引用本文： 蔣亨, 袁心剛, 傅躍先. TCDD 致胎鼠腭裂模型中 miR-381-3p 下調抑制腭間充質細胞成骨分化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(9): 1174-1180. doi: 10.7507/1002-1892.201901028 復制
腭裂是最常見的出生缺陷之一[1]。繼發腭的形成需要經過兩側腭突的生長、抬高、接觸黏附和融合，其中任一過程中斷均會導致腭裂發生[2]。因小鼠繼發腭發育與人類相似，腭部發育研究常選擇其作為動物模型[3]。在小鼠腭發育中，胚胎日第 13.5 天（embryonic day 13.5，E13.5）時兩側腭突垂直于舌體兩側生長，E14.5 時兩側腭突迅速抬高至舌體上方的水平方向并向對側生長，于中部與對側接觸黏附形成腭中縫，隨后腭中縫降解，兩側腭間充質（mouse embryonic palatal mesenchymal，MEPM）匯合，其連續性得以建立；與此同時，胎鼠 MEPM 開始分化成骨和肌肉，分別形成硬腭和軟腭[4]。2，3，7，8-四氯二苯二英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）是環境污染物，在動物和人類中都具有發育毒性，在發育的小鼠胚胎中會導致腭裂發生率增高，抑制腭部成骨分化和肌肉生長，導致雙側腭突融合后復裂[5]。
研究表明，環境因素介導基因轉錄后水平的調節是通過非編碼 RNAs（如 miRNAs）來完成的[6]。miRNAs 調節基因的表達在多種疾病的發生發展中發揮著重要作用，例如與小鼠、斑馬魚甚至人類的腭裂發生相關[7]。生物信息學分析發現，miR-381-3p 調節多個已知與腭裂相關的基因，如 TGF-β3、Smo、Msx2 和 Bmp1r 等[8]，而且可上調成骨細胞特異性轉錄因子 RUNX2 的表達，促進軟骨細胞的生長[9]。MEPM 細胞來源于神經嵴細胞，隨著雙側腭突開始融合，MEPM 細胞通過膜內成骨分化形成腭骨[10]。本研究旨在觀察 TCDD 作用于 MEPM 細胞后，miR-381-3p 及成骨分化標志物 RUNX2、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達變化，以及 miR-381-3p 對 MEPM 細胞成骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡 SPF 級建康 C57BL/6J 小鼠 52 只，雌性 40 只、雄性 12 只，體質量 18～20 g；購自重慶醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（渝）20050002；飼養于 SPF 級動物實驗室，溫度 22～24℃，濕度 55%±5%，循環光照明暗各 12 h，普通實驗室飼料、水源，自由飲水、攝食。
TCDD（Sigma-Aldrich 公司，美國）；DMEM/F12、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；青霉素+鏈霉素雙抗（上海碧云天生物技術有限公司）；PBS 磷酸鹽緩沖粉劑（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；Dispase Ⅱ酶（上海翊盛生物科技有限公司）；DMSO（Sigma 公司，美國）；miR-381-3p 抑制物及對照物、miR-381-3p 模擬物及對照物（上海吉熒生物技術有限公司）；All-in-oneTMqPCR Mix、EndoFectinTM-MAX 轉染試劑（GeneCopoeia 公司，美國）；Biospin miRNA 提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）；miRNA 第 1 鏈 cDNA 合成（莖環法）試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；細胞組織全蛋白提取試劑盒（新賽美生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、抗 β-actin 多克隆抗體、抗 RUNX2 多克隆抗體、超敏 ECL 化學發光試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司）；抗 OPN 多克隆抗體（Proteintech 公司，美國）；二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
體式顯微鏡 DXM1200F、倒置光學/熒光多功能顯微鏡（Nikon 公司，日本）；細胞培養瓶、培養皿（Corning 公司，美國）；NanoDrop 2000 分光光度計、移液器、細胞培養箱、普通 PCR 儀和生物安全柜、Biofuge Primo 臺式離心機（Thermo 公司，美國）；CFX96 實時熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad，美國）； ECL 顯影儀 Gene Gnome 5（Gene 公司，美國）。
1.2 TCDD 對胎鼠腭部發育影響觀察
1.2.1 實驗分組及方法
52 只 C57BL/6J 小鼠適應新環境 2 周后，于黃昏按雌雄比例 2∶1 或 3∶1 合籠交配，次日晨雌雄分籠，檢查雌鼠陰栓，稱重標記；記錄當天為 E0.5，觀察體質量至 E10.5；體質量增長小于 2 g 者視為未孕，重新合籠。最后獲取 32 只符合要求的孕鼠用于實驗。
將 32 只孕鼠隨機分為 TCDD 組與對照組，每組 16 只。E10.5 時，TCDD 組孕鼠按 28 μg/kg（以玉米油配制成 5 μg /mL）一次性灌胃 TCDD；對照組一次性灌胃等體積玉米油。各組孕鼠分別在 E13.5 和 E14.5 時取 8 只 CO2 麻醉處死。無菌條件下，配合體式顯微鏡從孕鼠子宮取出胎鼠，剪取胎鼠頭部，大體觀察腭突生長情況。
1.2.2 實時熒光定量 PCR 檢測 miR-381-3p
取兩組 E13.5 和 E14.5 腭突組織，采用 Biospin miRNA 提取試劑盒提取 miRNAs。使用 miRNA 第 1 鏈 cDNA 合成（莖環法）試劑盒進行逆轉錄，體系為 20 μL，包括：2×miRNA L-RT Solution mix 10 μL，miRNA L-RT Enzyme mix 1.5 μL，miRNA 2 μg，莖環引物（10 μmol/L）1 μL，U6 下游引物（10 μmol/L）1 μL，去酶水定容 20 μL；反應條件：16℃ 30 min，37℃ 30 min，85℃ 5min。逆轉錄反應液被稀釋 2 倍并作 3 個復孔，每孔反應體系共 10 μL，包括：2×All-in-oneTMqPCR Mix 5 μL，上、下引物各 1 μL（2 μmol/L），cDNA 1 μL，去酶水 2 μL；反應條件：95℃ 預變性 10 min，40 個循環（95℃ 變性 10 s，57℃ 退火 20 s，延伸 72℃ 15 s）。以 U6 為內參基因，使用 2?ΔΔCt方法計算 miR-381-3p 相對表達量。miR-381-3p 和 U6 逆轉錄引物及 PCR 引物設計和合成均由上海生工生物工程技術有限公司完成，根據 NCBI Nucleotide 數據庫，比對引物特異性，引物序列見表 1。實驗重復 3 次。
表1
miR-381-3p 和 U6 的逆轉錄引物、實時熒光定量 PCR 上下游引物及 miR-381-3p 抑制物和模擬物序列
Table1.
Reverse transcription primers, upstream and downstream primers of real-time fluorescent quantitative PCR, inhibitor and mimics sequences for miR-381-3p
1.2.3 Western blot 檢測 RUNX2 和 OPN 蛋白
取兩組 E14.5 腭突組織，采用細胞組織全蛋白提取試劑盒提取總蛋白。使用 BCA 蛋白濃度定量試劑盒測定每個樣品中總蛋白質的濃度。使用 SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒制備 8%SDS-PAGE 凝膠，電泳分離蛋白質并轉移到 PVDF 膜。將膜浸入含 5% 脫脂奶粉的 TBST 溶液，在室溫下搖床封閉 2～3 h；將膜分別與抗 RUNX2 蛋白多克隆抗體（1∶300）、抗 OPN 多克隆抗體（1∶500）、抗 β-actin 多克隆抗體（1∶1 000）4℃ 孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h，以超敏 ECL 試劑顯影拍照，Image J 分析灰度值。與 β-actin 條帶灰度值的比值來表示目的蛋白相對表達量。實驗重復 3 次。
1.3 MEPM 細胞分離培養及觀測
1.3.1 MEPM 細胞分離及傳代
無菌條件下，參考 Feng 等[11]的方法提取原代細胞。具體步驟：取 1.2 中獲得的對照組 E14.5 胎鼠腭突，置于 0.5% Dispase Ⅱ酶（DMEM/F12 稀釋）4℃ 過夜，期間搖勻 1～2 次。次日見上皮與 MEPM 明顯分離后，顯微外科器械剝離上皮，余下的 MEPM 用 0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化吹打；待其分離為絮狀物時，用完全培養基終止消化，繼續吹打至單細胞懸液，以離心半徑 14 cm，1 200 r/min 離心 5 min；細胞重懸，接種于 75 cm2培養瓶，加入完全培養基（含 90%DMEM/F12 培養基、10%FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素），置于 37℃、5%CO2 及 95% 飽和濕度恒溫培養箱培養 30 min；棄去培養液（差速貼壁法去除殘留上皮細胞），加入新的完全培養液繼續培養；重復 1 次。每 2～3 天換液 1 次進行傳代。取第 3 代細胞進行觀測。
1.3.2 TCDD 體外處理 MEPM 細胞及觀測
TCDD 溶于 DMSO 并加入完全培養基，TCDD 終濃度為 10 nmol/L，DMSO 終濃度小于 0.05%。取第 3 代 MEPM 細胞以 50% 左右密度接種于直徑 6 cm 培養皿中，次日更換含 10 nmol/L TCDD 的完全培養基。TCDD 處理后 0（對照）、0.5、1、2、3 d，取細胞參照 1.2.2 實時熒光定量 PCR 檢測 miR-381-3p 表達；0、1、2、3 d 時參照 1.2.3 Western blot 檢測 RUNX2 和 OPN 蛋白表達。實驗重復 3 次。
1.4 MEPM 細胞轉染及觀測
取第 3 代 MEPM 細胞，根據轉染內容不同分為 4 組。沉默表達組及對照組分別轉染 miR-381-3p 抑制物及對照物，過表達組及對照組分別轉染 miR-381-3p 模擬物及對照物。轉染物設計與合成均由上海吉熒生物技術有限公司完成，各轉染物序列見表 1。按照 EndoFectinTM-MAX 轉染試劑使用說明書轉染，過表達組及對照組轉染濃度為 75 nmol/L，沉默表達組及對照組轉染濃度為 100 nmol/L。
轉染 48 h 后取各組細胞采用實時熒光定量 PCR 檢測 miR-381-3p 表達，驗證 MEPM 細胞轉染 miR-381-3p 抑制物和模擬物效率；采用 Western blot 檢測 RUNX2 和 OPN 蛋白表達，分析沉默和過表達 miR-381-3p 對 MEPM 細胞成骨分化的影響，以及 MEPM 細胞轉染 miR-381-3p 模擬物后 miR-381-3p 過表達情況。實驗重復 3 次。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 24.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 胎鼠腭部發育形態學觀察
2.1.1 大體觀察
E13.5 和 E14.5 時，對照組從孕鼠獲得活胎鼠共計 96 只，死胎和吸收胎共 2 只；TCDD 組獲得活胎鼠共 92 只，死胎和吸收胎 3 只。E13.5 兩組活胎鼠可見雙側腭突生長，均未接觸，中間有較大間隙；E14.5 對照組活胎鼠可見雙側腭突接觸，TCDD 組活胎鼠可見雙側腭突未能接觸，中間有間隙。見圖 1。
圖1
胎鼠腭部形態學觀察（×20）
左側為 E13.5，右側為 E14.5；P 表示完整腭部，?表示兩側腭突裂隙 a. 對照組；b. TCDD 組
Figure1. Morphological changes of the palate in the control and TCDD groups on E13.5 and E14.5 (×20)Left for E13.5 and right for E14.5; P indicated the complete fusion palate and ? indicated the gap between bilateral palates a. Control group; b. TCDD group
2.1.2 實時熒光定量 PCR 檢測
TCDD 組 E13.5 和 E14.5 胎鼠腭突組織 miR-381-3p 相對表達量分別為 0.51±0.09、1.49±0.10，對照組為 1.25±0.15、2.05±0.09，TCDD 組明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=4.039，P=0.015；t=4.043，P=0.015）。
2.1.3 Western blot 檢測
TCDD 組 E14.5 胎鼠腭突組織 RUNX2 及 OPN 蛋白相對表達量分別為 0.69±0.06、0.56±0.03，均較對照組 1.00±0.05、1.00±0.03 降低，差異有統計學意義（t=3.529，P=0.024；t=8.288，P=0.001）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測 E14.5 胎鼠腭突組織 RUNX2 及 OPN 蛋白表達
1：對照組 2：TCDD 組
Figure2. The expressions of RUNX2 and OPN proteins in TCDD and control groups on E14.51: Control group 2: TCDD group
2.2 TCDD 處理 MEPM 細胞后觀測
2.2.1 實時熒光定量 PCR 檢測
TCDD 處理 MEPM 細胞 0、0.5、1、2、3 d 后，miR-381-3p 相對表達量分別為 1.00±0.12、0.43±0.09、0.61±0.09、1.00±0.08、1.18±0.05。其中，0.5 和 1 d 時 miR-381-3p 相對表達量較 0 d 時明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05）；2、3 d 時表達量明顯上升，與 0 d 時比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2.2 Western blot 檢測
TCDD 處理 MEPM 細胞 0、1、2、3 d 后，RUNX2 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.11、0.57±0.10、0.50±0.01、0.47±0.10；OPN 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.02、0.75±0.12、0.59±0.02、0.67±0.04。1、2、3 d 時 RUNX2 及 OPN 蛋白相對表達量均較 0 d 時顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；1、2、3 d 間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
MEPM 細胞形態觀察及 Western blot 檢測
a. TCDD 處理前第 3 代 MEPM 細胞（倒置相差顯微鏡×200）；b. TCDD 處理后第3 代 MEPM 細胞（倒置相差顯微鏡×200）；c. Western blot 檢測 TCDD 處理后 MEPM 細胞 RUNX2 和 OPN 蛋白表達 1～4：處理后 0、1、2、3 d
Figure3. Morphological observation of MEPM cells and Western blot detectiona. The 3rd passage MEPM cells before TCDD treatment (Inverted phase contrast microscope×200); b. The 3rd passage MEPM cells after TCDD treatment (Inverted phase contrast microscope×200); c. The expressions of RUNX2 and OPN proteins detected by Western blot in MEPM cells after TCDD treatment 1-4: 0, 1, 2, 3 days after treatment, respectively
2.3 MEPM 細胞轉染及觀測
2.3.1 實時熒光定量 PCR 檢測
轉染 48 h 后，沉默表達組及其對照組 miR-381-3p 相對表達量分別為 0.26±0.08、1.03±0.33，差異有統計學意義（t=3.873，P=0.018），沉默效率為 74.75%。過表達組及其對照組 miR-381-3p 相對表達量分別為 553.20±49.76、1.01±0.20，過表達組 miR-381-3p 表達量顯著上調，差異有統計學意義（t=19.220，P=0.000）。
2.3.2 Western blot 檢測
沉默表達組 RUNX2 及 OPN 蛋白相對表達量分別為 0.59±0.02、0.65±0.02，較對照組 1.00±0.02、1.00±0.02 明顯下降，差異有統計學意義（t=11.830，P=0.000；t=9.589，P=0.000）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測轉染 48 h 后 MEPM 細胞 OPN 和 RUNX2 蛋白表達
1：沉默表達對照組 2：沉默表達組 3：過表達對照組4：過表達組
Figure4. Western blot analysis of OPN and RUNX2 protein expressions in MEPM cells at 48 hours after transfection1: NC inhibitor group 2: Inhibitor group 3: NC mimics group 4: Mimics group
過表達組 RUNX2 及 OPN 蛋白相對表達量分別為 1.54±0.11、1.59±0.11，較對照組 1.00±0.05、1.00±0.10 升高，差異均有統計學意義（t=4.327，P=0.012；t=3.729，P=0.020）。見圖 4。
3 討論
腭部發育需要基因精確的時空表達，這受大量轉錄因子及對應的 DNA 基序位點形成的復雜網絡調控，對網絡的細微干擾均會導致腭裂發生[12]。miRNAs 是一類有調節功能的小非編碼 RNA，廣泛參與胚胎發育的調控。miRNAs 主要是通過轉錄后調控來抑制基因表達發揮功能 [13]。而 miRNAs 在轉錄后水平抑制基因表達，主要通過降解靶基因的 mRNA 或者抑制靶基因翻譯完成。許多 miRNAs 已被證實在多種先天疾病發揮作用。目前斑馬魚和小鼠模型相關研究發現，miRNAs 在正常腭部發育和腭裂形成中均是關鍵調節因子。條件性敲除 Dicer 會引起小鼠顱面部嚴重畸形，而 Dicer 是一種加工成熟 miRNAs 所必須的功能蛋白[14]。在腭部發育過程中，適量 miR-140 表達是神經嵴細胞遷移所必需的條件[15]。miR-17-92 簇參與了腭突生長的調節[16]。miR-200b 過表達會造成腭中縫持續存在導致腭融合失敗[17]。可見 miRNAs 在兩側腭突的生長、抬高和融合中發揮重要作用。
研究發現，miRNAs 對成骨分化具有調控作用[18]。本研究發現，在 TCDD 致胎鼠腭裂模型中，E13.5 和 E14.5 胎鼠腭突組織 miR-381-3p 相對表達量較對照組降低。腭發育的重要信號通路，如 TGF-β 超家族（包括 BMP）、Wnt/β-Catenin 和 Hedgehog 信號通路中的關鍵分子，均是 miR-381-3p 靶基因[8]，而這些通路與成骨分化也密切相關[19-20]。腭骨形成缺陷與腭融合失敗互為因果：雙側腭突接觸融合開始時，啟動 MEPM 細胞的成骨分化；若腭的成骨分化受到干擾，雙側腭突即使已經融合亦會復裂；延遲的成骨分化又促成了腭裂的發生[21]。多項研究發現 TCDD 抑制成骨分化[22-23]。RUNX2 和 OPN 蛋白是成骨分化的標志物，是成骨分化所必需的轉錄因子。本研究亦發現，TCDD 組 E14.5 腭突組織 RUNX2 和 OPN 蛋白表達較對照組低，與 Yamada 等[5]的發現類似，表明 TCDD 可能抑制腭的成骨分化。體外 TCDD 處理 MEPM 細胞后 0.5、1 d，miR- 381-3p 表達較 0 d 明顯降低，隨后又逐漸回升至 0 d 水平；與此同時，RUNX2 和 OPN 蛋白相對表達量亦明顯下降。體內、外實驗結果一致，均提示 TCDD 同時抑制 MEPM 細胞成骨分化和 miR-381-3p 的表達。
為進一步探索在 TCDD 干擾下，腭發育早期 miR-381-3p 表達下調與腭成骨分化抑制是否存在關聯，本研究在體外應用 miR-381-3p 模擬物和抑制物分別轉染胎鼠 MEPM 細胞，制備 miR-381-3p 功能獲得性和功能缺失性細胞模型，并分別采用實時熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測各自轉染效率和成骨分化標志物的表達變化，發現在 miR-381-3p 下調的 MEPM 細胞中 RUNX2 和 OPN 蛋白表達較對照組降低，而 miR-381-3p 過表達的 MEPM 細胞 RUNX2 和 OPN 蛋白表達明顯上調。該結果提示 miR-381-3p 正向調控 RUNX2 和 OPN 蛋白表達，可能促進 MEPM 細胞成骨分化。但如前述，miRNAs 主要通過抑制基因表達發揮調控作用。有學者發現，在軟骨細胞中正向操作 miR-381-3p 會抑制去乙酰化酶 4 的表達，RUNX2 蛋白表達上調；而沉默去乙酰化酶 4 亦會引起 RUNX2 蛋白表達升高[9]。結合本研究結果，我們認為 miR-381-3p 并非直接作用于 RUNX2 和 OPN mRNA 的 3p 非翻譯區，而是通過某個負性中間分子介導來發揮作用的。
綜上述，TCDD 致胎鼠腭裂模型中，TCDD 抑制繼發腭成骨分化和 miR-381-3p 表達，miR-381-3p 可能間接調控 MEPM 細胞的成骨分化；miR-381-3p 表達下調可能是繼發腭成骨分化受到抑制的原因之一。但對于 miR-381-3p 調控腭成骨分化的直接作用機制尚不清楚，仍需要深入研究。
作者貢獻：蔣亨負責科研具體設計、實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；袁心剛負責科研設計、實施過程中的指導；傅躍先負責科研課題方向性框架的提出，數據及統計的審查，文章審查和修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經重慶醫科大學醫學研究倫理委員會批準（2017012002）。動物使用許可證號：SYXK（渝）2017-0012。所有動物實驗均符合實驗室動物倫理標準，所有動物殘余組織均由動物實驗中心給予生物無害化處理。
腭裂是最常見的出生缺陷之一[1]。繼發腭的形成需要經過兩側腭突的生長、抬高、接觸黏附和融合，其中任一過程中斷均會導致腭裂發生[2]。因小鼠繼發腭發育與人類相似，腭部發育研究常選擇其作為動物模型[3]。在小鼠腭發育中，胚胎日第 13.5 天（embryonic day 13.5，E13.5）時兩側腭突垂直于舌體兩側生長，E14.5 時兩側腭突迅速抬高至舌體上方的水平方向并向對側生長，于中部與對側接觸黏附形成腭中縫，隨后腭中縫降解，兩側腭間充質（mouse embryonic palatal mesenchymal，MEPM）匯合，其連續性得以建立；與此同時，胎鼠 MEPM 開始分化成骨和肌肉，分別形成硬腭和軟腭[4]。2，3，7，8-四氯二苯二英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）是環境污染物，在動物和人類中都具有發育毒性，在發育的小鼠胚胎中會導致腭裂發生率增高，抑制腭部成骨分化和肌肉生長，導致雙側腭突融合后復裂[5]。
研究表明，環境因素介導基因轉錄后水平的調節是通過非編碼 RNAs（如 miRNAs）來完成的[6]。miRNAs 調節基因的表達在多種疾病的發生發展中發揮著重要作用，例如與小鼠、斑馬魚甚至人類的腭裂發生相關[7]。生物信息學分析發現，miR-381-3p 調節多個已知與腭裂相關的基因，如 TGF-β3、Smo、Msx2 和 Bmp1r 等[8]，而且可上調成骨細胞特異性轉錄因子 RUNX2 的表達，促進軟骨細胞的生長[9]。MEPM 細胞來源于神經嵴細胞，隨著雙側腭突開始融合，MEPM 細胞通過膜內成骨分化形成腭骨[10]。本研究旨在觀察 TCDD 作用于 MEPM 細胞后，miR-381-3p 及成骨分化標志物 RUNX2、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達變化，以及 miR-381-3p 對 MEPM 細胞成骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡 SPF 級建康 C57BL/6J 小鼠 52 只，雌性 40 只、雄性 12 只，體質量 18～20 g；購自重慶醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（渝）20050002；飼養于 SPF 級動物實驗室，溫度 22～24℃，濕度 55%±5%，循環光照明暗各 12 h，普通實驗室飼料、水源，自由飲水、攝食。
TCDD（Sigma-Aldrich 公司，美國）；DMEM/F12、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；青霉素+鏈霉素雙抗（上海碧云天生物技術有限公司）；PBS 磷酸鹽緩沖粉劑（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；Dispase Ⅱ酶（上海翊盛生物科技有限公司）；DMSO（Sigma 公司，美國）；miR-381-3p 抑制物及對照物、miR-381-3p 模擬物及對照物（上海吉熒生物技術有限公司）；All-in-oneTMqPCR Mix、EndoFectinTM-MAX 轉染試劑（GeneCopoeia 公司，美國）；Biospin miRNA 提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）；miRNA 第 1 鏈 cDNA 合成（莖環法）試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；細胞組織全蛋白提取試劑盒（新賽美生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、抗 β-actin 多克隆抗體、抗 RUNX2 多克隆抗體、超敏 ECL 化學發光試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司）；抗 OPN 多克隆抗體（Proteintech 公司，美國）；二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
體式顯微鏡 DXM1200F、倒置光學/熒光多功能顯微鏡（Nikon 公司，日本）；細胞培養瓶、培養皿（Corning 公司，美國）；NanoDrop 2000 分光光度計、移液器、細胞培養箱、普通 PCR 儀和生物安全柜、Biofuge Primo 臺式離心機（Thermo 公司，美國）；CFX96 實時熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad，美國）； ECL 顯影儀 Gene Gnome 5（Gene 公司，美國）。
1.2 TCDD 對胎鼠腭部發育影響觀察
1.2.1 實驗分組及方法
52 只 C57BL/6J 小鼠適應新環境 2 周后，于黃昏按雌雄比例 2∶1 或 3∶1 合籠交配，次日晨雌雄分籠，檢查雌鼠陰栓，稱重標記；記錄當天為 E0.5，觀察體質量至 E10.5；體質量增長小于 2 g 者視為未孕，重新合籠。最后獲取 32 只符合要求的孕鼠用于實驗。
將 32 只孕鼠隨機分為 TCDD 組與對照組，每組 16 只。E10.5 時，TCDD 組孕鼠按 28 μg/kg（以玉米油配制成 5 μg /mL）一次性灌胃 TCDD；對照組一次性灌胃等體積玉米油。各組孕鼠分別在 E13.5 和 E14.5 時取 8 只 CO2 麻醉處死。無菌條件下，配合體式顯微鏡從孕鼠子宮取出胎鼠，剪取胎鼠頭部，大體觀察腭突生長情況。
1.2.2 實時熒光定量 PCR 檢測 miR-381-3p
取兩組 E13.5 和 E14.5 腭突組織，采用 Biospin miRNA 提取試劑盒提取 miRNAs。使用 miRNA 第 1 鏈 cDNA 合成（莖環法）試劑盒進行逆轉錄，體系為 20 μL，包括：2×miRNA L-RT Solution mix 10 μL，miRNA L-RT Enzyme mix 1.5 μL，miRNA 2 μg，莖環引物（10 μmol/L）1 μL，U6 下游引物（10 μmol/L）1 μL，去酶水定容 20 μL；反應條件：16℃ 30 min，37℃ 30 min，85℃ 5min。逆轉錄反應液被稀釋 2 倍并作 3 個復孔，每孔反應體系共 10 μL，包括：2×All-in-oneTMqPCR Mix 5 μL，上、下引物各 1 μL（2 μmol/L），cDNA 1 μL，去酶水 2 μL；反應條件：95℃ 預變性 10 min，40 個循環（95℃ 變性 10 s，57℃ 退火 20 s，延伸 72℃ 15 s）。以 U6 為內參基因，使用 2?ΔΔCt方法計算 miR-381-3p 相對表達量。miR-381-3p 和 U6 逆轉錄引物及 PCR 引物設計和合成均由上海生工生物工程技術有限公司完成，根據 NCBI Nucleotide 數據庫，比對引物特異性，引物序列見表 1。實驗重復 3 次。
表1
miR-381-3p 和 U6 的逆轉錄引物、實時熒光定量 PCR 上下游引物及 miR-381-3p 抑制物和模擬物序列
Table1.
Reverse transcription primers, upstream and downstream primers of real-time fluorescent quantitative PCR, inhibitor and mimics sequences for miR-381-3p
1.2.3 Western blot 檢測 RUNX2 和 OPN 蛋白
取兩組 E14.5 腭突組織，采用細胞組織全蛋白提取試劑盒提取總蛋白。使用 BCA 蛋白濃度定量試劑盒測定每個樣品中總蛋白質的濃度。使用 SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒制備 8%SDS-PAGE 凝膠，電泳分離蛋白質并轉移到 PVDF 膜。將膜浸入含 5% 脫脂奶粉的 TBST 溶液，在室溫下搖床封閉 2～3 h；將膜分別與抗 RUNX2 蛋白多克隆抗體（1∶300）、抗 OPN 多克隆抗體（1∶500）、抗 β-actin 多克隆抗體（1∶1 000）4℃ 孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h，以超敏 ECL 試劑顯影拍照，Image J 分析灰度值。與 β-actin 條帶灰度值的比值來表示目的蛋白相對表達量。實驗重復 3 次。
1.3 MEPM 細胞分離培養及觀測
1.3.1 MEPM 細胞分離及傳代
無菌條件下，參考 Feng 等[11]的方法提取原代細胞。具體步驟：取 1.2 中獲得的對照組 E14.5 胎鼠腭突，置于 0.5% Dispase Ⅱ酶（DMEM/F12 稀釋）4℃ 過夜，期間搖勻 1～2 次。次日見上皮與 MEPM 明顯分離后，顯微外科器械剝離上皮，余下的 MEPM 用 0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化吹打；待其分離為絮狀物時，用完全培養基終止消化，繼續吹打至單細胞懸液，以離心半徑 14 cm，1 200 r/min 離心 5 min；細胞重懸，接種于 75 cm2培養瓶，加入完全培養基（含 90%DMEM/F12 培養基、10%FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素），置于 37℃、5%CO2 及 95% 飽和濕度恒溫培養箱培養 30 min；棄去培養液（差速貼壁法去除殘留上皮細胞），加入新的完全培養液繼續培養；重復 1 次。每 2～3 天換液 1 次進行傳代。取第 3 代細胞進行觀測。
1.3.2 TCDD 體外處理 MEPM 細胞及觀測
TCDD 溶于 DMSO 并加入完全培養基，TCDD 終濃度為 10 nmol/L，DMSO 終濃度小于 0.05%。取第 3 代 MEPM 細胞以 50% 左右密度接種于直徑 6 cm 培養皿中，次日更換含 10 nmol/L TCDD 的完全培養基。TCDD 處理后 0（對照）、0.5、1、2、3 d，取細胞參照 1.2.2 實時熒光定量 PCR 檢測 miR-381-3p 表達；0、1、2、3 d 時參照 1.2.3 Western blot 檢測 RUNX2 和 OPN 蛋白表達。實驗重復 3 次。
1.4 MEPM 細胞轉染及觀測
取第 3 代 MEPM 細胞，根據轉染內容不同分為 4 組。沉默表達組及對照組分別轉染 miR-381-3p 抑制物及對照物，過表達組及對照組分別轉染 miR-381-3p 模擬物及對照物。轉染物設計與合成均由上海吉熒生物技術有限公司完成，各轉染物序列見表 1。按照 EndoFectinTM-MAX 轉染試劑使用說明書轉染，過表達組及對照組轉染濃度為 75 nmol/L，沉默表達組及對照組轉染濃度為 100 nmol/L。
轉染 48 h 后取各組細胞采用實時熒光定量 PCR 檢測 miR-381-3p 表達，驗證 MEPM 細胞轉染 miR-381-3p 抑制物和模擬物效率；采用 Western blot 檢測 RUNX2 和 OPN 蛋白表達，分析沉默和過表達 miR-381-3p 對 MEPM 細胞成骨分化的影響，以及 MEPM 細胞轉染 miR-381-3p 模擬物后 miR-381-3p 過表達情況。實驗重復 3 次。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 24.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 胎鼠腭部發育形態學觀察
2.1.1 大體觀察
E13.5 和 E14.5 時，對照組從孕鼠獲得活胎鼠共計 96 只，死胎和吸收胎共 2 只；TCDD 組獲得活胎鼠共 92 只，死胎和吸收胎 3 只。E13.5 兩組活胎鼠可見雙側腭突生長，均未接觸，中間有較大間隙；E14.5 對照組活胎鼠可見雙側腭突接觸，TCDD 組活胎鼠可見雙側腭突未能接觸，中間有間隙。見圖 1。
圖1
胎鼠腭部形態學觀察（×20）
左側為 E13.5，右側為 E14.5；P 表示完整腭部，?表示兩側腭突裂隙 a. 對照組；b. TCDD 組
Figure1. Morphological changes of the palate in the control and TCDD groups on E13.5 and E14.5 (×20)Left for E13.5 and right for E14.5; P indicated the complete fusion palate and ? indicated the gap between bilateral palates a. Control group; b. TCDD group
2.1.2 實時熒光定量 PCR 檢測
TCDD 組 E13.5 和 E14.5 胎鼠腭突組織 miR-381-3p 相對表達量分別為 0.51±0.09、1.49±0.10，對照組為 1.25±0.15、2.05±0.09，TCDD 組明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=4.039，P=0.015；t=4.043，P=0.015）。
2.1.3 Western blot 檢測
TCDD 組 E14.5 胎鼠腭突組織 RUNX2 及 OPN 蛋白相對表達量分別為 0.69±0.06、0.56±0.03，均較對照組 1.00±0.05、1.00±0.03 降低，差異有統計學意義（t=3.529，P=0.024；t=8.288，P=0.001）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測 E14.5 胎鼠腭突組織 RUNX2 及 OPN 蛋白表達
1：對照組 2：TCDD 組
Figure2. The expressions of RUNX2 and OPN proteins in TCDD and control groups on E14.51: Control group 2: TCDD group
2.2 TCDD 處理 MEPM 細胞后觀測
2.2.1 實時熒光定量 PCR 檢測
TCDD 處理 MEPM 細胞 0、0.5、1、2、3 d 后，miR-381-3p 相對表達量分別為 1.00±0.12、0.43±0.09、0.61±0.09、1.00±0.08、1.18±0.05。其中，0.5 和 1 d 時 miR-381-3p 相對表達量較 0 d 時明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05）；2、3 d 時表達量明顯上升，與 0 d 時比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2.2 Western blot 檢測
TCDD 處理 MEPM 細胞 0、1、2、3 d 后，RUNX2 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.11、0.57±0.10、0.50±0.01、0.47±0.10；OPN 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.02、0.75±0.12、0.59±0.02、0.67±0.04。1、2、3 d 時 RUNX2 及 OPN 蛋白相對表達量均較 0 d 時顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；1、2、3 d 間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
MEPM 細胞形態觀察及 Western blot 檢測
a. TCDD 處理前第 3 代 MEPM 細胞（倒置相差顯微鏡×200）；b. TCDD 處理后第3 代 MEPM 細胞（倒置相差顯微鏡×200）；c. Western blot 檢測 TCDD 處理后 MEPM 細胞 RUNX2 和 OPN 蛋白表達 1～4：處理后 0、1、2、3 d
Figure3. Morphological observation of MEPM cells and Western blot detectiona. The 3rd passage MEPM cells before TCDD treatment (Inverted phase contrast microscope×200); b. The 3rd passage MEPM cells after TCDD treatment (Inverted phase contrast microscope×200); c. The expressions of RUNX2 and OPN proteins detected by Western blot in MEPM cells after TCDD treatment 1-4: 0, 1, 2, 3 days after treatment, respectively
2.3 MEPM 細胞轉染及觀測
2.3.1 實時熒光定量 PCR 檢測
轉染 48 h 后，沉默表達組及其對照組 miR-381-3p 相對表達量分別為 0.26±0.08、1.03±0.33，差異有統計學意義（t=3.873，P=0.018），沉默效率為 74.75%。過表達組及其對照組 miR-381-3p 相對表達量分別為 553.20±49.76、1.01±0.20，過表達組 miR-381-3p 表達量顯著上調，差異有統計學意義（t=19.220，P=0.000）。
2.3.2 Western blot 檢測
沉默表達組 RUNX2 及 OPN 蛋白相對表達量分別為 0.59±0.02、0.65±0.02，較對照組 1.00±0.02、1.00±0.02 明顯下降，差異有統計學意義（t=11.830，P=0.000；t=9.589，P=0.000）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測轉染 48 h 后 MEPM 細胞 OPN 和 RUNX2 蛋白表達
1：沉默表達對照組 2：沉默表達組 3：過表達對照組4：過表達組
Figure4. Western blot analysis of OPN and RUNX2 protein expressions in MEPM cells at 48 hours after transfection1: NC inhibitor group 2: Inhibitor group 3: NC mimics group 4: Mimics group
過表達組 RUNX2 及 OPN 蛋白相對表達量分別為 1.54±0.11、1.59±0.11，較對照組 1.00±0.05、1.00±0.10 升高，差異均有統計學意義（t=4.327，P=0.012；t=3.729，P=0.020）。見圖 4。
3 討論
腭部發育需要基因精確的時空表達，這受大量轉錄因子及對應的 DNA 基序位點形成的復雜網絡調控，對網絡的細微干擾均會導致腭裂發生[12]。miRNAs 是一類有調節功能的小非編碼 RNA，廣泛參與胚胎發育的調控。miRNAs 主要是通過轉錄后調控來抑制基因表達發揮功能 [13]。而 miRNAs 在轉錄后水平抑制基因表達，主要通過降解靶基因的 mRNA 或者抑制靶基因翻譯完成。許多 miRNAs 已被證實在多種先天疾病發揮作用。目前斑馬魚和小鼠模型相關研究發現，miRNAs 在正常腭部發育和腭裂形成中均是關鍵調節因子。條件性敲除 Dicer 會引起小鼠顱面部嚴重畸形，而 Dicer 是一種加工成熟 miRNAs 所必須的功能蛋白[14]。在腭部發育過程中，適量 miR-140 表達是神經嵴細胞遷移所必需的條件[15]。miR-17-92 簇參與了腭突生長的調節[16]。miR-200b 過表達會造成腭中縫持續存在導致腭融合失敗[17]。可見 miRNAs 在兩側腭突的生長、抬高和融合中發揮重要作用。
研究發現，miRNAs 對成骨分化具有調控作用[18]。本研究發現，在 TCDD 致胎鼠腭裂模型中，E13.5 和 E14.5 胎鼠腭突組織 miR-381-3p 相對表達量較對照組降低。腭發育的重要信號通路，如 TGF-β 超家族（包括 BMP）、Wnt/β-Catenin 和 Hedgehog 信號通路中的關鍵分子，均是 miR-381-3p 靶基因[8]，而這些通路與成骨分化也密切相關[19-20]。腭骨形成缺陷與腭融合失敗互為因果：雙側腭突接觸融合開始時，啟動 MEPM 細胞的成骨分化；若腭的成骨分化受到干擾，雙側腭突即使已經融合亦會復裂；延遲的成骨分化又促成了腭裂的發生[21]。多項研究發現 TCDD 抑制成骨分化[22-23]。RUNX2 和 OPN 蛋白是成骨分化的標志物，是成骨分化所必需的轉錄因子。本研究亦發現，TCDD 組 E14.5 腭突組織 RUNX2 和 OPN 蛋白表達較對照組低，與 Yamada 等[5]的發現類似，表明 TCDD 可能抑制腭的成骨分化。體外 TCDD 處理 MEPM 細胞后 0.5、1 d，miR- 381-3p 表達較 0 d 明顯降低，隨后又逐漸回升至 0 d 水平；與此同時，RUNX2 和 OPN 蛋白相對表達量亦明顯下降。體內、外實驗結果一致，均提示 TCDD 同時抑制 MEPM 細胞成骨分化和 miR-381-3p 的表達。
為進一步探索在 TCDD 干擾下，腭發育早期 miR-381-3p 表達下調與腭成骨分化抑制是否存在關聯，本研究在體外應用 miR-381-3p 模擬物和抑制物分別轉染胎鼠 MEPM 細胞，制備 miR-381-3p 功能獲得性和功能缺失性細胞模型，并分別采用實時熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測各自轉染效率和成骨分化標志物的表達變化，發現在 miR-381-3p 下調的 MEPM 細胞中 RUNX2 和 OPN 蛋白表達較對照組降低，而 miR-381-3p 過表達的 MEPM 細胞 RUNX2 和 OPN 蛋白表達明顯上調。該結果提示 miR-381-3p 正向調控 RUNX2 和 OPN 蛋白表達，可能促進 MEPM 細胞成骨分化。但如前述，miRNAs 主要通過抑制基因表達發揮調控作用。有學者發現，在軟骨細胞中正向操作 miR-381-3p 會抑制去乙酰化酶 4 的表達，RUNX2 蛋白表達上調；而沉默去乙酰化酶 4 亦會引起 RUNX2 蛋白表達升高[9]。結合本研究結果，我們認為 miR-381-3p 并非直接作用于 RUNX2 和 OPN mRNA 的 3p 非翻譯區，而是通過某個負性中間分子介導來發揮作用的。
綜上述，TCDD 致胎鼠腭裂模型中，TCDD 抑制繼發腭成骨分化和 miR-381-3p 表達，miR-381-3p 可能間接調控 MEPM 細胞的成骨分化；miR-381-3p 表達下調可能是繼發腭成骨分化受到抑制的原因之一。但對于 miR-381-3p 調控腭成骨分化的直接作用機制尚不清楚，仍需要深入研究。
作者貢獻：蔣亨負責科研具體設計、實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；袁心剛負責科研設計、實施過程中的指導；傅躍先負責科研課題方向性框架的提出，數據及統計的審查，文章審查和修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經重慶醫科大學醫學研究倫理委員會批準（2017012002）。動物使用許可證號：SYXK（渝）2017-0012。所有動物實驗均符合實驗室動物倫理標準，所有動物殘余組織均由動物實驗中心給予生物無害化處理。
