引用本文： 申寧, 席曉云, 李飛, 呂超亮, 張普晟. 瑞香素聯合IGF-1對大鼠脂肪間充質干細胞成軟骨分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(6): 743-749. doi: 10.7507/1002-1892.201812063 復制
由于創傷、骨關節炎、感染等原因導致的關節軟骨損傷在骨科臨床常見。關節軟骨的組織學特性決定了其自身修復能力有限，損傷后如不治療，缺損可能繼續增大，導致軟骨合成、分解代謝障礙，最終引起關節軟骨功能喪失[1]。軟骨組織工程學的發展為治療關節軟骨損傷提供了新的契機，應用組織工程軟骨修復軟骨缺損成為近年熱門研究方向。
脂肪間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是來源于脂肪組織的成體干細胞，具有多向分化潛能[2]。近年的軟骨組織工程研究顯示，ADSCs 具有很強的成軟骨能力，且能保持穩定的軟骨細胞表型[3-4]。IGF-1 是促進軟骨細胞發育的重要生長因子之一，在細胞分裂增殖及細胞外基質的分泌過程中起重要作用[5]，能夠有效誘導 ADSCs 成軟骨分化[6]。瑞香素（dephnetin，DAP）又名祖師麻甲素，化學名 7，8-二羥基香豆素，是香豆素類化合物的代表性單體成分，是金邊瑞香中的主要提取物[7]，臨床上可用于關節退行性疾病的治療。但目前關于 DAP 對 ADSCs 成軟骨分化影響的研究較少，我們設想 DAP 對 ADSCs 成軟骨分化有促進作用，以期為臨床治療軟骨損傷提供新的思路。我們以大鼠 ADSCs 作為種子細胞，聯合應用 IGF-1 基因轉染技術和 DAP 處理，觀察二者聯合對于大鼠 ADSCs 成軟骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年 SD 大鼠 5 只，雌雄不限，體質量 200～250 g，由山東省實驗動物中心提供。動物實驗經濟寧醫學院實驗動物倫理委員會批準，實驗動物使用許可證批準號：SYXK（魯）20180002。
DMEM 培養基、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、FBS、PCR 引物（Thermo Fisher 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化工，日本）；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；IGF-1、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖（Aggrecan）抗體（Abcam 公司，英國）；過表達 IGF-1 的重組慢病毒（上海吉瑪制藥技術有限公司），且慢病毒均帶有綠色熒光標記；DAP 標準品（北京索萊寶科技有限公司）；CD29、CD34、CD45及CD105 抗體（eBioscience 公司，美國）；即用型 SABC-POD（兔 IgG）試劑盒、DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。CO2 細胞培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；倒置熒光顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 大鼠 ADSCs 分離與培養
取 5 只 SD 大鼠，腹腔注射過量水合氯醛麻醉致死，75% 乙醇浸泡 5 min 后，無菌條件下取出腹股溝脂肪組織。用含 1% 青鏈霉素雙抗的 PBS 沖洗 3 次，仔細剝離去除脂肪組織上的血管。將脂肪組織剪碎后轉移至 10 mL 離心管中，加入 5 倍體積的 0.1%Ⅰ型膠原酶溶液，37℃ 恒溫水浴消化 90 min。消化完成后，加入等量含 10%FBS 的 DMEM 培養基終止消化，過 200 目細胞篩去除大塊組織；以離心半徑 15 cm、1 500 r/min 離心 10 min，去除上清。加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基重懸細胞并計數，按 2×105個/孔密度接種至 6 孔板，于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養。48 h 后首次換液，PBS 沖洗 2 次以去除未貼壁細胞，之后每 2 天換液 1 次。待細胞生長融合至 80%～90% 時，進行傳代培養。倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態變化；取第 3 代 ADSCs 進行流式鑒定細胞表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105 表達。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 IGF-1 基因轉染
取狀態良好的第 3 代 ADSCs，以 3×105個/孔密度鋪于 6 孔板，37℃、5%CO2 細胞培養箱培養過夜，待細胞生長至 80% 匯合度時進行轉染。從超低溫冰箱取出攜帶 IGF-1 基因的慢病毒原液，冰浴溶化后用含 10%FBS 的 DMEM 準確稀釋；吸棄原孔板中的培養基，加入 1 mL 已稀釋的病毒液，輕輕晃勻。37℃、5%CO2 細胞培養箱孵育 6 h 后，更換新鮮培養液。48 h 后倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達及細胞生長情況；并取適量轉染后細胞，采用 Western blot 檢測 IGF-1 蛋白表達，以未轉染的 ADSCs 作為對照組；其余細胞及時換液。
Western blot 檢測方法：收集細胞，用 RIPA 裂解液冰上裂解細胞 30 min 后，于 4℃ 以離心半徑 10 cm、12 000 r/min 離心 10 min，取上清；加適量上樣緩沖液，沸水中煮 5 min 制備蛋白樣品；經 12%SDS-PAGE 100 V 恒壓電泳，250 mA 恒流濕轉膜 90 min，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上；5% 脫脂牛奶封閉 1 h 后，分別加入 IGF-1（1∶200）或 β-actin（1∶2 000）抗體，4℃ 孵育過夜；TBST 洗 3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），室溫下孵育 1 h，TBST 洗 4 次后行 ECL 顯色發光。采用 Image J 軟件進行灰度值分析，以目標蛋白與 β-actin 的灰度值比值作為蛋白相對表達量。
1.3.2 實驗分組
取未轉染的 ADSCs（對照組）和 IGF-1 基因轉染 48 h 的 ADSCs（實驗組），采用 0.25% 胰蛋白酶消化，調整細胞密度為 2.5×105個/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱過夜。細胞完全貼壁后，吸棄培養基，換成含不同濃度 DAP（0、30、60、90 μg/mL）的 10%FBS DMEM 培養基繼續培養。每組每個濃度設 5 個復孔。
1.4 觀測指標
1.4.1 CCK-8 法檢測細胞增殖活性
取對照組和實驗組不同濃度 DAP 培養 72 h 后細胞，于培養結束前 1 h 每孔分別加入 CCK-8 試劑 10 μL，37℃、5%CO2 細胞培養箱培養 1 h，酶聯免疫檢測儀檢測 450 nm 處吸光度（A）值。
1.4.2 實時熒光定量 PCR 檢測基因表達
取對照組和實驗組不同濃度 DAP 培養 14 d 的細胞，抽提總 RNA，逆轉錄為 cDNA。使用 Primer Premier 5.0 軟件設計目的基因的檢測引物，委托 Thermo Fisher 公司合成。引物序列：Ⅱ型膠原上游 5′-GCTCCCAGAACATCACCTACCA-3′，下游 5′-ACAGTCTTGCCCCACTTACCG-3′；Aggrecan 上游 5′-AGGTCGTGGTGAAAGGTGTTGTG-3′，下游 5′-TGGTGGAAGCCATCCTCGTAG-3′。采用 20 μL 反應體系：SYBR Green Master mix（2×）10 μL，引物（10 μmol/L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后 ddH2O 補足體積，混勻后上機檢測。反應條件：95℃ 預變性 10 min，95℃ 變性 15 s，58℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，40 個循環。以 β-actin 為內參，采用 2?ΔΔCt法計算成軟骨相關基因Ⅱ型膠原和 Aggrecan mRNA 相對表達量。
1.4.3 Western blot 檢測蛋白表達
取對照組和實驗組不同濃度 DAP 培養 14 d 的細胞，0.25% 胰蛋白酶消化后收集細胞，參照 1.3.1 方法行 Western blot 檢測 Ⅱ型膠原（1∶200）和 Aggrecan（1∶500）蛋白表達。
1.4.4 甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
取對照組和實驗組不同濃度 DAP 培養 14 d 的細胞爬片，4% 多聚甲醛固定細胞。每組取一半玻片浸泡于甲苯胺藍染色液中 5 min 后，蒸餾水沖洗、干燥封片，光鏡下觀察。另一半玻片用 5% 牛血清白蛋白于 37℃ 封閉 1 h，加入兔抗Ⅱ型膠原抗體，濕盒 37℃ 孵育 2 h，PBS 沖洗后加生物素化山羊抗兔 IgG 二抗，濕盒 37℃ 孵育 20 min，PBS 洗 3 遍，加 SABC 試劑濕盒 37℃ 孵育 20 min，PBS 洗 3 遍，加 DAB 顯色劑顯色 10 min，蘇木素復染，蒸餾水沖洗后封片，倒置熒光顯微鏡觀察。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各濃度組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞轉染前后觀察
分離出的 ADSCs 接種于細胞培養皿，24 h 時多數細胞貼壁；換液后，48～72 h 大部分貼壁細胞伸展；7 d 左右可見細胞生長達 80% 融合度，細胞呈紡錘形或長梭形，排列有序，漩渦狀生長。流式細胞儀檢測細胞表面抗原示，CD29、CD105 陽性率分別為 97.4% 和 95.3%，CD34、CD45 陽性率分別為 1.8% 和 1.2%。IGF-1 基因轉染 48 h 后，倒置熒光顯微鏡觀察，ADSCs 熒光陽性細胞比達 90% 以上。Western blot檢測顯示，轉染后細胞 IGF-1 蛋白相對表達量為 0.513±0.007，明顯高于未轉染細胞的 0.154±0.009，差異有統計學意義（t=31.490，P=0.001）。見圖 1~3。
圖1
大鼠 ADSCs 形態學觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
a. 轉染前培養 7 d；b. IGF-1 基因轉染 48 h
Figure1. Morphological observation of rat ADSCs (Inverted fluorescence microscope×200)a. Cultured for 7 days before transfection; b. Transfection of IGF-1 gene for 48 hours
圖2
流式細胞儀檢測大鼠 ADSCs 表面抗原表達
a. CD29；b. CD34；c. CD105；d. CD45
Figure2. Detection of ADSCs surface antigen expressions by flow cytometrya. CD29; b. CD34; c. CD105; d. CD45
圖3
Western blot 檢測轉染前后 ADSCs 的 IGF-1 蛋白表達
1：轉染前 2：轉染后
Figure3. Detection of IGF-1 protein expression of ADSCs before and after transfections by Western blot1: Before transfection 2: After transfection
2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖活性
隨 DAP 作用濃度增加，對照組和實驗組細胞 A 值均逐漸增加，各濃度組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）；相同 DAP 濃度下，實驗組細胞 A 值顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
CCK-8 法檢測不同濃度 DAP 對 ADSCs 增殖的影響（n=5，
）
Table1.
Effects of different concentrations of DAPs on ADSCs proliferation detected by CCK-8 assay (n=5, 
)
2.3 實時熒光定量 PCR 檢測基因表達
隨 DAP 作用濃度增加，對照組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan mRNA 相對表達量無明顯變化，各濃度組間差異無統計學意義（P>0.05）；實驗組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan mRNA 相對表達量逐漸增加，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組顯著高于 0 μg/mL DAP 濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）。其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。相同 DAP 濃度下，實驗組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan mRNA 相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測對照組和實驗組各濃度 DAP 作用下基因表達
a. Ⅱ型膠原；b. Aggrecan
Figure4. Gene expressions in control group and experimental group detected by real-time fluorescence quantitative PCR at different concentrations of DAPsa. Collagen type Ⅱ; b. Aggrecan
2.4 Western blot 檢測蛋白表達
隨 DAP 作用濃度增加，對照組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白相對表達量無明顯變化，各濃度組間差異無統計學意義（P>0.05）；實驗組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白相對表達量逐漸增加，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組顯著高于 0 μg/mL DAP 濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）。其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。相同 DAP 濃度下，實驗組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測對照組和實驗組各濃度 DAP 作用下蛋白表達
a. 電泳圖 1：對照組+0 μg/mL DAP 2：對照組+30 μg/mL DAP 3：對照組+60 μg/mL DAP 4：對照組+90 μg/mL DAP 5：實驗組+0 μg/mL DAP 6：實驗組+30 μg/mL DAP 7：實驗組+60 μg/mL DAP 8：實驗組+90 μg/mL DAP；b. Ⅱ型膠原蛋白相對表達量；c. Aggrecan 蛋白相對表達量
Figure5. Protein expressions in control group and experimental group detected by Western blot at different concentrations of DAPsa. Electrophoresis map 1: Control group+0 μg/mL DAP 2: Control group+30 μg/mL DAP 3: Control group+60 μg/mL DAP 4: Control group+90 μg/mL DAP 5: Experimental group+0 μg/mL DAP 6: Experimental group+30 μg/mL DAP 7: Experimental group+60 μg/mL DAP 8: Experimental group+90 μg/mL DAP; b. Relative protein expression of collagen type Ⅱ; c. Relative protein expression of Aggrecan
2.5 甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
甲苯胺藍染色示細胞質及細胞膜均呈藍色，隨 DAP 作用濃度增加，對照組和實驗組細胞內著色均無明顯差異；但相同 DAP 濃度下，實驗組比對照組細胞著色略深。見圖 6。
圖6
對照組和實驗組各濃度 DAP 作用下甲苯胺藍染色觀察（×200）
從左至右依次為 0、30、60、90 μg/mL DAP 濃度組 a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. Toluidine blue staining observation in control group and experimental group with different concentrations of DAPs (×200)From left to right for 0, 30, 60, and 90 μg/mL groups, respectively a. Control group; b. Experimental group
Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，隨 DAP 作用濃度增加，對照組細胞的細胞質內棕黃色著色無明顯差異；實驗組細胞的細胞質內棕黃色著色逐漸加深，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組明顯深于 0 μg/mL DAP 濃度組。相同 DAP 濃度下，實驗組比對照組細胞著色明顯加深。見圖 7。
圖7
對照組和實驗組各濃度 DAP 作用下Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 0、30、60、90 μg/mL DAP 濃度組 a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Immunohistochemical staining observation of collagen type Ⅱ in control group and experimental group treated with different concentrations of DAPs (Inverted fluorescence microscope×100)From left to right for 0, 30, 60, and 90 μg/mL groups, respectively a. Control group; b. Experimental group
3 討論
近年來，生物材料學與細胞學研究的不斷深入促進了組織工程技術的發展。軟骨組織工程技術在被提出和建立至今二十多年的時間里，得到了迅猛發展[8]。由于自體軟骨細胞供區有限、細胞培養增殖困難、體外傳代培養容易去分化等諸多問題，限制了自體細胞在軟骨修復中的應用[9]。ADSCs 來源于發育早期的中胚層和外胚層，可從全身多處部位提取，來源豐富，與其他來源干細胞相比還具有增殖快、數量眾多、免疫原性低、不易造成損傷等優點[10]。脂肪組織也具有向軟骨分化的能力[11]，在軟骨組織工程中的應用前景廣闊[12]。在軟骨組織工程構建中，生長因子發揮了重要作用，其中 IGF-1 被認為是調節軟骨形成和代謝最關鍵的細胞因子。Messai 等[13]報道在軟骨形成過程中，IGF-1 的作用主要是在轉錄水平調節 DNA、Aggrecan 和Ⅱ型膠原的分泌率；有研究證實，IGF-1 不僅能促進軟骨細胞的Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的分泌，而且會同時抑制 Aggrecan 降解[14]。研究顯示，應用基因轉染技術，顯著提高了 IGF-1 和 BMP-2 的生物學效能，促進 ADSCs 增殖和成軟骨分化[15]。
DAP 為典型的香豆素衍生物，來源廣泛，藥用價值大。研究顯示，香豆素類化合物均具有良好的抗腫瘤活性[16-17]。DAP 具有抗炎、鎮痛、抗菌、鎮靜催眠、強心及抗血栓形成等多種作用[18]；同時 DAP 的毒副作用較低，在體內代謝較快，用藥安全性較高[19]；目前臨床上主要用于治療心臟病、脈管炎以及關節退行性疾病[20]。有研究表明，香豆素類化合物蛇床子素能夠促進小鼠成骨細胞成骨，提高骨密度[21]。在成軟骨分化方面的研究顯示，DAP 能夠協同 TGF-β1 誘導大鼠 ADSCs 成軟骨分化[22]。
目前實驗室常規使用的促進干細胞分化增殖的誘導劑是各種細胞因子，而這些細胞因子的提取及分離價格昂貴，而且人體的內環境很難靠細胞因子來模擬。本研究我們采用天然藥物 DAP 聯合 IGF-1 基因轉染大鼠 ADSCs，觀察二者協同作用對種子細胞成軟骨分化的影響。結果顯示單獨使用 DAP 對細胞的Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的表達水平無明顯影響，說明 DAP 單獨使用缺乏誘導 ADSCs 成軟骨分化的作用能力。DAP 與 IGF-1 聯合作用后，實驗組Ⅱ型膠原、Aggrecan 的 mRNA 和蛋白表達水平均比對照組細胞明顯增強，而且隨著 DAP 濃度的增加而增強，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組顯著高于 0 μg/mL DAP 濃度組。這些軟骨特異性標志物的表達，說明 ADSCs 經 DAP 和 IGF-1 聯合誘導，發生了成軟骨分化，二者聯合呈明顯協同作用，但具體機制有待深入研究。
綜上述，通過基因轉染技術可使大鼠 ADSCs 穩定表達 IGF-1，聯合應用天然藥物 DAP 處理，能夠明顯提高 IGF-1 的生物學效能，促進 ADSCs 成軟骨分化，為構建經濟且有效的治療軟骨損傷和退變的組織工程軟骨提供了新思路。對于如何在生理范圍內達到最佳效果及遠期效果均需要進一步實驗證實。
由于創傷、骨關節炎、感染等原因導致的關節軟骨損傷在骨科臨床常見。關節軟骨的組織學特性決定了其自身修復能力有限，損傷后如不治療，缺損可能繼續增大，導致軟骨合成、分解代謝障礙，最終引起關節軟骨功能喪失[1]。軟骨組織工程學的發展為治療關節軟骨損傷提供了新的契機，應用組織工程軟骨修復軟骨缺損成為近年熱門研究方向。
脂肪間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是來源于脂肪組織的成體干細胞，具有多向分化潛能[2]。近年的軟骨組織工程研究顯示，ADSCs 具有很強的成軟骨能力，且能保持穩定的軟骨細胞表型[3-4]。IGF-1 是促進軟骨細胞發育的重要生長因子之一，在細胞分裂增殖及細胞外基質的分泌過程中起重要作用[5]，能夠有效誘導 ADSCs 成軟骨分化[6]。瑞香素（dephnetin，DAP）又名祖師麻甲素，化學名 7，8-二羥基香豆素，是香豆素類化合物的代表性單體成分，是金邊瑞香中的主要提取物[7]，臨床上可用于關節退行性疾病的治療。但目前關于 DAP 對 ADSCs 成軟骨分化影響的研究較少，我們設想 DAP 對 ADSCs 成軟骨分化有促進作用，以期為臨床治療軟骨損傷提供新的思路。我們以大鼠 ADSCs 作為種子細胞，聯合應用 IGF-1 基因轉染技術和 DAP 處理，觀察二者聯合對于大鼠 ADSCs 成軟骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年 SD 大鼠 5 只，雌雄不限，體質量 200～250 g，由山東省實驗動物中心提供。動物實驗經濟寧醫學院實驗動物倫理委員會批準，實驗動物使用許可證批準號：SYXK（魯）20180002。
DMEM 培養基、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、FBS、PCR 引物（Thermo Fisher 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化工，日本）；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；IGF-1、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖（Aggrecan）抗體（Abcam 公司，英國）；過表達 IGF-1 的重組慢病毒（上海吉瑪制藥技術有限公司），且慢病毒均帶有綠色熒光標記；DAP 標準品（北京索萊寶科技有限公司）；CD29、CD34、CD45及CD105 抗體（eBioscience 公司，美國）；即用型 SABC-POD（兔 IgG）試劑盒、DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。CO2 細胞培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；倒置熒光顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.2 大鼠 ADSCs 分離與培養
取 5 只 SD 大鼠，腹腔注射過量水合氯醛麻醉致死，75% 乙醇浸泡 5 min 后，無菌條件下取出腹股溝脂肪組織。用含 1% 青鏈霉素雙抗的 PBS 沖洗 3 次，仔細剝離去除脂肪組織上的血管。將脂肪組織剪碎后轉移至 10 mL 離心管中，加入 5 倍體積的 0.1%Ⅰ型膠原酶溶液，37℃ 恒溫水浴消化 90 min。消化完成后，加入等量含 10%FBS 的 DMEM 培養基終止消化，過 200 目細胞篩去除大塊組織；以離心半徑 15 cm、1 500 r/min 離心 10 min，去除上清。加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基重懸細胞并計數，按 2×105個/孔密度接種至 6 孔板，于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養。48 h 后首次換液，PBS 沖洗 2 次以去除未貼壁細胞，之后每 2 天換液 1 次。待細胞生長融合至 80%～90% 時，進行傳代培養。倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態變化；取第 3 代 ADSCs 進行流式鑒定細胞表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105 表達。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 IGF-1 基因轉染
取狀態良好的第 3 代 ADSCs，以 3×105個/孔密度鋪于 6 孔板，37℃、5%CO2 細胞培養箱培養過夜，待細胞生長至 80% 匯合度時進行轉染。從超低溫冰箱取出攜帶 IGF-1 基因的慢病毒原液，冰浴溶化后用含 10%FBS 的 DMEM 準確稀釋；吸棄原孔板中的培養基，加入 1 mL 已稀釋的病毒液，輕輕晃勻。37℃、5%CO2 細胞培養箱孵育 6 h 后，更換新鮮培養液。48 h 后倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達及細胞生長情況；并取適量轉染后細胞，采用 Western blot 檢測 IGF-1 蛋白表達，以未轉染的 ADSCs 作為對照組；其余細胞及時換液。
Western blot 檢測方法：收集細胞，用 RIPA 裂解液冰上裂解細胞 30 min 后，于 4℃ 以離心半徑 10 cm、12 000 r/min 離心 10 min，取上清；加適量上樣緩沖液，沸水中煮 5 min 制備蛋白樣品；經 12%SDS-PAGE 100 V 恒壓電泳，250 mA 恒流濕轉膜 90 min，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上；5% 脫脂牛奶封閉 1 h 后，分別加入 IGF-1（1∶200）或 β-actin（1∶2 000）抗體，4℃ 孵育過夜；TBST 洗 3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），室溫下孵育 1 h，TBST 洗 4 次后行 ECL 顯色發光。采用 Image J 軟件進行灰度值分析，以目標蛋白與 β-actin 的灰度值比值作為蛋白相對表達量。
1.3.2 實驗分組
取未轉染的 ADSCs（對照組）和 IGF-1 基因轉染 48 h 的 ADSCs（實驗組），采用 0.25% 胰蛋白酶消化，調整細胞密度為 2.5×105個/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱過夜。細胞完全貼壁后，吸棄培養基，換成含不同濃度 DAP（0、30、60、90 μg/mL）的 10%FBS DMEM 培養基繼續培養。每組每個濃度設 5 個復孔。
1.4 觀測指標
1.4.1 CCK-8 法檢測細胞增殖活性
取對照組和實驗組不同濃度 DAP 培養 72 h 后細胞，于培養結束前 1 h 每孔分別加入 CCK-8 試劑 10 μL，37℃、5%CO2 細胞培養箱培養 1 h，酶聯免疫檢測儀檢測 450 nm 處吸光度（A）值。
1.4.2 實時熒光定量 PCR 檢測基因表達
取對照組和實驗組不同濃度 DAP 培養 14 d 的細胞，抽提總 RNA，逆轉錄為 cDNA。使用 Primer Premier 5.0 軟件設計目的基因的檢測引物，委托 Thermo Fisher 公司合成。引物序列：Ⅱ型膠原上游 5′-GCTCCCAGAACATCACCTACCA-3′，下游 5′-ACAGTCTTGCCCCACTTACCG-3′；Aggrecan 上游 5′-AGGTCGTGGTGAAAGGTGTTGTG-3′，下游 5′-TGGTGGAAGCCATCCTCGTAG-3′。采用 20 μL 反應體系：SYBR Green Master mix（2×）10 μL，引物（10 μmol/L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后 ddH2O 補足體積，混勻后上機檢測。反應條件：95℃ 預變性 10 min，95℃ 變性 15 s，58℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，40 個循環。以 β-actin 為內參，采用 2?ΔΔCt法計算成軟骨相關基因Ⅱ型膠原和 Aggrecan mRNA 相對表達量。
1.4.3 Western blot 檢測蛋白表達
取對照組和實驗組不同濃度 DAP 培養 14 d 的細胞，0.25% 胰蛋白酶消化后收集細胞，參照 1.3.1 方法行 Western blot 檢測 Ⅱ型膠原（1∶200）和 Aggrecan（1∶500）蛋白表達。
1.4.4 甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
取對照組和實驗組不同濃度 DAP 培養 14 d 的細胞爬片，4% 多聚甲醛固定細胞。每組取一半玻片浸泡于甲苯胺藍染色液中 5 min 后，蒸餾水沖洗、干燥封片，光鏡下觀察。另一半玻片用 5% 牛血清白蛋白于 37℃ 封閉 1 h，加入兔抗Ⅱ型膠原抗體，濕盒 37℃ 孵育 2 h，PBS 沖洗后加生物素化山羊抗兔 IgG 二抗，濕盒 37℃ 孵育 20 min，PBS 洗 3 遍，加 SABC 試劑濕盒 37℃ 孵育 20 min，PBS 洗 3 遍，加 DAB 顯色劑顯色 10 min，蘇木素復染，蒸餾水沖洗后封片，倒置熒光顯微鏡觀察。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各濃度組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞轉染前后觀察
分離出的 ADSCs 接種于細胞培養皿，24 h 時多數細胞貼壁；換液后，48～72 h 大部分貼壁細胞伸展；7 d 左右可見細胞生長達 80% 融合度，細胞呈紡錘形或長梭形，排列有序，漩渦狀生長。流式細胞儀檢測細胞表面抗原示，CD29、CD105 陽性率分別為 97.4% 和 95.3%，CD34、CD45 陽性率分別為 1.8% 和 1.2%。IGF-1 基因轉染 48 h 后，倒置熒光顯微鏡觀察，ADSCs 熒光陽性細胞比達 90% 以上。Western blot檢測顯示，轉染后細胞 IGF-1 蛋白相對表達量為 0.513±0.007，明顯高于未轉染細胞的 0.154±0.009，差異有統計學意義（t=31.490，P=0.001）。見圖 1~3。
圖1
大鼠 ADSCs 形態學觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
a. 轉染前培養 7 d；b. IGF-1 基因轉染 48 h
Figure1. Morphological observation of rat ADSCs (Inverted fluorescence microscope×200)a. Cultured for 7 days before transfection; b. Transfection of IGF-1 gene for 48 hours
圖2
流式細胞儀檢測大鼠 ADSCs 表面抗原表達
a. CD29；b. CD34；c. CD105；d. CD45
Figure2. Detection of ADSCs surface antigen expressions by flow cytometrya. CD29; b. CD34; c. CD105; d. CD45
圖3
Western blot 檢測轉染前后 ADSCs 的 IGF-1 蛋白表達
1：轉染前 2：轉染后
Figure3. Detection of IGF-1 protein expression of ADSCs before and after transfections by Western blot1: Before transfection 2: After transfection
2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖活性
隨 DAP 作用濃度增加，對照組和實驗組細胞 A 值均逐漸增加，各濃度組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）；相同 DAP 濃度下，實驗組細胞 A 值顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
CCK-8 法檢測不同濃度 DAP 對 ADSCs 增殖的影響（n=5，）
Table1.
Effects of different concentrations of DAPs on ADSCs proliferation detected by CCK-8 assay (n=5, )
2.3 實時熒光定量 PCR 檢測基因表達
隨 DAP 作用濃度增加，對照組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan mRNA 相對表達量無明顯變化，各濃度組間差異無統計學意義（P>0.05）；實驗組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan mRNA 相對表達量逐漸增加，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組顯著高于 0 μg/mL DAP 濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）。其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。相同 DAP 濃度下，實驗組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan mRNA 相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測對照組和實驗組各濃度 DAP 作用下基因表達
a. Ⅱ型膠原；b. Aggrecan
Figure4. Gene expressions in control group and experimental group detected by real-time fluorescence quantitative PCR at different concentrations of DAPsa. Collagen type Ⅱ; b. Aggrecan
2.4 Western blot 檢測蛋白表達
隨 DAP 作用濃度增加，對照組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白相對表達量無明顯變化，各濃度組間差異無統計學意義（P>0.05）；實驗組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白相對表達量逐漸增加，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組顯著高于 0 μg/mL DAP 濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）。其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。相同 DAP 濃度下，實驗組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測對照組和實驗組各濃度 DAP 作用下蛋白表達
a. 電泳圖 1：對照組+0 μg/mL DAP 2：對照組+30 μg/mL DAP 3：對照組+60 μg/mL DAP 4：對照組+90 μg/mL DAP 5：實驗組+0 μg/mL DAP 6：實驗組+30 μg/mL DAP 7：實驗組+60 μg/mL DAP 8：實驗組+90 μg/mL DAP；b. Ⅱ型膠原蛋白相對表達量；c. Aggrecan 蛋白相對表達量
Figure5. Protein expressions in control group and experimental group detected by Western blot at different concentrations of DAPsa. Electrophoresis map 1: Control group+0 μg/mL DAP 2: Control group+30 μg/mL DAP 3: Control group+60 μg/mL DAP 4: Control group+90 μg/mL DAP 5: Experimental group+0 μg/mL DAP 6: Experimental group+30 μg/mL DAP 7: Experimental group+60 μg/mL DAP 8: Experimental group+90 μg/mL DAP; b. Relative protein expression of collagen type Ⅱ; c. Relative protein expression of Aggrecan
2.5 甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
甲苯胺藍染色示細胞質及細胞膜均呈藍色，隨 DAP 作用濃度增加，對照組和實驗組細胞內著色均無明顯差異；但相同 DAP 濃度下，實驗組比對照組細胞著色略深。見圖 6。
圖6
對照組和實驗組各濃度 DAP 作用下甲苯胺藍染色觀察（×200）
從左至右依次為 0、30、60、90 μg/mL DAP 濃度組 a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. Toluidine blue staining observation in control group and experimental group with different concentrations of DAPs (×200)From left to right for 0, 30, 60, and 90 μg/mL groups, respectively a. Control group; b. Experimental group
Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，隨 DAP 作用濃度增加，對照組細胞的細胞質內棕黃色著色無明顯差異；實驗組細胞的細胞質內棕黃色著色逐漸加深，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組明顯深于 0 μg/mL DAP 濃度組。相同 DAP 濃度下，實驗組比對照組細胞著色明顯加深。見圖 7。
圖7
對照組和實驗組各濃度 DAP 作用下Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 0、30、60、90 μg/mL DAP 濃度組 a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Immunohistochemical staining observation of collagen type Ⅱ in control group and experimental group treated with different concentrations of DAPs (Inverted fluorescence microscope×100)From left to right for 0, 30, 60, and 90 μg/mL groups, respectively a. Control group; b. Experimental group
3 討論
近年來，生物材料學與細胞學研究的不斷深入促進了組織工程技術的發展。軟骨組織工程技術在被提出和建立至今二十多年的時間里，得到了迅猛發展[8]。由于自體軟骨細胞供區有限、細胞培養增殖困難、體外傳代培養容易去分化等諸多問題，限制了自體細胞在軟骨修復中的應用[9]。ADSCs 來源于發育早期的中胚層和外胚層，可從全身多處部位提取，來源豐富，與其他來源干細胞相比還具有增殖快、數量眾多、免疫原性低、不易造成損傷等優點[10]。脂肪組織也具有向軟骨分化的能力[11]，在軟骨組織工程中的應用前景廣闊[12]。在軟骨組織工程構建中，生長因子發揮了重要作用，其中 IGF-1 被認為是調節軟骨形成和代謝最關鍵的細胞因子。Messai 等[13]報道在軟骨形成過程中，IGF-1 的作用主要是在轉錄水平調節 DNA、Aggrecan 和Ⅱ型膠原的分泌率；有研究證實，IGF-1 不僅能促進軟骨細胞的Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的分泌，而且會同時抑制 Aggrecan 降解[14]。研究顯示，應用基因轉染技術，顯著提高了 IGF-1 和 BMP-2 的生物學效能，促進 ADSCs 增殖和成軟骨分化[15]。
DAP 為典型的香豆素衍生物，來源廣泛，藥用價值大。研究顯示，香豆素類化合物均具有良好的抗腫瘤活性[16-17]。DAP 具有抗炎、鎮痛、抗菌、鎮靜催眠、強心及抗血栓形成等多種作用[18]；同時 DAP 的毒副作用較低，在體內代謝較快，用藥安全性較高[19]；目前臨床上主要用于治療心臟病、脈管炎以及關節退行性疾病[20]。有研究表明，香豆素類化合物蛇床子素能夠促進小鼠成骨細胞成骨，提高骨密度[21]。在成軟骨分化方面的研究顯示，DAP 能夠協同 TGF-β1 誘導大鼠 ADSCs 成軟骨分化[22]。
目前實驗室常規使用的促進干細胞分化增殖的誘導劑是各種細胞因子，而這些細胞因子的提取及分離價格昂貴，而且人體的內環境很難靠細胞因子來模擬。本研究我們采用天然藥物 DAP 聯合 IGF-1 基因轉染大鼠 ADSCs，觀察二者協同作用對種子細胞成軟骨分化的影響。結果顯示單獨使用 DAP 對細胞的Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的表達水平無明顯影響，說明 DAP 單獨使用缺乏誘導 ADSCs 成軟骨分化的作用能力。DAP 與 IGF-1 聯合作用后，實驗組Ⅱ型膠原、Aggrecan 的 mRNA 和蛋白表達水平均比對照組細胞明顯增強，而且隨著 DAP 濃度的增加而增強，其中 60、90 μg/mL DAP 濃度組顯著高于 0 μg/mL DAP 濃度組。這些軟骨特異性標志物的表達，說明 ADSCs 經 DAP 和 IGF-1 聯合誘導，發生了成軟骨分化，二者聯合呈明顯協同作用，但具體機制有待深入研究。
綜上述，通過基因轉染技術可使大鼠 ADSCs 穩定表達 IGF-1，聯合應用天然藥物 DAP 處理，能夠明顯提高 IGF-1 的生物學效能，促進 ADSCs 成軟骨分化，為構建經濟且有效的治療軟骨損傷和退變的組織工程軟骨提供了新思路。對于如何在生理范圍內達到最佳效果及遠期效果均需要進一步實驗證實。
