方面取得一定進展。但進一步研究發現，在外源性加入的干細胞懸液中，干細胞旁分泌效應所分泌的一系列營養物質在修復過程中發揮了重要作用[1]。本文就當下應用干細胞旁分泌效應治療膝關節 OA 的研究進展綜述如下。
1 干細胞療法的應用
早在 2003 年，Murphy 等[10]首次發現，通過切除前交叉韌帶和內側半月板得到的山羊膝關節 OA 模型，經過連續 20 周關節腔內注射自體 BMSCs 懸液后，能觀察到內側半月板的再生，且關節軟骨退變、骨贅增生以及軟骨下骨硬化等狀況都較安慰劑組有顯著改善。此后，2008 年，Centeno 等[11]發表的病例報告報道了膝關節腔內注射干細胞懸液在人體內的首次應用，注射后 24 周經 MRI 觀察，患者的關節軟骨、半月板都出現了明顯的再生跡象，且患者關節活動度、疼痛情況都有顯著改善。Jo 等[12]則在 2009 年首次開展了應用膝關節腔內注射自體 MSCs 懸液治療膝關節 OA 的前瞻性隊列研究，共納入 18 例患者，并報道了治療后 2 年的隨訪結果。他們發現高劑量組中，膝關節功能評分、MRI 影像學評分與疼痛評分均有顯著改善，也未發生任何與治療相關的不良反應。
盡管現階段干細胞療法的相關研究已取得矚目成果，但該療法的安全性在學界仍未達成共識。Zhang 等[13]在使用 MSCs 治療大鼠軟骨缺損時，發現實驗大鼠對異體來源的 MSCs 產生了明顯的免疫排斥反應。而 Nori 等[14]則在應用多能干細胞治療小鼠脊髓損傷長達 3 個月后，于組織學切片中觀察到腫瘤形成，且經免疫組織化學分析證實腫瘤確實來源于植入體內的多能干細胞。因此，在上述安全隱患未完全消除前，干細胞療法尚無法于臨床實踐中大范圍推廣。不僅如此，干細胞療法從細胞制備、儲存直到最終植入患者體內，其間需全程嚴格監控并保證細胞活性及增殖分化潛能，由此產生的高昂治療成本勢必將造成患者沉重的經濟負擔[15]。
2 干細胞旁分泌效應
隨著應用干細胞治療膝關節 OA 的相關研究不斷深入，有研究者運用細胞示蹤技術發現，植入體內的 MSCs 僅有少數最終分化成為再生的軟骨細胞[16]，繼而假設其治療作用極可能源于 MSCs 植入受損部位后所分泌的包括生長因子、趨化因子、微囊泡、外泌體，甚至 ECM 等營養物質。Wu 等[17]則通過共培養 MSCs 與初代軟骨細胞，觀察到 MSCs 能通過自身旁分泌效應促進軟骨細胞增殖及軟骨基質沉積，且其自身極少發生成軟骨分化。該發現為直接使用干細胞可能出現的免疫排斥反應、致瘤風險等難題提供了新的解決思路。
3 干細胞條件培養液（conditioned medium，CM）的應用
干細胞經旁分泌效應向胞外所釋放產物均存在于其培養液中，因此研究人員常將 MSCs 置于無血清 DMEM 培養基培養 48 h 后，加以離心并取上清液作為經脫細胞處理的干細胞 CM，以研究該效應在各疾病治療中所起的作用[18]。Gnecchi 等[19]在 2006 年首次發現并報道了干細胞 CM 的治療作用。該研究表明，干細胞 CM 不僅在體外實驗中能有效抑制由缺氧所誘導的心肌細胞凋亡，同時能增強心肌細胞收縮能力；體內實驗中更顯著控制了心肌梗死灶的大小，且實驗組動物的心室功能較對照組有顯著提升。2012 年，干細胞 CM 與 OA 之間的關聯首次得到關注。van Buul 等[20]在體外實驗中觀察到，干細胞 CM 能有效抑制軟骨細胞和滑膜細胞的炎性反應，以及基質金屬蛋白酶 1（matrix metalloproteinases 1，MMP-1）及 MMP-13 的表達。Platas 等[21]通過體外實驗進一步發現，干細胞 CM 對軟骨細胞及其基質的上述保護作用，是通過抑制 NF-κB 信號通路的激活而發揮；并能夠通過加強 Sirtuin 1 的表達減少 p53 乙酰化，繼而緩解氧化應激產物的堆積，最終抑制 OA 所造成的軟骨細胞早衰[22]。Hassan Famian 等[23]發現將軟骨細胞置于人臍帶 Wharton’s Jelly 來源的干細胞 CM 中培養，能使促軟骨基質合成的相關基因表達增強，而軟骨基質的含量是維持關節軟骨性能的關鍵所在。
除軟骨基質的喪失，早在 1986 年 Radin 等[24]提出，膝關節 OA 病程中因成骨作用受抑制導致軟骨下骨的過度吸收及重塑，從而使關節軟骨受力狀態發生變異，是關節軟骨退變的另一主要原因。而 Chang 等[25]已證實干細胞 CM 能在大鼠鎖骨缺損模型的愈合過程中發揮促成骨效應，因此有理由推測干細胞 CM 極可能憑其促成骨性能，在體內膝關節 OA 模型中通過減少軟骨下骨吸收而延緩膝關節 OA 的發展。然而，目前仍鮮有將干細胞 CM 運用于膝關節 OA 動物模型的體內實驗報道，是未來值得進一步開展研究的方向。
4 干細胞來源 ECM 的應用
ECM 是干細胞分泌的組分之一，由多種膠原纖維、層粘連蛋白及糖蛋白構成，是整合素、粘連蛋白、盤狀結構域受體等黏附分子的作用底物，為細胞間信號傳導提供了場所，繼而影響了一系列重要細胞行為[26]。干細胞所分泌 ECM 在防治 OA 中的作用，首先由 Pei 等[27]于 2012 年發現，該研究表明脫細胞處理后的滑膜來源干細胞 ECM，能為離體關節軟骨細胞提供有利于擴增的三維微環境；此后 Pei 等[28]進一步在體外實驗中發現，脫細胞處理后的滑膜來源干細胞 ECM 能通過減輕 OA 病理環境下受累細胞的氧化損傷，從而防止人體關節滑膜中固有的、且數量有限的滑膜干細胞因受氧化損傷發生病理性衰老，繼而增強滑膜中固有干細胞的擴增以及向軟骨細胞定向分化的潛能。Zhang 等[29]則揭示了脫細胞 ECM 促滑膜內固有干細胞定向成軟骨的效應，與 Wnt 以及 MAPK 信號通路密切相關。Yang 等[30]通過組織工程學方法將脫細胞處理后的干細胞 ECM 制成生物支架并種植軟骨細胞后置于小鼠皮下，于術后 2 周觀察到該支架上的新生軟骨含量遠高于對照組，成功在體內證明干細胞 ECM 具有促軟骨細胞增殖的作用。
5 細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的應用
雖早在 1967 年 Wolf 就于血液系統中發現了被稱為“血小板塵埃（platelet dust）”的 EVs，但直到近年，EVs 才成為干細胞旁分泌效應的研究焦點。EVs 由細胞所分泌，具有完整膜結構，且其中裝載有多種蛋白質、核酸、脂質等物質，是細胞間信號傳導的重要媒介。而由干細胞所分泌的 EVs 則被認為是干細胞旁分泌效應在多種病理狀態下發揮治療作用的關鍵[31]。目前 EVs 已在腫瘤治療、免疫調節、組織再生及藥物運載等領域展現了良好的臨床應用前景，但在 OA 及軟骨修復領域所開展的研究尚處于起步階段。
關于 EVs 的分類，目前學界仍未達成廣泛共識。但多數學者將其中直接通過出芽方式釋放，膜結構所表達標志物與親代細胞相同的 EVs 稱作微囊泡，其直徑在 50～1 000 nm 范圍內；而近年備受關注的外泌體，實則來源于細胞胞吞作用形成的內體。內體膜內陷后進一步形成多泡體，而后經胞吐作用釋放至胞外，最終產生直徑為 30～150 nm 的外泌體[32]。目前與 EVs 相關的研究多圍繞上述兩種亞型展開。
5.1 外泌體的應用
外泌體作為近年生物醫學領域的研究熱點，在 OA 防治領域取得的研究成果也相對豐碩。外泌體對于膝關節 OA 的療效，首先在一系列動物實驗中得以彰顯。Zhang 等[15]開展的系列研究將胚胎干細胞來源外泌體應用于大鼠膝關節軟骨缺損模型。術后 12 周，大鼠軟骨缺損處有明顯的新生透明軟骨生成，且大體及組織學形態均顯著優于對照組；并隨后發現外泌體通過促進 CD73 介導 AKT 及 ERK 信號通路的腺苷活化，增強了軟骨細胞的增殖和定向遷移能力；同時通過免疫調節作用促進更多 M2 表型巨噬細胞表達，并抑制 M1 表型以緩解關節腔內炎性反應。然而其促軟骨基質合成的相關機制仍不明確[33]。Wang 等[5]又將胚胎干細胞來源外泌體應用于小鼠膝部 OA 模型，證實其能有效促進軟骨基質主要成分Ⅱ型膠原的合成，同時抑制血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶 5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS-5；軟骨基質另一主要成分聚蛋白多糖的主要水解酶）的表達以維持軟骨基質穩態，從而延緩關節軟骨退變。
同時，研究者也關注到外泌體的來源對于其療效具有一定影響。根據 Zhu 等[34]的研究結果，誘導性多能干細胞所分泌外泌體，相較于滑膜干細胞來源外泌體，在體外實驗中能更好地促進軟骨細胞的增殖和遷移；而在小鼠膝關節 OA 模型中，誘導性多能干細胞來源外泌體對于關節軟骨的保護作用也顯著優于滑膜干細胞來源外泌體，并由此判斷誘導性多能干細胞應是更為優質的干細胞外泌體來源。
為獲取更為理想的外泌體來源，有研究者選擇使用基因修飾手段對干細胞加以改造。Tao 等[35]發現滑膜來源干細胞所釋放外泌體在體外實驗中，能通過 Wnt5a/b-YAP 信號通路增強軟骨細胞的增殖和遷移能力，但同時抑制了 SOX9 基因的表達，從而使軟骨基質的合成受限。對此，作者通過基因修飾手段使滑膜干細胞過表達微小 RNA（micro RNA，miR）-140-5p，并發現經修飾的干細胞所分泌外泌體能有效抑制 RalA 蛋白的表達，從而逆轉 SOX9 基因所受抑制，使軟骨基質的合成效率得到恢復。在體內實驗中，過表達 miR-140-5p 的干細胞所分泌外泌體對于 OA 大鼠的治療效果，也顯著優于未經修飾的干細胞所分泌外泌體。Mao 等[36]則在體內外實驗中證實，過表達 miR-92a-3p 的人 MSCs 所分泌外泌體能通過抑制 Wnt5a 的表達，從而促進損傷處的成軟骨作用。而 Liu 等[37]揭示了過表達 KLF3-AS1 的 MSCs 所分泌外泌體，可通過 miR-206/GIT1 通路抑制軟骨細胞凋亡。
此外，現階段動物實驗所采用給藥方法多為關節腔內注射。因關節軟骨的再生以及對于膝關節 OA 的防治均非一日之功，但經注射進入關節腔的外泌體卻無法長時間維持于病損處，因此注射需定期進行，增加了實驗操作的繁雜程度以及關節腔內感染的風險。為此，Liu 等[38]將干細胞來源外泌體與一種光誘導亞胺交聯水凝膠進行整合，制成脫細胞組織補片，置于軟骨缺損部位。結果表明，該補片能與周圍軟骨基質相互整合，并促使分化而成的軟骨細胞及新生軟骨基質沉積于受損部位，最終有效促進了軟骨缺損處的修復，為外泌體相關研究與生物材料領域的學科交叉提供了新思路。
5.2 微囊泡的應用
微囊泡在近年來被發現與胰島素抵抗、2 型糖尿病的發病、動脈粥樣硬化的形成密切相關，且對心血管代謝疾病具有一定的治療作用[39]。Cosenza 等[40]于 2017 年首次對比了 BMSCs 分泌的微囊泡與外泌體在治療 OA 中的療效。該體外實驗中，兩者同樣促進了軟骨細胞基質的生成，抑制了 MMP-13 及 ADAMTS-5 等促軟骨基質降解的酶的表達，也同時起到了抗炎、抗軟骨細胞凋亡等作用，且兩者的作用效果并無顯著差異；兩者注射于 OA 小鼠膝關節腔內所起到的抗炎效果及對關節軟骨的保護作用亦是相當。在機制研究方面，Xiang 等[41]證實，BMSCs 分泌的微囊泡能通過 SphK1-S1P-S1PR1 信號通路增強軟骨細胞增殖能力，并抑制軟骨細胞在炎性環境中的凋亡水平，且軟骨細胞對于微囊泡的攝取是通過 CD44 糖蛋白進行介導。Tofi?o-Vian 等[42]則發現微囊泡通過上調膜聯蛋白 A1 發揮了抗炎及軟骨保護作用，逐步揭示了微囊泡與外泌體不同的作用機制。
6 結語
干細胞旁分泌效應對膝關節 OA 的治療效果在不同層面的多項研究中都已有所彰顯。其作用機制包括對關節腔內炎性反應、軟骨細胞凋亡、軟骨基質水解的有效抑制，以及促進軟骨基質合成、原位固有干細胞向軟骨細胞定向分化、并向損傷部位定向遷移等修復過程。然而目前仍少有研究對不同分泌組分間各自治療療效進行全面比對，或探究不同組分在治療過程中的協同或拮抗等相互作用。此外，就現階段研究結論而言，該療法雖較傳統干細胞療法更為安全且經濟，具有較高的臨床轉化價值，但其性能仍可通過基因修飾手段或輔以組織工程學手段進一步改良。且其治療作用和安全性仍需在與人體膝關節運動模式更為相近的動物模型，例如山羊、靈長類動物體內等加以驗證，方可進入臨床研究階段。
作者貢獻：陳聞波負責文獻檢索和初稿撰寫；蔡江瑜、孫亞英負責初稿的審閱和潤色；陳俊負責組織分配工作；陳世益參與提出綜述題目，審閱指導全文的撰寫并組織分配工作。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是最常見的慢性疾病之一，可導致關節軟骨及軟骨下骨退行性改變[1]。年齡、體質量、運動損傷是導致 OA 的主要病因[2]。隨著老齡化人口及肥胖人口數目的增加、人民群眾體育運動參與度的提升，預計在 2020 年，OA 將成為全球范圍第四大致殘誘因[3]。
OA 對患者勞動能力，乃至生活自理能力的損害，源于病程中關節軟骨的退變。而現階段研究認為，上述病理過程是關節腔內炎性反應、軟骨細胞凋亡、軟骨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）喪失以及軟骨下骨微結構改變等多因素共同作用的結果。由此導致患者受累關節伴隨活動出現疼痛、腫脹、僵硬及活動度受限等癥狀，且癥狀隨病程進展而加重，嚴重影響患者生活質量[4]。迄今為止，臨床實踐中尚沒有能有效延緩 OA 進展的藥物治療手段。常規使用的非甾體類抗炎藥及皮質類固醇激素只能暫時緩解癥狀，有研究報道該治療可能間接促使患者在癥狀緩解后過度活動受累關節，從而進一步加重病情[5]。并且，考慮到老年患者同時患 OA 和心血管疾病等基礎疾病的概率較高，治療時常因顧慮病患的身體狀況，使得所用藥物的劑量與種類受限，以致影響療效[6]。此外，根據國際骨關節炎研究協會（OARSI）于 2014 年發布的膝部 OA 非手術治療指南，關節腔內注射玻璃酸鈉、口服氨基葡萄糖及針灸、電療等物理治療手段對于膝部 OA 癥狀的緩解效果并不明確，更難以延緩疾病發展[7]。在膝部 OA 的手術治療方案中，膝關節置換術的療效顯著，但僅適用于病情處于終末期的老年患者[8]。其余手術方式，包括馬賽克鑲嵌成形術、微骨折術、自體軟骨移植術等不僅無法避免供區病變，術后的再生軟骨也多為性能不佳的纖維軟骨[9]。綜上，當下亟需一種能有效逆轉或阻滯膝關節 OA 進展的治療手段，以應對逐漸老齡化、肥胖化的社會人口結構改變。
干細胞療法近年來被廣泛應用于再生醫學領域[10]，并在治療膝關節 OA 方面取得一定進展。但進一步研究發現，在外源性加入的干細胞懸液中，干細胞旁分泌效應所分泌的一系列營養物質在修復過程中發揮了重要作用[1]。本文就當下應用干細胞旁分泌效應治療膝關節 OA 的研究進展綜述如下。
1 干細胞療法的應用
早在 2003 年，Murphy 等[10]首次發現，通過切除前交叉韌帶和內側半月板得到的山羊膝關節 OA 模型，經過連續 20 周關節腔內注射自體 BMSCs 懸液后，能觀察到內側半月板的再生，且關節軟骨退變、骨贅增生以及軟骨下骨硬化等狀況都較安慰劑組有顯著改善。此后，2008 年，Centeno 等[11]發表的病例報告報道了膝關節腔內注射干細胞懸液在人體內的首次應用，注射后 24 周經 MRI 觀察，患者的關節軟骨、半月板都出現了明顯的再生跡象，且患者關節活動度、疼痛情況都有顯著改善。Jo 等[12]則在 2009 年首次開展了應用膝關節腔內注射自體 MSCs 懸液治療膝關節 OA 的前瞻性隊列研究，共納入 18 例患者，并報道了治療后 2 年的隨訪結果。他們發現高劑量組中，膝關節功能評分、MRI 影像學評分與疼痛評分均有顯著改善，也未發生任何與治療相關的不良反應。
盡管現階段干細胞療法的相關研究已取得矚目成果，但該療法的安全性在學界仍未達成共識。Zhang 等[13]在使用 MSCs 治療大鼠軟骨缺損時，發現實驗大鼠對異體來源的 MSCs 產生了明顯的免疫排斥反應。而 Nori 等[14]則在應用多能干細胞治療小鼠脊髓損傷長達 3 個月后，于組織學切片中觀察到腫瘤形成，且經免疫組織化學分析證實腫瘤確實來源于植入體內的多能干細胞。因此，在上述安全隱患未完全消除前，干細胞療法尚無法于臨床實踐中大范圍推廣。不僅如此，干細胞療法從細胞制備、儲存直到最終植入患者體內，其間需全程嚴格監控并保證細胞活性及增殖分化潛能，由此產生的高昂治療成本勢必將造成患者沉重的經濟負擔[15]。
2 干細胞旁分泌效應
隨著應用干細胞治療膝關節 OA 的相關研究不斷深入，有研究者運用細胞示蹤技術發現，植入體內的 MSCs 僅有少數最終分化成為再生的軟骨細胞[16]，繼而假設其治療作用極可能源于 MSCs 植入受損部位后所分泌的包括生長因子、趨化因子、微囊泡、外泌體，甚至 ECM 等營養物質。Wu 等[17]則通過共培養 MSCs 與初代軟骨細胞，觀察到 MSCs 能通過自身旁分泌效應促進軟骨細胞增殖及軟骨基質沉積，且其自身極少發生成軟骨分化。該發現為直接使用干細胞可能出現的免疫排斥反應、致瘤風險等難題提供了新的解決思路。
3 干細胞條件培養液（conditioned medium，CM）的應用
干細胞經旁分泌效應向胞外所釋放產物均存在于其培養液中，因此研究人員常將 MSCs 置于無血清 DMEM 培養基培養 48 h 后，加以離心并取上清液作為經脫細胞處理的干細胞 CM，以研究該效應在各疾病治療中所起的作用[18]。Gnecchi 等[19]在 2006 年首次發現并報道了干細胞 CM 的治療作用。該研究表明，干細胞 CM 不僅在體外實驗中能有效抑制由缺氧所誘導的心肌細胞凋亡，同時能增強心肌細胞收縮能力；體內實驗中更顯著控制了心肌梗死灶的大小，且實驗組動物的心室功能較對照組有顯著提升。2012 年，干細胞 CM 與 OA 之間的關聯首次得到關注。van Buul 等[20]在體外實驗中觀察到，干細胞 CM 能有效抑制軟骨細胞和滑膜細胞的炎性反應，以及基質金屬蛋白酶 1（matrix metalloproteinases 1，MMP-1）及 MMP-13 的表達。Platas 等[21]通過體外實驗進一步發現，干細胞 CM 對軟骨細胞及其基質的上述保護作用，是通過抑制 NF-κB 信號通路的激活而發揮；并能夠通過加強 Sirtuin 1 的表達減少 p53 乙酰化，繼而緩解氧化應激產物的堆積，最終抑制 OA 所造成的軟骨細胞早衰[22]。Hassan Famian 等[23]發現將軟骨細胞置于人臍帶 Wharton’s Jelly 來源的干細胞 CM 中培養，能使促軟骨基質合成的相關基因表達增強，而軟骨基質的含量是維持關節軟骨性能的關鍵所在。
除軟骨基質的喪失，早在 1986 年 Radin 等[24]提出，膝關節 OA 病程中因成骨作用受抑制導致軟骨下骨的過度吸收及重塑，從而使關節軟骨受力狀態發生變異，是關節軟骨退變的另一主要原因。而 Chang 等[25]已證實干細胞 CM 能在大鼠鎖骨缺損模型的愈合過程中發揮促成骨效應，因此有理由推測干細胞 CM 極可能憑其促成骨性能，在體內膝關節 OA 模型中通過減少軟骨下骨吸收而延緩膝關節 OA 的發展。然而，目前仍鮮有將干細胞 CM 運用于膝關節 OA 動物模型的體內實驗報道，是未來值得進一步開展研究的方向。
4 干細胞來源 ECM 的應用
ECM 是干細胞分泌的組分之一，由多種膠原纖維、層粘連蛋白及糖蛋白構成，是整合素、粘連蛋白、盤狀結構域受體等黏附分子的作用底物，為細胞間信號傳導提供了場所，繼而影響了一系列重要細胞行為[26]。干細胞所分泌 ECM 在防治 OA 中的作用，首先由 Pei 等[27]于 2012 年發現，該研究表明脫細胞處理后的滑膜來源干細胞 ECM，能為離體關節軟骨細胞提供有利于擴增的三維微環境；此后 Pei 等[28]進一步在體外實驗中發現，脫細胞處理后的滑膜來源干細胞 ECM 能通過減輕 OA 病理環境下受累細胞的氧化損傷，從而防止人體關節滑膜中固有的、且數量有限的滑膜干細胞因受氧化損傷發生病理性衰老，繼而增強滑膜中固有干細胞的擴增以及向軟骨細胞定向分化的潛能。Zhang 等[29]則揭示了脫細胞 ECM 促滑膜內固有干細胞定向成軟骨的效應，與 Wnt 以及 MAPK 信號通路密切相關。Yang 等[30]通過組織工程學方法將脫細胞處理后的干細胞 ECM 制成生物支架并種植軟骨細胞后置于小鼠皮下，于術后 2 周觀察到該支架上的新生軟骨含量遠高于對照組，成功在體內證明干細胞 ECM 具有促軟骨細胞增殖的作用。
5 細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的應用
雖早在 1967 年 Wolf 就于血液系統中發現了被稱為“血小板塵埃（platelet dust）”的 EVs，但直到近年，EVs 才成為干細胞旁分泌效應的研究焦點。EVs 由細胞所分泌，具有完整膜結構，且其中裝載有多種蛋白質、核酸、脂質等物質，是細胞間信號傳導的重要媒介。而由干細胞所分泌的 EVs 則被認為是干細胞旁分泌效應在多種病理狀態下發揮治療作用的關鍵[31]。目前 EVs 已在腫瘤治療、免疫調節、組織再生及藥物運載等領域展現了良好的臨床應用前景，但在 OA 及軟骨修復領域所開展的研究尚處于起步階段。
關于 EVs 的分類，目前學界仍未達成廣泛共識。但多數學者將其中直接通過出芽方式釋放，膜結構所表達標志物與親代細胞相同的 EVs 稱作微囊泡，其直徑在 50～1 000 nm 范圍內；而近年備受關注的外泌體，實則來源于細胞胞吞作用形成的內體。內體膜內陷后進一步形成多泡體，而后經胞吐作用釋放至胞外，最終產生直徑為 30～150 nm 的外泌體[32]。目前與 EVs 相關的研究多圍繞上述兩種亞型展開。
5.1 外泌體的應用
外泌體作為近年生物醫學領域的研究熱點，在 OA 防治領域取得的研究成果也相對豐碩。外泌體對于膝關節 OA 的療效，首先在一系列動物實驗中得以彰顯。Zhang 等[15]開展的系列研究將胚胎干細胞來源外泌體應用于大鼠膝關節軟骨缺損模型。術后 12 周，大鼠軟骨缺損處有明顯的新生透明軟骨生成，且大體及組織學形態均顯著優于對照組；并隨后發現外泌體通過促進 CD73 介導 AKT 及 ERK 信號通路的腺苷活化，增強了軟骨細胞的增殖和定向遷移能力；同時通過免疫調節作用促進更多 M2 表型巨噬細胞表達，并抑制 M1 表型以緩解關節腔內炎性反應。然而其促軟骨基質合成的相關機制仍不明確[33]。Wang 等[5]又將胚胎干細胞來源外泌體應用于小鼠膝部 OA 模型，證實其能有效促進軟骨基質主要成分Ⅱ型膠原的合成，同時抑制血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶 5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS-5；軟骨基質另一主要成分聚蛋白多糖的主要水解酶）的表達以維持軟骨基質穩態，從而延緩關節軟骨退變。
同時，研究者也關注到外泌體的來源對于其療效具有一定影響。根據 Zhu 等[34]的研究結果，誘導性多能干細胞所分泌外泌體，相較于滑膜干細胞來源外泌體，在體外實驗中能更好地促進軟骨細胞的增殖和遷移；而在小鼠膝關節 OA 模型中，誘導性多能干細胞來源外泌體對于關節軟骨的保護作用也顯著優于滑膜干細胞來源外泌體，并由此判斷誘導性多能干細胞應是更為優質的干細胞外泌體來源。
為獲取更為理想的外泌體來源，有研究者選擇使用基因修飾手段對干細胞加以改造。Tao 等[35]發現滑膜來源干細胞所釋放外泌體在體外實驗中，能通過 Wnt5a/b-YAP 信號通路增強軟骨細胞的增殖和遷移能力，但同時抑制了 SOX9 基因的表達，從而使軟骨基質的合成受限。對此，作者通過基因修飾手段使滑膜干細胞過表達微小 RNA（micro RNA，miR）-140-5p，并發現經修飾的干細胞所分泌外泌體能有效抑制 RalA 蛋白的表達，從而逆轉 SOX9 基因所受抑制，使軟骨基質的合成效率得到恢復。在體內實驗中，過表達 miR-140-5p 的干細胞所分泌外泌體對于 OA 大鼠的治療效果，也顯著優于未經修飾的干細胞所分泌外泌體。Mao 等[36]則在體內外實驗中證實，過表達 miR-92a-3p 的人 MSCs 所分泌外泌體能通過抑制 Wnt5a 的表達，從而促進損傷處的成軟骨作用。而 Liu 等[37]揭示了過表達 KLF3-AS1 的 MSCs 所分泌外泌體，可通過 miR-206/GIT1 通路抑制軟骨細胞凋亡。
此外，現階段動物實驗所采用給藥方法多為關節腔內注射。因關節軟骨的再生以及對于膝關節 OA 的防治均非一日之功，但經注射進入關節腔的外泌體卻無法長時間維持于病損處，因此注射需定期進行，增加了實驗操作的繁雜程度以及關節腔內感染的風險。為此，Liu 等[38]將干細胞來源外泌體與一種光誘導亞胺交聯水凝膠進行整合，制成脫細胞組織補片，置于軟骨缺損部位。結果表明，該補片能與周圍軟骨基質相互整合，并促使分化而成的軟骨細胞及新生軟骨基質沉積于受損部位，最終有效促進了軟骨缺損處的修復，為外泌體相關研究與生物材料領域的學科交叉提供了新思路。
5.2 微囊泡的應用
微囊泡在近年來被發現與胰島素抵抗、2 型糖尿病的發病、動脈粥樣硬化的形成密切相關，且對心血管代謝疾病具有一定的治療作用[39]。Cosenza 等[40]于 2017 年首次對比了 BMSCs 分泌的微囊泡與外泌體在治療 OA 中的療效。該體外實驗中，兩者同樣促進了軟骨細胞基質的生成，抑制了 MMP-13 及 ADAMTS-5 等促軟骨基質降解的酶的表達，也同時起到了抗炎、抗軟骨細胞凋亡等作用，且兩者的作用效果并無顯著差異；兩者注射于 OA 小鼠膝關節腔內所起到的抗炎效果及對關節軟骨的保護作用亦是相當。在機制研究方面，Xiang 等[41]證實，BMSCs 分泌的微囊泡能通過 SphK1-S1P-S1PR1 信號通路增強軟骨細胞增殖能力，并抑制軟骨細胞在炎性環境中的凋亡水平，且軟骨細胞對于微囊泡的攝取是通過 CD44 糖蛋白進行介導。Tofi?o-Vian 等[42]則發現微囊泡通過上調膜聯蛋白 A1 發揮了抗炎及軟骨保護作用，逐步揭示了微囊泡與外泌體不同的作用機制。
6 結語
干細胞旁分泌效應對膝關節 OA 的治療效果在不同層面的多項研究中都已有所彰顯。其作用機制包括對關節腔內炎性反應、軟骨細胞凋亡、軟骨基質水解的有效抑制，以及促進軟骨基質合成、原位固有干細胞向軟骨細胞定向分化、并向損傷部位定向遷移等修復過程。然而目前仍少有研究對不同分泌組分間各自治療療效進行全面比對，或探究不同組分在治療過程中的協同或拮抗等相互作用。此外，就現階段研究結論而言，該療法雖較傳統干細胞療法更為安全且經濟，具有較高的臨床轉化價值，但其性能仍可通過基因修飾手段或輔以組織工程學手段進一步改良。且其治療作用和安全性仍需在與人體膝關節運動模式更為相近的動物模型，例如山羊、靈長類動物體內等加以驗證，方可進入臨床研究階段。
作者貢獻：陳聞波負責文獻檢索和初稿撰寫；蔡江瑜、孫亞英負責初稿的審閱和潤色；陳俊負責組織分配工作；陳世益參與提出綜述題目，審閱指導全文的撰寫并組織分配工作。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。