引用本文： 張憶, 周利, 唐林巧, 秦廷武, 寧良菊. 一種用于肌腱膠原纖維束及周圍腱內膜組分分布形態學觀察的快速組織學制片方法研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(9): 1169-1173. doi: 10.7507/1002-1892.201903101 復制
利用天然肌腱制備組織工程支架材料研究中，肌腱組織的脫細胞處理是難點。肌腱組織屬于致密結締組織，比表面積小，直接采用常用的物理、化學、生物脫細胞方法脫細胞效果不佳。所以，學者們提出對肌腱切片后再進行脫細胞處理，但切片厚度對肌腱的結構和力學特性有影響。肌腱表面為腱外膜，其內有腱內膜將肌腱纖維束分為第 1、2、3 級 3 個不同等級的腱束[1-2]。研究表明，決定肌腱力學特性的最小單元是第 2 級腱束，即膠原纖維束，因此切片只要能保留該結構，肌腱力學特性就能基本保留[3]。
為明確肌腱切片中膠原纖維束的完整性，需要進行組織學觀察。然而，傳統 HE、Masson 及免疫學染色方法存在操作繁瑣、試劑與時間成本高、準確度差、無法觀察到組分分布細節等缺點。我們結合前期制片經驗，摸索出一種用于肌腱膠原纖維束及周圍腱內膜組分分布形態學觀察的快速組織學制片法，即冰凍切片制樣后先于 65℃ 烘烤 10 min 再行 Masson 染色。該方法不僅將整個染色實驗周期從傳統石蠟制樣的 2 d 縮短至 30 min 以內，還能清晰顯示膠原纖維束與周圍腱內膜分布。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
過碘酸雪夫（Priodic acid-Shiff，PAS）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；網狀纖維染色試劑盒、Masson 染色試劑盒（珠海貝索生物技術有限公司）；Ⅲ型膠原抗體（Abcam 公司，英國）；OCT 冰凍切片包埋劑（Tissue-Tek 公司，美國）。冰凍切片機（Leica 公司，德國）；烘箱（Binder 公司，德國）；熒光顯微鏡（ZEISS 公司，德國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 冰凍切片制備及觀察
將市售新鮮豬趾淺屈肌腱橫切為 1 cm 長度，OCT 包埋后，使用冰凍切片機里預冷的冷凍錘對組織進行快速降溫包埋，于–20℃ 行 6 μm 厚切片。大體觀察切片完整性后，取部分切片置于 10% 中性甲醛中固定 5 min，蘇木素染色 5 min，分化促藍后，伊紅染色 1 min，晾干封片。顯微鏡下觀察組織完整性與冰晶形成情況。
1.2.2 實驗分組及方法
根據染色方法不同，將 1.2.1 中制備的切片隨機分為 5 組。A 組行 PAS 染色，B 組行 Masson 染色，C 組行網狀纖維染色，D 組分別行Ⅲ型膠原免疫組織化學和免疫熒光染色，E 組切片先于烘箱經 65℃ 烘烤 10 min 后再行 Masson 染色。顯微鏡下觀察肌腱膠原纖維束與周圍腱內膜組分分布情況。
2 結果
2.1 冰凍切片觀察
大體觀察切片連續均勻，無肉眼可見空洞。HE 染色見組織整體結構完整清晰，無冰晶空隙形成，但無法觀察到膠原纖維束與周圍腱內膜組分分布情況。見圖 1。
圖1
肌腱冰凍切片觀察
a. 肌腱橫切；b. 冷凍錘迅速降溫；c. 制備冰凍切片；d. 大體觀察組織連續完整；e. HE 染色觀察（×50）；f. HE 染色觀察（×100）
Figure1. Observation of tendon sliced into sections by frozen section technologya. Crosscutting the tendon; b. Tendon was cooled rapidly by freezing hammer; c. Frozen section; d. Section was complete and continuous; e. HE staining (×50); f. HE staining (×100)
2.2 不同方法染色后觀察
A 組：組織整體呈紅色，膠原纖維束與周圍腱內膜顯色無明顯差異，無法清楚辨認組分分布。B 組：組織整體被苯胺藍染色，呈藍色，無法辨認組分分布。C 組：膠原纖維束與周圍腱內膜均呈褐色顯色，無法清楚辨認組分分布。D 組：周圍腱內膜呈Ⅲ型膠原陽性表達，組分差異化染色，但對比度較差。E 組：周圍腱內膜被苯胺藍染色，呈藍色，膠原纖維束被麗春紅染色，呈紅色，組分清晰可見。見圖 2。
圖2
各組染色觀察
上排為×50，下排為×100 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組免疫組織化學染色；e. D 組免疫熒光染色；f. E 組
Figure2. Observation in different groupsTop panels for ×50, bottom panels for ×100 a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D by immunohistochemical staining; e. Group D by immunofluorescent staining; f. Group E
3 討論
Masson 染色是病理技術中常規及廣泛使用的制片方法，在組織形態學評價方面具有重要作用[4-9]，目前主要用于區別膠原纖維和肌纖維，但常需要與石蠟切片配合操作[10-12]，這與 Masson 染色的染色原理有關。Masson 染色是根據組織中膠原纖維與肌纖維不同的滲透性能，選擇分子大小不同的陰離子染料進行差異化染色。而石蠟組織經充分固定、脫水、浸蠟后，將膠原纖維和肌纖維的滲透性能的差異放大，所以石蠟切片行 Masson 染色更容易。但正是由于石蠟制片經歷的以上步驟，會導致肌腱組織發生收縮，從而影響對膠原纖維束直徑的計算[13-14]。同時，肌腱屬于致密結締組織，完整肌腱石蠟包埋后硬度極高，切片時難以完整保留組織。所以我們提出了一種既不會對組織產生收縮作用，又能保證切片完整性的冰凍切片方法。傳統冰凍切片在制片過程中往往因為冰晶形成破壞了組織的形態結構，所以在進行 OCT 包埋時，我們采用事先預冷的冷凍錘對包埋組織進行快速降溫，讓其在較短時間內越過冰晶易形成的溫度，保護了冰凍切片的微觀完整性[15-17]。
為探討這種組織學制片方法能否用于肌腱膠原纖維束及周圍腱內膜組分分布形態學觀察，我們對目前常用的幾種染色方法進行了比較。A 組是常用的糖蛋白染色法，考慮到基底膜組織中含有較為豐富的糖蛋白，該方法可以使周圍腱內膜單獨顯色[18-20]。但肌腱組織較為特殊，為了保持其足夠的力學強度，構成膠原纖維束的肌腱纖維之間也含有大量的糖蛋白[21-22]，所以 PAS 染色后組織整體呈陽性顯色。B 組直接進行 Masson 染色，但不管是膠原纖維束還是周圍腱內膜，其本質都是膠原纖維，所以整體呈藍色顯色。膠原纖維束主要由Ⅰ型膠原構成，周圍腱內膜由Ⅰ型膠原與少量Ⅲ型膠原共同構成，同時Ⅲ型膠原又是構成網狀纖維的主要成分[23-25]，所以 C 組選用網狀纖維染色法來顯示周圍腱內膜。利用網狀纖維具有的嗜銀特性，將銀溶液中的銀還原為不溶性的黑色金屬銀沉淀來單獨顯色[26-27]。其嗜銀原理本質是氨銀絡合物染料與網狀纖維表層的糖蛋白發生特異性結合，但膠原纖維束中也含有大量糖蛋白，導致肌腱組織整體出現嗜銀結果，膠原纖維束與周圍腱內膜差異化染色不明顯，并且嗜銀染色大多是在石蠟切片后進行，流程極為繁瑣，染色條件要求苛刻[28]。D 組直接利用Ⅲ型膠原抗體對周圍腱內膜進行免疫特異性結合，該方法能準確顯示肌腱組織中周圍腱內膜的分布情況，但兩組分對比度較差。因為肌腱組織中除Ⅰ型膠原以外，其余類型膠原含量不到膠原總量的 2%～3%[29]，所以免疫組織化學染色顯色較弱，只能通過熒光拍照和圖像處理技術放大熒光信號后才有一定對比度。同時，該方法試劑成本較高，抗體孵育過程耗時長。
E 組跟 B 組相比，同樣是采用 Masson 染色方法，但 E 組在染色前對冰凍切片進行了高溫烘烤處理，達到膠原纖維束被小分子麗春紅染料顯紅色，周圍腱內膜被大分子苯胺藍染料顯藍色，清楚表征肌腱組織膠原纖維束與周圍腱內膜組分分布的目的。E 組方法能將同是膠原纖維構成的兩組分進行差異化染色，這與膠原纖維束與周圍腱內膜存在結構差異有關。膠原纖維束因提供強大抗拉功能，其絕大多數膠原纖維呈有序的緊密平行排列；而周圍腱內膜起支持和營養作用，其纖維呈明顯的疏松網狀分布[26]。肌腱冰凍切片在進行高溫烘烤時，膠原纖維束與周圍腱內膜出現不同程度收縮，從而導致 Masson 染色時兩種組分對麗春紅與苯胺藍兩種染料分子出現較大差異的組織滲透性。但使用 E 組方法時需注意把握冰凍切片的烘烤程度，烘烤時間不夠，兩組分組織滲透壓差異不大，小分子麗春紅染料難以附著；烘烤時間太長，組織整體收縮過度，大分子苯胺藍染料難以附著。
綜上述，本實驗將新鮮豬趾淺屈肌腱直接通過冰凍切片、65℃ 烘烤 10 min 后 Masson 染色，成功對組織中膠原纖維束與周圍腱內膜進行快速差異化染色。在制備肌腱片狀支架材料時，可用此方法觀察肌腱組織學形態，以指導保護材料的生物力學性能。
作者貢獻：張憶負責實驗設計、本文染色方法摸索與圖像采集、文章撰寫；周利負責部分實驗實施（PAS、Masson、網狀纖維染色）及圖像采集；唐林巧負責部分實驗實施（免疫組織化學染色、免疫熒光染色）及圖像采集；秦廷武負責科研設計，參與文章修改；寧良菊負責科研設計及文章修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點及其報道。
利用天然肌腱制備組織工程支架材料研究中，肌腱組織的脫細胞處理是難點。肌腱組織屬于致密結締組織，比表面積小，直接采用常用的物理、化學、生物脫細胞方法脫細胞效果不佳。所以，學者們提出對肌腱切片后再進行脫細胞處理，但切片厚度對肌腱的結構和力學特性有影響。肌腱表面為腱外膜，其內有腱內膜將肌腱纖維束分為第 1、2、3 級 3 個不同等級的腱束[1-2]。研究表明，決定肌腱力學特性的最小單元是第 2 級腱束，即膠原纖維束，因此切片只要能保留該結構，肌腱力學特性就能基本保留[3]。
為明確肌腱切片中膠原纖維束的完整性，需要進行組織學觀察。然而，傳統 HE、Masson 及免疫學染色方法存在操作繁瑣、試劑與時間成本高、準確度差、無法觀察到組分分布細節等缺點。我們結合前期制片經驗，摸索出一種用于肌腱膠原纖維束及周圍腱內膜組分分布形態學觀察的快速組織學制片法，即冰凍切片制樣后先于 65℃ 烘烤 10 min 再行 Masson 染色。該方法不僅將整個染色實驗周期從傳統石蠟制樣的 2 d 縮短至 30 min 以內，還能清晰顯示膠原纖維束與周圍腱內膜分布。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
過碘酸雪夫（Priodic acid-Shiff，PAS）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；網狀纖維染色試劑盒、Masson 染色試劑盒（珠海貝索生物技術有限公司）；Ⅲ型膠原抗體（Abcam 公司，英國）；OCT 冰凍切片包埋劑（Tissue-Tek 公司，美國）。冰凍切片機（Leica 公司，德國）；烘箱（Binder 公司，德國）；熒光顯微鏡（ZEISS 公司，德國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 冰凍切片制備及觀察
將市售新鮮豬趾淺屈肌腱橫切為 1 cm 長度，OCT 包埋后，使用冰凍切片機里預冷的冷凍錘對組織進行快速降溫包埋，于–20℃ 行 6 μm 厚切片。大體觀察切片完整性后，取部分切片置于 10% 中性甲醛中固定 5 min，蘇木素染色 5 min，分化促藍后，伊紅染色 1 min，晾干封片。顯微鏡下觀察組織完整性與冰晶形成情況。
1.2.2 實驗分組及方法
根據染色方法不同，將 1.2.1 中制備的切片隨機分為 5 組。A 組行 PAS 染色，B 組行 Masson 染色，C 組行網狀纖維染色，D 組分別行Ⅲ型膠原免疫組織化學和免疫熒光染色，E 組切片先于烘箱經 65℃ 烘烤 10 min 后再行 Masson 染色。顯微鏡下觀察肌腱膠原纖維束與周圍腱內膜組分分布情況。
2 結果
2.1 冰凍切片觀察
大體觀察切片連續均勻，無肉眼可見空洞。HE 染色見組織整體結構完整清晰，無冰晶空隙形成，但無法觀察到膠原纖維束與周圍腱內膜組分分布情況。見圖 1。
圖1
肌腱冰凍切片觀察
a. 肌腱橫切；b. 冷凍錘迅速降溫；c. 制備冰凍切片；d. 大體觀察組織連續完整；e. HE 染色觀察（×50）；f. HE 染色觀察（×100）
Figure1. Observation of tendon sliced into sections by frozen section technologya. Crosscutting the tendon; b. Tendon was cooled rapidly by freezing hammer; c. Frozen section; d. Section was complete and continuous; e. HE staining (×50); f. HE staining (×100)
2.2 不同方法染色后觀察
A 組：組織整體呈紅色，膠原纖維束與周圍腱內膜顯色無明顯差異，無法清楚辨認組分分布。B 組：組織整體被苯胺藍染色，呈藍色，無法辨認組分分布。C 組：膠原纖維束與周圍腱內膜均呈褐色顯色，無法清楚辨認組分分布。D 組：周圍腱內膜呈Ⅲ型膠原陽性表達，組分差異化染色，但對比度較差。E 組：周圍腱內膜被苯胺藍染色，呈藍色，膠原纖維束被麗春紅染色，呈紅色，組分清晰可見。見圖 2。
圖2
各組染色觀察
上排為×50，下排為×100 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組免疫組織化學染色；e. D 組免疫熒光染色；f. E 組
Figure2. Observation in different groupsTop panels for ×50, bottom panels for ×100 a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D by immunohistochemical staining; e. Group D by immunofluorescent staining; f. Group E
3 討論
Masson 染色是病理技術中常規及廣泛使用的制片方法，在組織形態學評價方面具有重要作用[4-9]，目前主要用于區別膠原纖維和肌纖維，但常需要與石蠟切片配合操作[10-12]，這與 Masson 染色的染色原理有關。Masson 染色是根據組織中膠原纖維與肌纖維不同的滲透性能，選擇分子大小不同的陰離子染料進行差異化染色。而石蠟組織經充分固定、脫水、浸蠟后，將膠原纖維和肌纖維的滲透性能的差異放大，所以石蠟切片行 Masson 染色更容易。但正是由于石蠟制片經歷的以上步驟，會導致肌腱組織發生收縮，從而影響對膠原纖維束直徑的計算[13-14]。同時，肌腱屬于致密結締組織，完整肌腱石蠟包埋后硬度極高，切片時難以完整保留組織。所以我們提出了一種既不會對組織產生收縮作用，又能保證切片完整性的冰凍切片方法。傳統冰凍切片在制片過程中往往因為冰晶形成破壞了組織的形態結構，所以在進行 OCT 包埋時，我們采用事先預冷的冷凍錘對包埋組織進行快速降溫，讓其在較短時間內越過冰晶易形成的溫度，保護了冰凍切片的微觀完整性[15-17]。
為探討這種組織學制片方法能否用于肌腱膠原纖維束及周圍腱內膜組分分布形態學觀察，我們對目前常用的幾種染色方法進行了比較。A 組是常用的糖蛋白染色法，考慮到基底膜組織中含有較為豐富的糖蛋白，該方法可以使周圍腱內膜單獨顯色[18-20]。但肌腱組織較為特殊，為了保持其足夠的力學強度，構成膠原纖維束的肌腱纖維之間也含有大量的糖蛋白[21-22]，所以 PAS 染色后組織整體呈陽性顯色。B 組直接進行 Masson 染色，但不管是膠原纖維束還是周圍腱內膜，其本質都是膠原纖維，所以整體呈藍色顯色。膠原纖維束主要由Ⅰ型膠原構成，周圍腱內膜由Ⅰ型膠原與少量Ⅲ型膠原共同構成，同時Ⅲ型膠原又是構成網狀纖維的主要成分[23-25]，所以 C 組選用網狀纖維染色法來顯示周圍腱內膜。利用網狀纖維具有的嗜銀特性，將銀溶液中的銀還原為不溶性的黑色金屬銀沉淀來單獨顯色[26-27]。其嗜銀原理本質是氨銀絡合物染料與網狀纖維表層的糖蛋白發生特異性結合，但膠原纖維束中也含有大量糖蛋白，導致肌腱組織整體出現嗜銀結果，膠原纖維束與周圍腱內膜差異化染色不明顯，并且嗜銀染色大多是在石蠟切片后進行，流程極為繁瑣，染色條件要求苛刻[28]。D 組直接利用Ⅲ型膠原抗體對周圍腱內膜進行免疫特異性結合，該方法能準確顯示肌腱組織中周圍腱內膜的分布情況，但兩組分對比度較差。因為肌腱組織中除Ⅰ型膠原以外，其余類型膠原含量不到膠原總量的 2%～3%[29]，所以免疫組織化學染色顯色較弱，只能通過熒光拍照和圖像處理技術放大熒光信號后才有一定對比度。同時，該方法試劑成本較高，抗體孵育過程耗時長。
E 組跟 B 組相比，同樣是采用 Masson 染色方法，但 E 組在染色前對冰凍切片進行了高溫烘烤處理，達到膠原纖維束被小分子麗春紅染料顯紅色，周圍腱內膜被大分子苯胺藍染料顯藍色，清楚表征肌腱組織膠原纖維束與周圍腱內膜組分分布的目的。E 組方法能將同是膠原纖維構成的兩組分進行差異化染色，這與膠原纖維束與周圍腱內膜存在結構差異有關。膠原纖維束因提供強大抗拉功能，其絕大多數膠原纖維呈有序的緊密平行排列；而周圍腱內膜起支持和營養作用，其纖維呈明顯的疏松網狀分布[26]。肌腱冰凍切片在進行高溫烘烤時，膠原纖維束與周圍腱內膜出現不同程度收縮，從而導致 Masson 染色時兩種組分對麗春紅與苯胺藍兩種染料分子出現較大差異的組織滲透性。但使用 E 組方法時需注意把握冰凍切片的烘烤程度，烘烤時間不夠，兩組分組織滲透壓差異不大，小分子麗春紅染料難以附著；烘烤時間太長，組織整體收縮過度，大分子苯胺藍染料難以附著。
綜上述，本實驗將新鮮豬趾淺屈肌腱直接通過冰凍切片、65℃ 烘烤 10 min 后 Masson 染色，成功對組織中膠原纖維束與周圍腱內膜進行快速差異化染色。在制備肌腱片狀支架材料時，可用此方法觀察肌腱組織學形態，以指導保護材料的生物力學性能。
作者貢獻：張憶負責實驗設計、本文染色方法摸索與圖像采集、文章撰寫；周利負責部分實驗實施（PAS、Masson、網狀纖維染色）及圖像采集；唐林巧負責部分實驗實施（免疫組織化學染色、免疫熒光染色）及圖像采集；秦廷武負責科研設計，參與文章修改；寧良菊負責科研設計及文章修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點及其報道。
