引用本文： 魏長征, 楊小元, 王曉彤. 溫敏性殼聚糖神經導管的綠色制備方案及性能研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(11): 1439-1445. doi: 10.7507/1002-1892.201904009 復制
近年來，利用神經導管修復周圍神經缺損的研究取得了較大進展[1-2]。天然高分子材料因具有良好的生物相容性和可塑性等諸多優點[3-4]，是制備神經導管的首選材料之一，然而其力學強度較弱和降解時間較快。為彌補上述不足，有學者提出采用化學交聯劑處理，但存在細胞毒性問題[5]；與合成高分子復合又會導致體內降解速率不匹配。因此，如何采取一種綠色無毒而又簡便的工藝以有效提高天然高分子神經導管的強度，是一項亟待解決的難題。
溫敏性殼聚糖是一種對溫度具有高度響應性的智能水凝膠，保留了幾丁糖優良的生物相容性和抑制纖維化、抗炎等其他生物學特性[6-8]。最近研究表明，殼聚糖具有離子特異性效應[9]，提示可以通過改變殼聚糖體系中的離子強度，在不引入化學交聯劑的情況下就可調控其機械強度和降解性能。因此，本研究以溫敏性殼聚糖為主要原料，利用其離子特異性效應設計高強度天然高分子神經導管的綠色制備工藝，并對制備的導管材料力學強度、降解性能、微觀結構、細胞相容性和體內修復效果進行詳細表征，以期為殼聚糖神經導管的產品轉化和下一步應用于體內修復周圍神經缺損奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料及儀器
溫敏性殼聚糖（上海其勝生物制劑有限公司）；NaCl （江蘇勤奮藥業有限公司）；DMEM 培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；溶菌酶（>20 000 U/mg，上海源聚生物科技有限公司）；溴化鉀、多聚甲醛（Sigma 公司，美國）；戊二醛（上海凌峰化學試劑有限公司）；死/活細胞染色試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；無水乙醇（上海凌峰化學試劑有限公司）；甲苯胺藍、HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。RSC96 大鼠雪旺細胞（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。
冷凍干燥機（上海億倍實業有限公司）；掃描電鏡（HITACHI 公司，日本）；CO2 恒溫培養箱（Memmert 公司，德國）；熒光倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；紅外光譜儀（Thermo 公司，美國）；AL-3000 力學測試儀（中國高鐵檢測儀器公司）；游標卡尺（精度 0.02 mm；Mitutoyo 公司，日本）。
1.2 神經導管制備方法
將濃度為 0.8%（W/V）的溫敏性殼聚糖溶液低溫下灌至帶芯棒的定型裝置中。芯棒外徑 1 mm，采用相變材料涂層。然后，將裝置置于 20～60℃ 環境 60 min 進行凝膠化和賦形。將初步成型的凝膠置于濃度為 0.9%（W/V）的 NaCl 溶液中進行離子相變，分別取 37℃ 下浸泡 0、4、12、24、36、48、72 h 得到的彈性凝膠體，轉入純化水中清洗 10 min，以去除過多鹽分，得到神經導管中間品。最后，將中間品放入冷凍干燥機中進行干燥，得到神經導管，經60Co 輻照滅菌備用。
1.3 體外觀測
1.3.1 神經導管大體觀察及外徑測量
取于 NaCl 溶液中浸泡 0～72 h 獲得的神經導管，大體觀察其顏色，并采用游標卡尺測量其外徑。實驗重復 6 次。
1.3.2 力學強度測試
取 1.2 中于 NaCl 溶液中浸泡 0～72 h 獲得的神經導管，采用力學測試儀表征其軸向拉伸強度。具體步驟：取相同內徑、外徑的濕態神經導管樣品，用夾具夾緊，保持夾具間神經導管長度為 2 cm，軸向與拉力方向平行，室溫下以 2 mm/min 的速度進行拉伸，直至樣品被拉斷，得到單軸拉伸的拉力-伸長率曲線，記錄最大軸向拉力。實驗重復 4 次。
結合大體、外徑測量以及力學強度測試結果，選擇最佳離子相變時間點神經導管進行后續觀測。
1.3.3 微觀結構觀察
采用掃描電鏡觀察神經導管的微觀形貌。將神經導管浸沒于液氮中使之迅速冷凍，分別沿軸向和徑向進行淬斷，噴金處理后，鏡下觀察神經導管的橫截面與縱截面結構。
1.3.4 體外酶降解性能測試
采用可降解殼聚糖材料的溶菌酶對神經導管進行體外酶降解性能測試[10]。取凍干的神經導管，稱量其初始質量后，浸泡于濃度為 2 mg/mL 的溶菌酶溶液中，于 37℃、以 120 r/min 轉速不斷震蕩，設置降解時間點為 3、7、14、21 和 28 d，每隔 2 d 更換新鮮酶液。取各時間點降解后的神經導管凍干，稱重；采用質量損失百分比代表降解率。同時采用掃描電鏡觀察降解后的神經導管微觀形貌。以未經離子相變的神經導管作為對照。實驗重復 3 次。
1.3.5 細胞相容性觀察
采用 RSC96 大鼠雪旺細胞觀察神經導管的細胞相容性。將滅菌的神經導管沿軸向剖開，置于 48 孔板中，導管內層向上。將 500μL 細胞懸液加至導管內層表面，細胞密度 5×104個/mL，添加含 1% 雙抗和 10%FBS 的 H- DMEM，置于 CO2 培養箱中培養，每隔 2 d 換液。
培養 5 d 后，取神經導管進行掃描電鏡觀察與細胞活力檢測。 ① 掃描電鏡觀察：樣品置于 2.5% 戊二醛固定 4 h，梯度乙醇脫水后，置于通風櫥中風干過夜。最后樣品噴金，鏡下觀察表面形貌。② 采用死/活細胞染色表征神經導管上的細胞活力。樣品用 PBS 清洗 5 min，參照死/活細胞染色試劑盒說明進行染色。孵育 15 min 后，采用倒置熒光顯微鏡成像，激發/發射濾波器分別設置為 488/530 和 530/580 nm，以檢測活細胞（綠色）和死細胞（紅色）。
1.4 動物體內修復效果評價
1.4.1 實驗分組及方法
選用 20 只雄性 SD 大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），體質量 200～230 g，隨機分為實驗組及對照組，每組 10 只。兩組大鼠采用 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，于左后肢股后外側行縱切口，自肌間隙進入顯露長約 2.5 cm 的坐骨神經。于坐骨神經中段切取 12 mm，任其回縮到 15 mm，實驗組及對照組分別采用篩選的神經導管以及切取的自體坐骨神經橋接修復缺損。神經導管橋接時，兩端分別套入 1 mm，10-0 尼龍線 3 針固定。手術均在顯微鏡下完成。術后皮下補液 5 mL；肌肉注射青霉素 16 萬 U/d，連續 3 d，常規飼養。
1.4.2 觀測指標
① 復合肌肉動作電位（compound muscle action potential，CMAP）檢測：術后 8 周，于兩組大鼠傷側坐骨神經干近端部分施加電刺激，記錄同側腓腸肌腹部 CMAP，以健側 CMAP 作為對照。② 大體及組織學觀察：CMAP 檢測后，大鼠同上法麻醉、顯露傷側坐骨神經，大體觀察再生神經后，迅速取材并固定于 4% 多聚甲醛中。然后繼續向下方延伸切口至足跟，顯微剪刀沿肌間隙銳性游離腓腸肌，在上、下附著點處將其剪斷，固定于 4% 多聚甲醛中；24 h 后樣本脫水包埋，行橫斷面切片，厚度約 4 μm。對神經組織切片行甲苯胺藍染色，對腓腸肌行 HE 染色，鏡下分別觀察再生神經和腓腸肌的組織形貌。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢測；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 神經導管大體觀察及外徑測量
浸泡 0 h（未進行離子相變）的神經導管呈透明狀；4 h 時導管呈乳白色，12 h 時變為白色，之后顏色未繼續加深，提示神經導管發生不同程度離子相變。外徑測量顯示，4 h 內神經導管外徑快速減小，12 h 后外徑幾乎保持一致，最終神經導管外徑約為 4 mm。見圖 1a、b。
圖1
神經導管體外觀測
a. 離子相變各時間點神經導管大體觀察，從左至右分別為 0、4、12、24、36、48、72 h；b. 離子相變各時間點神經導管外徑；c. 神經導管拉力-伸長率曲線；d. 神經導管橫截面掃描電鏡觀察（×50）；e. 神經導管縱截面掃描電鏡觀察（×100）；f. 降解各時間點神經導管酶降解率；g. 降解 28 d 掃描電鏡觀察神經導管（×500）；h. 掃描電鏡觀察在神經導管表面培養 5 d 的雪旺細胞（×1 000）；i. 死/活細胞染色觀察在神經導管表面培養 5 d 的雪旺細胞（×100）
Figure1. In vitro investigation of the nerve conduitsa. Gross observation of the nerve conduits with different phase transition durations, from left to right for 0, 4, 12, 24, 36, 48, and 72 hours, respectively; b. The external diameters of the nerve conduits with different phase transition durations; c. The axial tensile force-elongation curves of the nerve conduits; d. SEM images of the transversal sections of the nerve conduits (×50); e. SEM images of the longitudinal sections of the nerve conduits (×100); f. The enzyme-degradation rates of the nerve conduits with different digestion time; g. The SEM image of the nerve conduit after 28 days of enzyme digestion (×500); h. The SEM image of Schwann cells after 5 days of culture on the inner layer of the nerve conduit (×1 000); i. The live/dead cell staining of Schwann cells after 5 days of culture on the inner layer of the nerve conduit (×100)
2.2 力學強度測試
0、4 h 時樣品較軟，易被夾具夾斷，未測試其拉伸力學強度。12、24、36、48、72 h 時神經導管拉伸強度逐漸增大，最大拉力分別為（1.17±0.14）、（1.28±0.17）、（2.05±0.16）、（3.10±0.35）、（3.31±0.29）N，48 h 時較 12～36 h 時顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）；與 72 h 比較差異無統計學意義（P>0.05）。離子相變 48 h 的神經導管斷裂時伸長率可達 260%，樣品拉力-伸長率曲線見圖 1c。
上述結果證明，48 h 為合適的離子相變時間，此時導管形態穩定，力學強度高。因此，后續實驗采用離子相變 48 h 的神經導管進行觀察。
2.3 微觀結構觀察
掃描電鏡觀察顯示，神經導管內徑約 1 mm、外徑約 4 mm。管壁具有豐富且均勻的多孔結構，孔徑為 10～100 μm；內層也為多孔結構，與管壁相比較為致密，孔徑更小（10～40 μm）。見圖 1d、e。
2.4 體外酶降解性能測試
未經離子相變的神經導管在 14 d 內快速降解，完全降解成小碎片。離子相變 48 h 的神經導管在 14 d 內降解率約為 77%，28 d 時約為 86%，掃描電鏡觀察示降解 28 d 時其表面出現大量疏松碎片，為溶菌酶降解殼聚糖后得到的降解產物。見圖 1f、g。
2.5 細胞相容性觀察
培養 5 d 后，掃描電鏡下見細胞能黏附在神經導管內壁，相互融合形成細胞單層，細胞呈短梭狀和圓形。細胞有大量偽足擴展，細胞之間相互聯系。死/活細胞染色顯示，細胞具有高活力，均勻分布于神經導管內壁。見圖 h、i。
2.6 動物體內修復效果
2.6.1 CMAP 檢測
術后 8 周，實驗組、對照組 CMAP 分別為（3.5±0.9）、（4.3±1.1）m/V，均顯著低于健側 CMAP（45.6±5.6）m/V，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組及對照組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.6.2 大體觀察
術后 8 周，對照組自體神經吻合口膨脹程度較輕、神經較粗。實驗組再生神經已完全橋接神經缺損段，未與周圍組織和神經導管產生粘連，同時神經導管未出現塌陷、壓扁等情況。見圖 2a。
圖2
術后 8 周兩組觀察
上排為實驗組，下排為對照組 a. 再生神經大體觀察；b. 再生神經甲苯胺藍染色（×100）；c. 腓腸肌 HE 染色（×200）
Figure2. Observation of rats at 8 weeks after operationThe experimental group in the upper row and the control group in the lower row a. Gross observation of the regenerated nerves; b. Toluidine blue staining images of the regenerated nerves (×100); c. HE staining images of the gastrocnemius muscle (×200)
2.6.3 組織學觀察
甲苯胺藍染色：實驗組再生神經纖維均一有序，再生神經軸突直徑、神經纖維數量以及髓鞘厚度與對照組自體神經相似。見圖 2b。
HE 染色：兩組均出現由于神經損傷引起的肌纖維組織萎縮與混亂，肌纖維呈束狀整齊排布，為多核多邊形，細胞核位于周邊接近肌漿膜的位置，組織間隙內未見炎性細胞浸潤。實驗組與對照組的腓腸肌組織形態無明顯差異。見圖 2c。
3 討論
殼聚糖材料具有良好的生物學特性、穩定性和可加工性[11-12]，尤其是具有優良的神經保護特性[13-15]，在神經組織修復方面獲得了廣泛應用，目前也取得了一定研究進展[16-17]。然而，單純殼聚糖材料存在力學強度差、降解速率過快等缺點[11, 12]，臨床應用中可能存在管壁塌陷，進而導致修復失敗，因此近年來學者們采取了多種方法彌補殼聚糖材料的上述缺陷。
陸江等[18]制備了膠原/殼聚糖復合支架，采用 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳化二亞胺對其進行交聯，顯著提高了支架機械強度，大幅延長了支架降解時間。然而，化學交聯劑存在潛在毒性，體內安全性未經系統評價，因此在產品轉化上受到一定限制。Baniasadi 等[19]將導電聚苯胺/石墨烯納米材料與殼聚糖/明膠水凝膠相復合，制備了多孔導電殼聚糖凝膠支架，復合后提高了支架的電學傳導和力學性能，延長了支架的降解時間。劉奔等[20]將聚己內酯與殼聚糖復合制備神經導管，并修復大鼠坐骨神經缺損。結果顯示，與單純殼聚糖組相比，復合材料組大鼠神經功能恢復速度更快，提示將聚己內酯與殼聚糖復合后可提高力學強度、調控降解速度。但是，復合力學強度較高的合成高分子材料能夠有效提高殼聚糖的機械強度和抗降解性，然而多種成分的組合會使導管材料局部不均勻，植入體內后各成分間存在降解速率不一致的問題，可能導致導管應力集中和局部塌陷，以致修復失敗。
為避免上述方法存在的問題，我們采用了單一溫敏性殼聚糖材料，通過離子增強方式提高殼聚糖神經導管的力學性能和抗降解性。我們前期研究表明，殼聚糖體系中存在鹽離子情況下，離子會與殼聚糖高分子競爭結合水分子，使得殼聚糖的結合水減少，疏水作用增強，促進其溶膠-凝膠轉變[9]。本次研究中，我們將殼聚糖離子特異性效應應用到神經導管的制備。隨著離子相變時間的逐漸延長，殼聚糖溶膠-凝膠相轉變程度逐漸增大。12～48 h 雖然神經導管形態無明顯改變，但是殼聚糖分子疏水作用仍然繼續增強，表現為力學強度逐漸提高。至 48 h 時，殼聚糖分子-鹽離子-結合水之間達到一個平衡穩態，此時導管具有良好彈性張力。繼續延長離子相變時間，神經導管力學強度無明顯改變。同時，由于相變后的神經導管具有更緊密結構，所以其降解速率與未經離子相變的神經導管相比大幅降低，為體內神經修復提供有效力學支撐。與前期報道的增強方法相比，本研究采用的離子相變法未添加任何毒性試劑，成分單一，步驟簡便，不僅有效地改善了殼聚糖材料的缺陷，而且有利于殼聚糖神經導管的產品轉化。
本研究制備的殼聚糖神經導管另一大優點為管壁與內層具有豐富、均勻的微米孔結構。一方面，該多孔結構有利于神經損傷修復過程中營養物質和氧氣的交換，更好地促進神經再生和功能修復[21-22]；另一方面，內表面的微米孔孔徑與細胞尺寸相當，有利于雪旺細胞黏附和增殖。雪旺細胞在神經導管內層融合，能為受損神經鋪路，引導神經細胞再生方向，促進神經組織再生與功能重建。同時，殼聚糖分子中仍保留一定比例的氨基，其表面帶有一定正電荷[9]，因此可以吸附表面帶負電荷的神經細胞，促進細胞黏附。
體內修復結果表明，神經導管可有效促進大鼠坐骨神經再生、髓鞘結構和腓腸肌恢復。術后 8 周時，實驗組及對照組電生理性能恢復水平相當，初步顯示該神經導管對于神經功能恢復有效，但與“金標準”自體神經修復的遠期有效性比較以及對于長段神經缺損的修復效果，均有待進一步研究。
綜上述，利用殼聚糖離子特異性效應，僅通過離子相變作用，可有效提高神經導管力學強度，延長降解時間。該方法未添加任何毒性試劑，成分單一，步驟簡便，有利于殼聚糖神經導管的產品轉化。同時，制備的神經導管具有良好物理化學性質和細胞相容性，可促進大鼠坐骨神經再生，有望用于周圍神經缺損修復和組織工程神經制備。
作者貢獻：魏長征負責整體科研設計，材料制備方案設計，動物實驗設計與評價，部分文章撰寫；楊小元負責具體實驗工作，包括神經導管的制備和體外性能測試；王曉彤負責細胞實驗、數據整理和部分文章撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：實驗動物使用許可證號 SYXK（鄂）2018-0101。
近年來，利用神經導管修復周圍神經缺損的研究取得了較大進展[1-2]。天然高分子材料因具有良好的生物相容性和可塑性等諸多優點[3-4]，是制備神經導管的首選材料之一，然而其力學強度較弱和降解時間較快。為彌補上述不足，有學者提出采用化學交聯劑處理，但存在細胞毒性問題[5]；與合成高分子復合又會導致體內降解速率不匹配。因此，如何采取一種綠色無毒而又簡便的工藝以有效提高天然高分子神經導管的強度，是一項亟待解決的難題。
溫敏性殼聚糖是一種對溫度具有高度響應性的智能水凝膠，保留了幾丁糖優良的生物相容性和抑制纖維化、抗炎等其他生物學特性[6-8]。最近研究表明，殼聚糖具有離子特異性效應[9]，提示可以通過改變殼聚糖體系中的離子強度，在不引入化學交聯劑的情況下就可調控其機械強度和降解性能。因此，本研究以溫敏性殼聚糖為主要原料，利用其離子特異性效應設計高強度天然高分子神經導管的綠色制備工藝，并對制備的導管材料力學強度、降解性能、微觀結構、細胞相容性和體內修復效果進行詳細表征，以期為殼聚糖神經導管的產品轉化和下一步應用于體內修復周圍神經缺損奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料及儀器
溫敏性殼聚糖（上海其勝生物制劑有限公司）；NaCl （江蘇勤奮藥業有限公司）；DMEM 培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；溶菌酶（>20 000 U/mg，上海源聚生物科技有限公司）；溴化鉀、多聚甲醛（Sigma 公司，美國）；戊二醛（上海凌峰化學試劑有限公司）；死/活細胞染色試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；無水乙醇（上海凌峰化學試劑有限公司）；甲苯胺藍、HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。RSC96 大鼠雪旺細胞（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）。
冷凍干燥機（上海億倍實業有限公司）；掃描電鏡（HITACHI 公司，日本）；CO2 恒溫培養箱（Memmert 公司，德國）；熒光倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；紅外光譜儀（Thermo 公司，美國）；AL-3000 力學測試儀（中國高鐵檢測儀器公司）；游標卡尺（精度 0.02 mm；Mitutoyo 公司，日本）。
1.2 神經導管制備方法
將濃度為 0.8%（W/V）的溫敏性殼聚糖溶液低溫下灌至帶芯棒的定型裝置中。芯棒外徑 1 mm，采用相變材料涂層。然后，將裝置置于 20～60℃ 環境 60 min 進行凝膠化和賦形。將初步成型的凝膠置于濃度為 0.9%（W/V）的 NaCl 溶液中進行離子相變，分別取 37℃ 下浸泡 0、4、12、24、36、48、72 h 得到的彈性凝膠體，轉入純化水中清洗 10 min，以去除過多鹽分，得到神經導管中間品。最后，將中間品放入冷凍干燥機中進行干燥，得到神經導管，經60Co 輻照滅菌備用。
1.3 體外觀測
1.3.1 神經導管大體觀察及外徑測量
取于 NaCl 溶液中浸泡 0～72 h 獲得的神經導管，大體觀察其顏色，并采用游標卡尺測量其外徑。實驗重復 6 次。
1.3.2 力學強度測試
取 1.2 中于 NaCl 溶液中浸泡 0～72 h 獲得的神經導管，采用力學測試儀表征其軸向拉伸強度。具體步驟：取相同內徑、外徑的濕態神經導管樣品，用夾具夾緊，保持夾具間神經導管長度為 2 cm，軸向與拉力方向平行，室溫下以 2 mm/min 的速度進行拉伸，直至樣品被拉斷，得到單軸拉伸的拉力-伸長率曲線，記錄最大軸向拉力。實驗重復 4 次。
結合大體、外徑測量以及力學強度測試結果，選擇最佳離子相變時間點神經導管進行后續觀測。
1.3.3 微觀結構觀察
采用掃描電鏡觀察神經導管的微觀形貌。將神經導管浸沒于液氮中使之迅速冷凍，分別沿軸向和徑向進行淬斷，噴金處理后，鏡下觀察神經導管的橫截面與縱截面結構。
1.3.4 體外酶降解性能測試
采用可降解殼聚糖材料的溶菌酶對神經導管進行體外酶降解性能測試[10]。取凍干的神經導管，稱量其初始質量后，浸泡于濃度為 2 mg/mL 的溶菌酶溶液中，于 37℃、以 120 r/min 轉速不斷震蕩，設置降解時間點為 3、7、14、21 和 28 d，每隔 2 d 更換新鮮酶液。取各時間點降解后的神經導管凍干，稱重；采用質量損失百分比代表降解率。同時采用掃描電鏡觀察降解后的神經導管微觀形貌。以未經離子相變的神經導管作為對照。實驗重復 3 次。
1.3.5 細胞相容性觀察
采用 RSC96 大鼠雪旺細胞觀察神經導管的細胞相容性。將滅菌的神經導管沿軸向剖開，置于 48 孔板中，導管內層向上。將 500μL 細胞懸液加至導管內層表面，細胞密度 5×104個/mL，添加含 1% 雙抗和 10%FBS 的 H- DMEM，置于 CO2 培養箱中培養，每隔 2 d 換液。
培養 5 d 后，取神經導管進行掃描電鏡觀察與細胞活力檢測。 ① 掃描電鏡觀察：樣品置于 2.5% 戊二醛固定 4 h，梯度乙醇脫水后，置于通風櫥中風干過夜。最后樣品噴金，鏡下觀察表面形貌。② 采用死/活細胞染色表征神經導管上的細胞活力。樣品用 PBS 清洗 5 min，參照死/活細胞染色試劑盒說明進行染色。孵育 15 min 后，采用倒置熒光顯微鏡成像，激發/發射濾波器分別設置為 488/530 和 530/580 nm，以檢測活細胞（綠色）和死細胞（紅色）。
1.4 動物體內修復效果評價
1.4.1 實驗分組及方法
選用 20 只雄性 SD 大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），體質量 200～230 g，隨機分為實驗組及對照組，每組 10 只。兩組大鼠采用 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，于左后肢股后外側行縱切口，自肌間隙進入顯露長約 2.5 cm 的坐骨神經。于坐骨神經中段切取 12 mm，任其回縮到 15 mm，實驗組及對照組分別采用篩選的神經導管以及切取的自體坐骨神經橋接修復缺損。神經導管橋接時，兩端分別套入 1 mm，10-0 尼龍線 3 針固定。手術均在顯微鏡下完成。術后皮下補液 5 mL；肌肉注射青霉素 16 萬 U/d，連續 3 d，常規飼養。
1.4.2 觀測指標
① 復合肌肉動作電位（compound muscle action potential，CMAP）檢測：術后 8 周，于兩組大鼠傷側坐骨神經干近端部分施加電刺激，記錄同側腓腸肌腹部 CMAP，以健側 CMAP 作為對照。② 大體及組織學觀察：CMAP 檢測后，大鼠同上法麻醉、顯露傷側坐骨神經，大體觀察再生神經后，迅速取材并固定于 4% 多聚甲醛中。然后繼續向下方延伸切口至足跟，顯微剪刀沿肌間隙銳性游離腓腸肌，在上、下附著點處將其剪斷，固定于 4% 多聚甲醛中；24 h 后樣本脫水包埋，行橫斷面切片，厚度約 4 μm。對神經組織切片行甲苯胺藍染色，對腓腸肌行 HE 染色，鏡下分別觀察再生神經和腓腸肌的組織形貌。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢測；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 神經導管大體觀察及外徑測量
浸泡 0 h（未進行離子相變）的神經導管呈透明狀；4 h 時導管呈乳白色，12 h 時變為白色，之后顏色未繼續加深，提示神經導管發生不同程度離子相變。外徑測量顯示，4 h 內神經導管外徑快速減小，12 h 后外徑幾乎保持一致，最終神經導管外徑約為 4 mm。見圖 1a、b。
圖1
神經導管體外觀測
a. 離子相變各時間點神經導管大體觀察，從左至右分別為 0、4、12、24、36、48、72 h；b. 離子相變各時間點神經導管外徑；c. 神經導管拉力-伸長率曲線；d. 神經導管橫截面掃描電鏡觀察（×50）；e. 神經導管縱截面掃描電鏡觀察（×100）；f. 降解各時間點神經導管酶降解率；g. 降解 28 d 掃描電鏡觀察神經導管（×500）；h. 掃描電鏡觀察在神經導管表面培養 5 d 的雪旺細胞（×1 000）；i. 死/活細胞染色觀察在神經導管表面培養 5 d 的雪旺細胞（×100）
Figure1. In vitro investigation of the nerve conduitsa. Gross observation of the nerve conduits with different phase transition durations, from left to right for 0, 4, 12, 24, 36, 48, and 72 hours, respectively; b. The external diameters of the nerve conduits with different phase transition durations; c. The axial tensile force-elongation curves of the nerve conduits; d. SEM images of the transversal sections of the nerve conduits (×50); e. SEM images of the longitudinal sections of the nerve conduits (×100); f. The enzyme-degradation rates of the nerve conduits with different digestion time; g. The SEM image of the nerve conduit after 28 days of enzyme digestion (×500); h. The SEM image of Schwann cells after 5 days of culture on the inner layer of the nerve conduit (×1 000); i. The live/dead cell staining of Schwann cells after 5 days of culture on the inner layer of the nerve conduit (×100)
2.2 力學強度測試
0、4 h 時樣品較軟，易被夾具夾斷，未測試其拉伸力學強度。12、24、36、48、72 h 時神經導管拉伸強度逐漸增大，最大拉力分別為（1.17±0.14）、（1.28±0.17）、（2.05±0.16）、（3.10±0.35）、（3.31±0.29）N，48 h 時較 12～36 h 時顯著增大，差異有統計學意義（P<0.05）；與 72 h 比較差異無統計學意義（P>0.05）。離子相變 48 h 的神經導管斷裂時伸長率可達 260%，樣品拉力-伸長率曲線見圖 1c。
上述結果證明，48 h 為合適的離子相變時間，此時導管形態穩定，力學強度高。因此，后續實驗采用離子相變 48 h 的神經導管進行觀察。
2.3 微觀結構觀察
掃描電鏡觀察顯示，神經導管內徑約 1 mm、外徑約 4 mm。管壁具有豐富且均勻的多孔結構，孔徑為 10～100 μm；內層也為多孔結構，與管壁相比較為致密，孔徑更小（10～40 μm）。見圖 1d、e。
2.4 體外酶降解性能測試
未經離子相變的神經導管在 14 d 內快速降解，完全降解成小碎片。離子相變 48 h 的神經導管在 14 d 內降解率約為 77%，28 d 時約為 86%，掃描電鏡觀察示降解 28 d 時其表面出現大量疏松碎片，為溶菌酶降解殼聚糖后得到的降解產物。見圖 1f、g。
2.5 細胞相容性觀察
培養 5 d 后，掃描電鏡下見細胞能黏附在神經導管內壁，相互融合形成細胞單層，細胞呈短梭狀和圓形。細胞有大量偽足擴展，細胞之間相互聯系。死/活細胞染色顯示，細胞具有高活力，均勻分布于神經導管內壁。見圖 h、i。
2.6 動物體內修復效果
2.6.1 CMAP 檢測
術后 8 周，實驗組、對照組 CMAP 分別為（3.5±0.9）、（4.3±1.1）m/V，均顯著低于健側 CMAP（45.6±5.6）m/V，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組及對照組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.6.2 大體觀察
術后 8 周，對照組自體神經吻合口膨脹程度較輕、神經較粗。實驗組再生神經已完全橋接神經缺損段，未與周圍組織和神經導管產生粘連，同時神經導管未出現塌陷、壓扁等情況。見圖 2a。
圖2
術后 8 周兩組觀察
上排為實驗組，下排為對照組 a. 再生神經大體觀察；b. 再生神經甲苯胺藍染色（×100）；c. 腓腸肌 HE 染色（×200）
Figure2. Observation of rats at 8 weeks after operationThe experimental group in the upper row and the control group in the lower row a. Gross observation of the regenerated nerves; b. Toluidine blue staining images of the regenerated nerves (×100); c. HE staining images of the gastrocnemius muscle (×200)
2.6.3 組織學觀察
甲苯胺藍染色：實驗組再生神經纖維均一有序，再生神經軸突直徑、神經纖維數量以及髓鞘厚度與對照組自體神經相似。見圖 2b。
HE 染色：兩組均出現由于神經損傷引起的肌纖維組織萎縮與混亂，肌纖維呈束狀整齊排布，為多核多邊形，細胞核位于周邊接近肌漿膜的位置，組織間隙內未見炎性細胞浸潤。實驗組與對照組的腓腸肌組織形態無明顯差異。見圖 2c。
3 討論
殼聚糖材料具有良好的生物學特性、穩定性和可加工性[11-12]，尤其是具有優良的神經保護特性[13-15]，在神經組織修復方面獲得了廣泛應用，目前也取得了一定研究進展[16-17]。然而，單純殼聚糖材料存在力學強度差、降解速率過快等缺點[11, 12]，臨床應用中可能存在管壁塌陷，進而導致修復失敗，因此近年來學者們采取了多種方法彌補殼聚糖材料的上述缺陷。
陸江等[18]制備了膠原/殼聚糖復合支架，采用 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳化二亞胺對其進行交聯，顯著提高了支架機械強度，大幅延長了支架降解時間。然而，化學交聯劑存在潛在毒性，體內安全性未經系統評價，因此在產品轉化上受到一定限制。Baniasadi 等[19]將導電聚苯胺/石墨烯納米材料與殼聚糖/明膠水凝膠相復合，制備了多孔導電殼聚糖凝膠支架，復合后提高了支架的電學傳導和力學性能，延長了支架的降解時間。劉奔等[20]將聚己內酯與殼聚糖復合制備神經導管，并修復大鼠坐骨神經缺損。結果顯示，與單純殼聚糖組相比，復合材料組大鼠神經功能恢復速度更快，提示將聚己內酯與殼聚糖復合后可提高力學強度、調控降解速度。但是，復合力學強度較高的合成高分子材料能夠有效提高殼聚糖的機械強度和抗降解性，然而多種成分的組合會使導管材料局部不均勻，植入體內后各成分間存在降解速率不一致的問題，可能導致導管應力集中和局部塌陷，以致修復失敗。
為避免上述方法存在的問題，我們采用了單一溫敏性殼聚糖材料，通過離子增強方式提高殼聚糖神經導管的力學性能和抗降解性。我們前期研究表明，殼聚糖體系中存在鹽離子情況下，離子會與殼聚糖高分子競爭結合水分子，使得殼聚糖的結合水減少，疏水作用增強，促進其溶膠-凝膠轉變[9]。本次研究中，我們將殼聚糖離子特異性效應應用到神經導管的制備。隨著離子相變時間的逐漸延長，殼聚糖溶膠-凝膠相轉變程度逐漸增大。12～48 h 雖然神經導管形態無明顯改變，但是殼聚糖分子疏水作用仍然繼續增強，表現為力學強度逐漸提高。至 48 h 時，殼聚糖分子-鹽離子-結合水之間達到一個平衡穩態，此時導管具有良好彈性張力。繼續延長離子相變時間，神經導管力學強度無明顯改變。同時，由于相變后的神經導管具有更緊密結構，所以其降解速率與未經離子相變的神經導管相比大幅降低，為體內神經修復提供有效力學支撐。與前期報道的增強方法相比，本研究采用的離子相變法未添加任何毒性試劑，成分單一，步驟簡便，不僅有效地改善了殼聚糖材料的缺陷，而且有利于殼聚糖神經導管的產品轉化。
本研究制備的殼聚糖神經導管另一大優點為管壁與內層具有豐富、均勻的微米孔結構。一方面，該多孔結構有利于神經損傷修復過程中營養物質和氧氣的交換，更好地促進神經再生和功能修復[21-22]；另一方面，內表面的微米孔孔徑與細胞尺寸相當，有利于雪旺細胞黏附和增殖。雪旺細胞在神經導管內層融合，能為受損神經鋪路，引導神經細胞再生方向，促進神經組織再生與功能重建。同時，殼聚糖分子中仍保留一定比例的氨基，其表面帶有一定正電荷[9]，因此可以吸附表面帶負電荷的神經細胞，促進細胞黏附。
體內修復結果表明，神經導管可有效促進大鼠坐骨神經再生、髓鞘結構和腓腸肌恢復。術后 8 周時，實驗組及對照組電生理性能恢復水平相當，初步顯示該神經導管對于神經功能恢復有效，但與“金標準”自體神經修復的遠期有效性比較以及對于長段神經缺損的修復效果，均有待進一步研究。
綜上述，利用殼聚糖離子特異性效應，僅通過離子相變作用，可有效提高神經導管力學強度，延長降解時間。該方法未添加任何毒性試劑，成分單一，步驟簡便，有利于殼聚糖神經導管的產品轉化。同時，制備的神經導管具有良好物理化學性質和細胞相容性，可促進大鼠坐骨神經再生，有望用于周圍神經缺損修復和組織工程神經制備。
作者貢獻：魏長征負責整體科研設計，材料制備方案設計，動物實驗設計與評價，部分文章撰寫；楊小元負責具體實驗工作，包括神經導管的制備和體外性能測試；王曉彤負責細胞實驗、數據整理和部分文章撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：實驗動物使用許可證號 SYXK（鄂）2018-0101。
