引用本文： 伋琳, 宋梓維, 曾富海, 胡明, 陳思奇, 覃中杰, 夏德林. 生長因子控制釋放對骨再生影響的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(6): 750-755. doi: 10.7507/1002-1892.201901116 復制
由外傷、腫瘤、感染和先天性畸形等引起的骨缺損，尤其是大段骨缺損的修復，是外科醫生的巨大挑戰。骨修復的金標準是自體骨移植，但存在骨供體有限、供體部位并發癥高等限制[1]。近年來隨著組織工程快速發展，將組織工程和再生醫學相結合，為重建和修復骨缺損提供了新策略。骨組織工程涉及使用不同的生化信號分子（如生長因子、藥物或小分子），形成新骨并與宿主組織整合[2]。將這些信號分子通過不同的載體，遞送到缺損部位發揮生物活性促進骨組織再生，是一種有效的再生修復手段。模擬自然骨愈合過程促進骨組織再生，不應僅限于單一的生長因子，而應該根據需要調整劑量、比例、順序來釋放多種生長因子。此外，骨是高度血管化的組織，血管化不足可能干擾骨形成過程，導致骨不愈合，所以應充分考慮到血管生成同樣有助于骨組織再生[3]。因此，有學者認為成血管因子及成骨因子雙重遞送有助于刺激血管形成及骨形成[4]。
迄今為止，骨組織工程研究中關于生長因子、種子細胞、載體支架的研究較多，已取得了一些成果，但用于臨床尚有距離。現代組織工程骨構建的主要研究熱點是控制不同生物活性的生長因子在骨愈合不同階段發揮作用，以模仿自然骨生成過程。因此，本文就組織工程中多種生長因子的緩釋系統研究進展作一綜述。
1 骨折愈合過程中的生長因子
骨折愈合過程包括 4 個連續反應步驟，即炎癥期、纖維軟骨形成期、骨痂形成期及重塑期[1]。骨愈合和重塑是通過細胞、生物活性因子和細胞外基質的協調，刺激骨祖細胞增殖、分化和遷移實現的[5]。
1.1 成骨因子
促進骨形成的細胞因子有很多，如 BMP、PDGF、TGF-β、FGF、IGF 等[6]。其中，BMP 是應用最廣泛的成骨因子。BMP 可以誘導 MSCs 增殖、分化為軟骨細胞和成骨細胞，還能誘導非骨組織來源的細胞株，如多能成纖維細胞分化為成骨細胞，從而誘導新骨形成[7]。目前應用于臨床的成骨因子主要是 BMP-2、3、4、5、7，其中研究最多的是 BMP-2 及 BMP-7，已被納入美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的骨再生系統。BMP 除了上述作用外，有可能在血管生成中發揮作用[8]。
1.2 成血管因子
缺乏新生血管是骨折不愈合的主要因素之一。血管為再生骨組織提供必要的氧氣、營養物質并清除廢物，在血管化骨組織再生中必不可少[2]。主要的成血管因子包括 VEGF、PDGF、FGF 和 TGF。
VEGF 是一種特異性作用于血管內皮細胞的肝素結合生長因子，是骨形成過程中血管生成的關鍵調節因子。目前認為，VEGF 可以通過促進內皮細胞增殖、分化及遷移，導致血管形成，并促進成骨細胞的募集和存活[9]。VEGF 可調節軟骨細胞凋亡、軟骨重塑、軟骨內生長板骨化和成骨細胞的遷移[8]。VEGF 還可通過作用于成骨細胞的 flt-1 受體，增強骨祖細胞中的成骨細胞分化和礦化[10]。
FGF 是一種有絲分裂原，不僅通過多種信號通路激活內皮細胞增殖和遷移促進血管生成[11]，還可以調節關于成骨細胞分化和凋亡的基因表達，促進骨組織再生[12-13]。FGF 在血管生成、傷口愈合和組織修復中起關鍵作用，然而由于半衰期極短，需要載體遞送控制作用時間。
PDGF 主要來源于血小板，是組織損傷后早期聚集的巨噬細胞、血管內皮細胞合成的重要多肽生長因子[14-15]。PDGF 作為一種化學誘導劑和有絲分裂原可上調 VEGF 的表達，促進血管成熟，還可以刺激成骨細胞增殖，誘導 MSCs 趨化以支持血管系統的形成[16]。
2 多種生長因子遞送系統的必要性
骨再生是一個復雜的受多種生長因子調控的過程，血管再生是關鍵環節之一。有研究認為先有新生血管網絡搭建，再有骨組織爬行增生，建立新生血管網絡可提供必要的氧氣和營養物質及發揮清除廢物的功能，為新生骨組織奠定環境基礎[17]。
為了保證骨再生過程中有新生血管形成，利用血管生成因子和成骨因子的順序遞送，可使生長因子在特定部位、特定時間最大程度發揮其生物活性。骨支架中兩種甚至多種生長因子的控制釋放更接近骨自然愈合過程[18]。Peng 等[19]認為單獨使用 VEGF 不足以促進骨再生，它與 BMP-4 協同作用可以增強細胞存活，增加 MSCs 募集和骨形成。
在骨組織工程中，生長因子的劑量一定要適宜，過量的 VEGF 可誘導血管形成，增加血管通透性，導致全身性低血壓和水腫[20]；過量的 BMP-2 則易導致血腫形成[17]。Sharma 等[21]報道相較于單獨遞送 VEGFA，較低比例（1∶3）的 VEGFA 和 BMP-2 聯合遞送，可導致體外成骨和血管生成基因的上調；而 VEGF 和 BMP-2 的比例同樣影響骨形成[22]。外來性生長因子由于半衰期短，體內擴散速度快，不能充分發揮其生物活性，還會帶來不同的副作用，因此有必要設計合適的控制釋放系統，能夠以受控和持續的方式控制生長因子的釋放速率，以實現最佳的組織再生和最小化的副作用。
3 主要生長因子控制釋放體系
近年來在骨組織工程中對生長因子控制釋放的研究方面，已經開發了許多基于生物材料的遞送系統，用于生長因子的時間和空間控制。常見的生長因子控制釋放系統包括直接結合、微球-三維支架結構、核-殼結構、層層自組裝、水凝膠及基因載體。
3.1 直接結合
高分子材料因具有良好的生物相容性及可降解性，成為骨組織工程中常見的生長因子遞送載體，包括無機材料、天然聚合物及合成聚合物。生長因子與多孔支架直接結合的方式有兩種，一種是在支架制備前，將生長因子與高分子原料混合，通過氣體發泡、纖維黏合、靜電紡絲、相分離及溶劑熔鑄等方法形成多孔支架。這種方式由于制備條件苛刻、步驟復雜，破壞了生長因子的化學結構及性能，從而影響了其生物活性[22]。另一種是生長因子通過物理吸附作用負載到已成型的支架材料中。該方法保留了支架材料的優越性能，也未破壞生長因子的生物活性；但由于支架材料已成型，無法通過改變材料性能（如孔隙率）來控制生長因子的釋放[23]。E?ri 等[24]通過冷凍干燥/顆粒浸出合成了聚乳酸（poly-L-lactide，PLA）-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-PLA 支架，BMP-2 在支架形成后被負載到基質中進行緩釋，VEGF 則通過明膠溶液載于孔隙內。研究發現 VEGF 的釋放較快，其中 60% 在 2 d 內釋放；BMP-2 則在之后幾個月中緩慢持續釋放。雖然生長因子與高分子材料直接共混是最簡單的方法，但由于可控性差，難以達到生長因子同時釋放或連續釋放的目的。因此，近年來越來越多學者將生長因子通過微球、水凝膠、層層自組裝等載體負載到支架上完成控制釋放。
3.2 微球-三維支架結構
隨著納米及微米技術在醫學領域的快速發展，以納米顆粒或微球為載體，為實現多種外源性生長因子的控制釋放種類提供了一種新的思路。緩釋微球是指生長因子通過溶劑萃取/蒸發、沉淀、雙乳液、同軸電噴霧、相分離法、化學鍵等作用，包埋于粒徑為 10～40 μm 的高分子材料形成微球體，通常納米顆粒直徑<0.1 μm[25]。生長因子通過擴散作用和聚合物載體的降解而釋放。微球球體可以保護生長因子不受外界環境影響，保持其生物活性。Kim 等[26]開發了殼聚糖凝膠/明膠微球雙重遞送系統，通過乳液法制備明膠微球，將 IGF-1 加載到明膠微球中，然后將含有 IGF-1 的明膠微球包封到含有 BMP-2 的殼聚糖凝膠中，完成了 BMP-2 早期的快速釋放及 IGF 的緩慢釋放。
生長因子、支架及細胞為組織工程構建三要素。組織支架一方面作為細胞載體，為細胞生長創造良好環境，另一方面為新組織的形成提供了支撐作用[23]。將負載生長因子的微球和三維支架結合得到微球-三維支架復合體，生長因子的釋放過程更加復雜，相較于直接從微球釋放，還要經歷從支架中擴散釋放這一步。因此生長因子的釋放速率、釋放時間及釋放位置將受載體及支架兩種材料的控制。Wang 等[18]將 BMP-2 通過化學鍵作用包埋到絲素蛋白（silk fibroin，SF）微球，VEGF 物理吸附在 BMP-2 修飾的 SF 微球上，再將這些復合微球加載到 SF/納米羥基磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHAp）支架中以實現持續釋放。體外實驗檢測到第 1 天 VEGF 的初始釋放已達到 48.7%，并且在前 10 d 內以持續釋放的方式釋放了 66.4%；而 BMP-2 第 1 天的初始釋放僅為 6.7%，然后以緩慢釋放的方式在 28 d 內釋放約 15.5%。他們將 MC3T3-E1 小鼠成骨細胞接種在支架上，觀察到 MC3T3-E1 細胞的附著和生長，證明負載低劑量 BMP-2 和 VEGF 的 SF 微球復合支架可促進細胞黏附和增殖。該系統模擬天然骨愈合過程，VEGF 可促進早期干細胞遷移及血管形成，BMP-2 在后期激活成骨細胞分化，VEGF 及 BMP-2 協同促進骨再生。
Bai 等[11]用超臨界 CO2 發泡技術生成由聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly actic-co-glycolic，PLGA）和 PLA 組成的復合支架，實現了 3 種生長因子的獨立控制釋放。為了誘導 VEGF 和 FGF-2 的快速釋放和 PDGF 的緩慢釋放，他們通過雙乳劑蒸發技術將 VEGF 和 FGF-2 包封在 PLGA 支架中，PDGF 包封在 PLA 微球中后再包封到 PLGA 支架中。釋放動力學檢測顯示，VEGF 和 FGF-2 的累積釋放量為 11.14% 和 10.91%，PDGF 為 28.49%。VEGF、FGF-2 和 PDGF 的雙重遞送可顯著影響人臍靜脈內皮細胞從 G1 期向 S 期的轉變，并刺激 DNA 復制，從而進一步促進細胞周期的進展和增殖。
微球-三維支架系統的提出不僅彌補了直接結合方式中生長因子容易失活的缺點，還為細胞和組織形成提供了良好的生理環境及支撐作用。理想的微球-三維支架系統需要根據再生組織的要求選擇微球和支架材料，將生長因子、微球和支架進行合理組合，達到損傷部位多種生長因子不同時間持續釋放的目的。該控制釋放系統由于制備簡便、對制備環境要求不高，因而廣泛用于組織再生領域。
3.3 核-殼結構
核-殼結構是指兩種不同的材料形成核心和外殼，通過物理或化學作用連接形成復合微球。有學者提出將不同的生長因子負載到不同材料中，利用兩種或多種材料不同的特點，實現對多種生長因子的控制釋放[27]。Lei 等[28]利用改進的同軸電噴霧法制備負載 FGF 及 BMP-2 的左旋聚乳酸-PLGA 核-殼微球，通過改變核-殼材料負載的生長因子，驗證了首先是來自于殼相的生長因子快速釋放，隨后是來自于核心的生長因子緩慢釋放；此外，還可以通過改變包封材料進一步調節核-殼中生長因子的特定釋放速率。具體而言，調整 PLGA 中 PLA 與聚羥基乙酸的比例，也可以影響生長因子的釋放速率。同樣利用核-殼結構，Wang 等[29]的研究表明，殼相的 VEGF 在 24 h 內快速釋放，隨后緩慢持續釋放至 28 d，而來自于核心的 BMP-2 則持續穩定釋放；體內實驗觀察到在修復大鼠顱骨臨界骨缺損中有同步血管生成和骨生成。
Chen等[30]制備了新型藻酸鹽核-殼微球，順序釋放基質細胞衍生因子 1 和 BMP-2，觀察到雙層核-殼微球是由幾個小顆粒（內層核顆粒）和 1 個殼（外層顆粒）組成。殼層可以改變內殼顆粒的表面電荷及性質，還有利于內核的穩定。相對于單獨的微球結構，核-殼微球能夠負載多種生長因子并精確控制釋放順序、時間和劑量，為局部空間隔離提供了可能性，并且可以在無支架情況下填充至不規則骨缺損中，以改善骨再生[31]。
3.4 層層自組裝
層層自組裝技術由 Iler 于 1966 年首次提出；1991 年 Decher 等利用帶相反電荷的聚電解質多層經過層層交替成積形成多層薄膜，并詳細報道了該技術。層層自組裝的制作程序簡單，已知金屬、玻璃等表面由于氧化和水解而在溶液中具有凈負電荷，當浸入帶正電荷的聚電解質，如聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚烯丙胺鹽酸鹽（polyallylamine hydrochloride，PAH）或聚乙烯亞胺中，經去離子水漂洗，由于具有相反電荷的聚電解質的吸附和過度補償，表面的凈電荷變為正值，隨后使用帶負電荷的聚電解質溶液，如聚苯乙烯磺酸鹽（polystyrene sulfonate，PSS）、聚硫酸乙烯酯或聚丙烯酸［poly（acrylic acid），PAA］進行類似過程，導致凈電荷反轉，從而在基底上形成雙聚電解質層（雙層）。薄膜類似于“儲存器”，將生長因子儲存其中，通過靜電吸附保持其生物活性[32-33]。
PAH 及 PSS 多層膜是應用最廣泛的聚電解質體系之一。已有實驗證明 PAH/PSS 多層膜分別遞送 BMP-2 及 VEGF，在體外仍能保持其生物活性并刺激細胞增殖[34-35]。Shah 等[32]開發了一種由 PAA 及聚（b-氨基酯）-2 組成的可降解聚電解質多層，并負載不同比例的重組人 BMP-2 和重組人 VEGF165，隨著涂層的降解，未觀察到兩種生長因子的突釋，重組人 BMP-2 穩定持續釋放約 2 周，而重組人 VEGF165 在前 8 d 快速釋放。兩種生長因子的遞送顯著改變了微環境，形成的小梁骨與對照組相比更加連續和更快成熟。
由層層自組裝制備的薄膜形貌可控，還可與其他載體復合，在組裝過程中改變聚電解質多層固有性質，控制生長因子的釋放行為[36]。Gronowicz 等[37]為更好地模擬天然骨再生過程，制備了由仿生磷酸鈣層及聚-L-賴氨酸/聚-L-谷氨酸聚電解質多層膜覆蓋的膠原/羥基磷灰石支架，其中 BMP-2 負載到支架中，而 FGF-2 則負載到聚電解質多層膜中。實驗證明 FGF-2 首先從聚電解質多層膜中釋放，在早期誘導骨祖細胞增殖，仿生磷酸鈣層及聚電解質多層膜的添加則延緩了 BMP-2 的釋放，與單獨遞送 BMP-2 的支架相比，FGF-2 及 BMP-2 的順序遞送可增加缺損區新生骨體積。
層層自組裝技術可以精確控制涂層性能并獲得均勻的多層結構，由于其操作簡單，制備條件溫和，適用于任何形狀的基材，廣泛應用于化學、生物及醫學領域中[36]。由于聚電解質單層厚度<1 nm，所以層層自組裝技術可以納米級控制薄膜厚度[38]。因此，利用層層自組裝技術制造的多層膜用于局部生長因子的控制釋放越來越被關注。
3.5 水凝膠
水凝膠是一種吸收水分而溶漲形成三維網狀結構的高分子聚合物，該三維網狀結構不溶于水，類似于天然細胞外基質，可作為載體材料被廣泛應用于藥物和各類細胞生長因子釋放。存在于凝膠網狀結構中的生長因子，隨著交聯鍵的斷裂和支架水解緩慢釋放出來。常用的天然高分子水凝膠包括膠原、明膠、殼聚糖、透明質酸和海藻酸鹽等，以及合成高分子水凝膠聚氧乙烯等[39]。
水凝膠常作為蛋白質釋放基質，保證蛋白質在遞送生長因子過程中不被巨噬細胞所吞噬[40]。Han 等[41]制備了具有 TGF-β1 和 BMP-2 的 PLGA 微球，并負載到殼聚糖-明膠水凝膠/PLGA 支架上，觀察到 TGF-β1 在 7 d 內的釋放速率顯著快于 BMP-2，但 7～42 d 時 BMP-2 的釋放速率顯著快于 TGF-β1。這可能是因為殼聚糖-明膠涂層延緩了 PLGA 微球的降解，所以延緩 BMP-2 的釋放。Zhang 等[42]通過超聲誘導制備的 SF 水凝膠遞送 VEGF165 和 BMP-2，以提升兔上頜竇底部成骨能力，體外實驗證實兩種生長因子是持續釋放而不是突釋，并且水凝膠的摻入不會影響生長因子的生物活性。Barati 等[43]制備 PEG-丙交酯/乙交酯（lactide/glycolide，L/G）納米凝膠，PEG 的親水性維持納米凝膠在水溶液中穩定，L 片段可控制自組裝及納米凝膠的形成，G 片段可控制納米凝膠的降解及生長因子的釋放。通過改變 PEG 的相對分子質量及 L/G 的長度，調節 BMP-2 和 VEGF 的釋放動力學。實驗觀察到 VEGF 和 BMP-2 蛋白分別以恒定速率緩慢釋放 10 d 和 21 d，顯著增加納米凝膠成骨及成血管能力。
通過物理吸附及包埋，將生長因子固定在水凝膠交聯網絡中，生長因子的釋放速率通過水凝膠的降解速度控制，加大了對生長因子釋放的精確控制。然而，由于負載量低，且在交聯過程中生長因子容易被破壞而失去活性，因此近年來水凝膠多作為基質負載微球或納米顆粒，延緩了微球或納米顆粒的降解速率，從而控制生長因子的釋放速率。
3.6 基因載體
在骨組織工程中，為了克服單純蛋白質治療的缺陷，基因治療逐漸展現出獨特的優勢和潛力。其中腺病毒及質粒（非病毒載體）已被用于編碼生長因子基因，并證實可促進骨再生[44]。腺病毒是一種無包膜的雙鏈 DNA 病毒，由于其能同時表達多個基因、不與靶細胞發生基因整合，并且能將目的基因轉移到靜息或分裂的細胞中，因此成為目前常用的基因載體之一。Liao 等[8]應用 BMP-6 與 VEGF 雙基因的腺病毒載體轉染 BMSCs 治療股骨頭缺血性壞死，將轉染的 BMSCs 與仿生合成支架聚丙交酯-聚乙醇胺結合，并皮下植入裸鼠體內。4 周后，該復合支架的 VEGF 和 BMP-6 表達水平明顯升高，毛細血管和骨形成率明顯高于單獨遞送 VEGF/BMP-6 的支架組。同樣是利用腺病毒為基因載體，Zhang 等[44]研究發現，轉染后 14 d 和 21 d，BMP-2 與 VEGF165 的成骨作用略低于單獨使用 BMP-2 基因轉染組，VEGF165 可能是 BMSCs 向成骨細胞分化的有效抑制劑。這可能與生長因子的濃度有關，兩種生長因子同時作用于 BMSCs，較高濃度的生長因子可能會影響到細胞的增殖，因此有必要探索兩種生長因子合適的比例。
雖然基因載體有望成為順序生長因子傳遞的潛在系統，但相較于傳統的支架、微球、水凝膠等系統，它仍然存在許多安全問題，例如轉染早期的低表達、缺乏靶向性及表達持續時間較短等[45]，嚴重限制其臨床應用。
4 問題與展望
骨愈合是涉及細胞遷移、增殖，細胞外基質產生，骨生成和血管生成的復雜過程，需要多種因素的組合來促進骨愈合。生長因子是骨組織再生修復的關鍵組成部分，生長因子呈現的功效取決于每種生長因子的釋放時間、遞送順序和在各個階段遞送的量。因此開發多種生物分子遞送系統必不可少，其中生長因子的選擇、濃度、載體和釋放順序是多因子控制釋放系統的重點。迄今為止，已開發了許多基于聚合物載體的控制釋放系統，用于生長因子的控制遞送，以促進骨再生。理想的多種生長因子控制釋放系統應根據缺損組織的特點，將生長因子與載體材料以適當方式組合，持續或受控遞送至缺損部位促進骨再生。然而多種生長因子的控制釋放系統仍面臨許多困難和挑戰，例如生長因子釋放的最佳濃度，載體材料機械性能的改善，控制釋放系統的標準、安全性、有效性和成本效益等。為了使這種共同遞送策略實現最佳臨床結果，應優化控制釋放系統的固有性質，以維持生長因子的持續和受控制釋放，以及維持生長因子的生物活性。因此，符合臨床應用的多種因子控制釋放系統的研發，在骨組織再生工程中具有重要的臨床意義和廣闊的應用前景。
由外傷、腫瘤、感染和先天性畸形等引起的骨缺損，尤其是大段骨缺損的修復，是外科醫生的巨大挑戰。骨修復的金標準是自體骨移植，但存在骨供體有限、供體部位并發癥高等限制[1]。近年來隨著組織工程快速發展，將組織工程和再生醫學相結合，為重建和修復骨缺損提供了新策略。骨組織工程涉及使用不同的生化信號分子（如生長因子、藥物或小分子），形成新骨并與宿主組織整合[2]。將這些信號分子通過不同的載體，遞送到缺損部位發揮生物活性促進骨組織再生，是一種有效的再生修復手段。模擬自然骨愈合過程促進骨組織再生，不應僅限于單一的生長因子，而應該根據需要調整劑量、比例、順序來釋放多種生長因子。此外，骨是高度血管化的組織，血管化不足可能干擾骨形成過程，導致骨不愈合，所以應充分考慮到血管生成同樣有助于骨組織再生[3]。因此，有學者認為成血管因子及成骨因子雙重遞送有助于刺激血管形成及骨形成[4]。
迄今為止，骨組織工程研究中關于生長因子、種子細胞、載體支架的研究較多，已取得了一些成果，但用于臨床尚有距離。現代組織工程骨構建的主要研究熱點是控制不同生物活性的生長因子在骨愈合不同階段發揮作用，以模仿自然骨生成過程。因此，本文就組織工程中多種生長因子的緩釋系統研究進展作一綜述。
1 骨折愈合過程中的生長因子
骨折愈合過程包括 4 個連續反應步驟，即炎癥期、纖維軟骨形成期、骨痂形成期及重塑期[1]。骨愈合和重塑是通過細胞、生物活性因子和細胞外基質的協調，刺激骨祖細胞增殖、分化和遷移實現的[5]。
1.1 成骨因子
促進骨形成的細胞因子有很多，如 BMP、PDGF、TGF-β、FGF、IGF 等[6]。其中，BMP 是應用最廣泛的成骨因子。BMP 可以誘導 MSCs 增殖、分化為軟骨細胞和成骨細胞，還能誘導非骨組織來源的細胞株，如多能成纖維細胞分化為成骨細胞，從而誘導新骨形成[7]。目前應用于臨床的成骨因子主要是 BMP-2、3、4、5、7，其中研究最多的是 BMP-2 及 BMP-7，已被納入美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的骨再生系統。BMP 除了上述作用外，有可能在血管生成中發揮作用[8]。
1.2 成血管因子
缺乏新生血管是骨折不愈合的主要因素之一。血管為再生骨組織提供必要的氧氣、營養物質并清除廢物，在血管化骨組織再生中必不可少[2]。主要的成血管因子包括 VEGF、PDGF、FGF 和 TGF。
VEGF 是一種特異性作用于血管內皮細胞的肝素結合生長因子，是骨形成過程中血管生成的關鍵調節因子。目前認為，VEGF 可以通過促進內皮細胞增殖、分化及遷移，導致血管形成，并促進成骨細胞的募集和存活[9]。VEGF 可調節軟骨細胞凋亡、軟骨重塑、軟骨內生長板骨化和成骨細胞的遷移[8]。VEGF 還可通過作用于成骨細胞的 flt-1 受體，增強骨祖細胞中的成骨細胞分化和礦化[10]。
FGF 是一種有絲分裂原，不僅通過多種信號通路激活內皮細胞增殖和遷移促進血管生成[11]，還可以調節關于成骨細胞分化和凋亡的基因表達，促進骨組織再生[12-13]。FGF 在血管生成、傷口愈合和組織修復中起關鍵作用，然而由于半衰期極短，需要載體遞送控制作用時間。
PDGF 主要來源于血小板，是組織損傷后早期聚集的巨噬細胞、血管內皮細胞合成的重要多肽生長因子[14-15]。PDGF 作為一種化學誘導劑和有絲分裂原可上調 VEGF 的表達，促進血管成熟，還可以刺激成骨細胞增殖，誘導 MSCs 趨化以支持血管系統的形成[16]。
2 多種生長因子遞送系統的必要性
骨再生是一個復雜的受多種生長因子調控的過程，血管再生是關鍵環節之一。有研究認為先有新生血管網絡搭建，再有骨組織爬行增生，建立新生血管網絡可提供必要的氧氣和營養物質及發揮清除廢物的功能，為新生骨組織奠定環境基礎[17]。
為了保證骨再生過程中有新生血管形成，利用血管生成因子和成骨因子的順序遞送，可使生長因子在特定部位、特定時間最大程度發揮其生物活性。骨支架中兩種甚至多種生長因子的控制釋放更接近骨自然愈合過程[18]。Peng 等[19]認為單獨使用 VEGF 不足以促進骨再生，它與 BMP-4 協同作用可以增強細胞存活，增加 MSCs 募集和骨形成。
在骨組織工程中，生長因子的劑量一定要適宜，過量的 VEGF 可誘導血管形成，增加血管通透性，導致全身性低血壓和水腫[20]；過量的 BMP-2 則易導致血腫形成[17]。Sharma 等[21]報道相較于單獨遞送 VEGFA，較低比例（1∶3）的 VEGFA 和 BMP-2 聯合遞送，可導致體外成骨和血管生成基因的上調；而 VEGF 和 BMP-2 的比例同樣影響骨形成[22]。外來性生長因子由于半衰期短，體內擴散速度快，不能充分發揮其生物活性，還會帶來不同的副作用，因此有必要設計合適的控制釋放系統，能夠以受控和持續的方式控制生長因子的釋放速率，以實現最佳的組織再生和最小化的副作用。
3 主要生長因子控制釋放體系
近年來在骨組織工程中對生長因子控制釋放的研究方面，已經開發了許多基于生物材料的遞送系統，用于生長因子的時間和空間控制。常見的生長因子控制釋放系統包括直接結合、微球-三維支架結構、核-殼結構、層層自組裝、水凝膠及基因載體。
3.1 直接結合
高分子材料因具有良好的生物相容性及可降解性，成為骨組織工程中常見的生長因子遞送載體，包括無機材料、天然聚合物及合成聚合物。生長因子與多孔支架直接結合的方式有兩種，一種是在支架制備前，將生長因子與高分子原料混合，通過氣體發泡、纖維黏合、靜電紡絲、相分離及溶劑熔鑄等方法形成多孔支架。這種方式由于制備條件苛刻、步驟復雜，破壞了生長因子的化學結構及性能，從而影響了其生物活性[22]。另一種是生長因子通過物理吸附作用負載到已成型的支架材料中。該方法保留了支架材料的優越性能，也未破壞生長因子的生物活性；但由于支架材料已成型，無法通過改變材料性能（如孔隙率）來控制生長因子的釋放[23]。E?ri 等[24]通過冷凍干燥/顆粒浸出合成了聚乳酸（poly-L-lactide，PLA）-聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-PLA 支架，BMP-2 在支架形成后被負載到基質中進行緩釋，VEGF 則通過明膠溶液載于孔隙內。研究發現 VEGF 的釋放較快，其中 60% 在 2 d 內釋放；BMP-2 則在之后幾個月中緩慢持續釋放。雖然生長因子與高分子材料直接共混是最簡單的方法，但由于可控性差，難以達到生長因子同時釋放或連續釋放的目的。因此，近年來越來越多學者將生長因子通過微球、水凝膠、層層自組裝等載體負載到支架上完成控制釋放。
3.2 微球-三維支架結構
隨著納米及微米技術在醫學領域的快速發展，以納米顆粒或微球為載體，為實現多種外源性生長因子的控制釋放種類提供了一種新的思路。緩釋微球是指生長因子通過溶劑萃取/蒸發、沉淀、雙乳液、同軸電噴霧、相分離法、化學鍵等作用，包埋于粒徑為 10～40 μm 的高分子材料形成微球體，通常納米顆粒直徑<0.1 μm[25]。生長因子通過擴散作用和聚合物載體的降解而釋放。微球球體可以保護生長因子不受外界環境影響，保持其生物活性。Kim 等[26]開發了殼聚糖凝膠/明膠微球雙重遞送系統，通過乳液法制備明膠微球，將 IGF-1 加載到明膠微球中，然后將含有 IGF-1 的明膠微球包封到含有 BMP-2 的殼聚糖凝膠中，完成了 BMP-2 早期的快速釋放及 IGF 的緩慢釋放。
生長因子、支架及細胞為組織工程構建三要素。組織支架一方面作為細胞載體，為細胞生長創造良好環境，另一方面為新組織的形成提供了支撐作用[23]。將負載生長因子的微球和三維支架結合得到微球-三維支架復合體，生長因子的釋放過程更加復雜，相較于直接從微球釋放，還要經歷從支架中擴散釋放這一步。因此生長因子的釋放速率、釋放時間及釋放位置將受載體及支架兩種材料的控制。Wang 等[18]將 BMP-2 通過化學鍵作用包埋到絲素蛋白（silk fibroin，SF）微球，VEGF 物理吸附在 BMP-2 修飾的 SF 微球上，再將這些復合微球加載到 SF/納米羥基磷灰石（nano-hydroxyapatite，nHAp）支架中以實現持續釋放。體外實驗檢測到第 1 天 VEGF 的初始釋放已達到 48.7%，并且在前 10 d 內以持續釋放的方式釋放了 66.4%；而 BMP-2 第 1 天的初始釋放僅為 6.7%，然后以緩慢釋放的方式在 28 d 內釋放約 15.5%。他們將 MC3T3-E1 小鼠成骨細胞接種在支架上，觀察到 MC3T3-E1 細胞的附著和生長，證明負載低劑量 BMP-2 和 VEGF 的 SF 微球復合支架可促進細胞黏附和增殖。該系統模擬天然骨愈合過程，VEGF 可促進早期干細胞遷移及血管形成，BMP-2 在后期激活成骨細胞分化，VEGF 及 BMP-2 協同促進骨再生。
Bai 等[11]用超臨界 CO2 發泡技術生成由聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly actic-co-glycolic，PLGA）和 PLA 組成的復合支架，實現了 3 種生長因子的獨立控制釋放。為了誘導 VEGF 和 FGF-2 的快速釋放和 PDGF 的緩慢釋放，他們通過雙乳劑蒸發技術將 VEGF 和 FGF-2 包封在 PLGA 支架中，PDGF 包封在 PLA 微球中后再包封到 PLGA 支架中。釋放動力學檢測顯示，VEGF 和 FGF-2 的累積釋放量為 11.14% 和 10.91%，PDGF 為 28.49%。VEGF、FGF-2 和 PDGF 的雙重遞送可顯著影響人臍靜脈內皮細胞從 G1 期向 S 期的轉變，并刺激 DNA 復制，從而進一步促進細胞周期的進展和增殖。
微球-三維支架系統的提出不僅彌補了直接結合方式中生長因子容易失活的缺點，還為細胞和組織形成提供了良好的生理環境及支撐作用。理想的微球-三維支架系統需要根據再生組織的要求選擇微球和支架材料，將生長因子、微球和支架進行合理組合，達到損傷部位多種生長因子不同時間持續釋放的目的。該控制釋放系統由于制備簡便、對制備環境要求不高，因而廣泛用于組織再生領域。
3.3 核-殼結構
核-殼結構是指兩種不同的材料形成核心和外殼，通過物理或化學作用連接形成復合微球。有學者提出將不同的生長因子負載到不同材料中，利用兩種或多種材料不同的特點，實現對多種生長因子的控制釋放[27]。Lei 等[28]利用改進的同軸電噴霧法制備負載 FGF 及 BMP-2 的左旋聚乳酸-PLGA 核-殼微球，通過改變核-殼材料負載的生長因子，驗證了首先是來自于殼相的生長因子快速釋放，隨后是來自于核心的生長因子緩慢釋放；此外，還可以通過改變包封材料進一步調節核-殼中生長因子的特定釋放速率。具體而言，調整 PLGA 中 PLA 與聚羥基乙酸的比例，也可以影響生長因子的釋放速率。同樣利用核-殼結構，Wang 等[29]的研究表明，殼相的 VEGF 在 24 h 內快速釋放，隨后緩慢持續釋放至 28 d，而來自于核心的 BMP-2 則持續穩定釋放；體內實驗觀察到在修復大鼠顱骨臨界骨缺損中有同步血管生成和骨生成。
Chen等[30]制備了新型藻酸鹽核-殼微球，順序釋放基質細胞衍生因子 1 和 BMP-2，觀察到雙層核-殼微球是由幾個小顆粒（內層核顆粒）和 1 個殼（外層顆粒）組成。殼層可以改變內殼顆粒的表面電荷及性質，還有利于內核的穩定。相對于單獨的微球結構，核-殼微球能夠負載多種生長因子并精確控制釋放順序、時間和劑量，為局部空間隔離提供了可能性，并且可以在無支架情況下填充至不規則骨缺損中，以改善骨再生[31]。
3.4 層層自組裝
層層自組裝技術由 Iler 于 1966 年首次提出；1991 年 Decher 等利用帶相反電荷的聚電解質多層經過層層交替成積形成多層薄膜，并詳細報道了該技術。層層自組裝的制作程序簡單，已知金屬、玻璃等表面由于氧化和水解而在溶液中具有凈負電荷，當浸入帶正電荷的聚電解質，如聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚烯丙胺鹽酸鹽（polyallylamine hydrochloride，PAH）或聚乙烯亞胺中，經去離子水漂洗，由于具有相反電荷的聚電解質的吸附和過度補償，表面的凈電荷變為正值，隨后使用帶負電荷的聚電解質溶液，如聚苯乙烯磺酸鹽（polystyrene sulfonate，PSS）、聚硫酸乙烯酯或聚丙烯酸［poly（acrylic acid），PAA］進行類似過程，導致凈電荷反轉，從而在基底上形成雙聚電解質層（雙層）。薄膜類似于“儲存器”，將生長因子儲存其中，通過靜電吸附保持其生物活性[32-33]。
PAH 及 PSS 多層膜是應用最廣泛的聚電解質體系之一。已有實驗證明 PAH/PSS 多層膜分別遞送 BMP-2 及 VEGF，在體外仍能保持其生物活性并刺激細胞增殖[34-35]。Shah 等[32]開發了一種由 PAA 及聚（b-氨基酯）-2 組成的可降解聚電解質多層，并負載不同比例的重組人 BMP-2 和重組人 VEGF165，隨著涂層的降解，未觀察到兩種生長因子的突釋，重組人 BMP-2 穩定持續釋放約 2 周，而重組人 VEGF165 在前 8 d 快速釋放。兩種生長因子的遞送顯著改變了微環境，形成的小梁骨與對照組相比更加連續和更快成熟。
由層層自組裝制備的薄膜形貌可控，還可與其他載體復合，在組裝過程中改變聚電解質多層固有性質，控制生長因子的釋放行為[36]。Gronowicz 等[37]為更好地模擬天然骨再生過程，制備了由仿生磷酸鈣層及聚-L-賴氨酸/聚-L-谷氨酸聚電解質多層膜覆蓋的膠原/羥基磷灰石支架，其中 BMP-2 負載到支架中，而 FGF-2 則負載到聚電解質多層膜中。實驗證明 FGF-2 首先從聚電解質多層膜中釋放，在早期誘導骨祖細胞增殖，仿生磷酸鈣層及聚電解質多層膜的添加則延緩了 BMP-2 的釋放，與單獨遞送 BMP-2 的支架相比，FGF-2 及 BMP-2 的順序遞送可增加缺損區新生骨體積。
層層自組裝技術可以精確控制涂層性能并獲得均勻的多層結構，由于其操作簡單，制備條件溫和，適用于任何形狀的基材，廣泛應用于化學、生物及醫學領域中[36]。由于聚電解質單層厚度<1 nm，所以層層自組裝技術可以納米級控制薄膜厚度[38]。因此，利用層層自組裝技術制造的多層膜用于局部生長因子的控制釋放越來越被關注。
3.5 水凝膠
水凝膠是一種吸收水分而溶漲形成三維網狀結構的高分子聚合物，該三維網狀結構不溶于水，類似于天然細胞外基質，可作為載體材料被廣泛應用于藥物和各類細胞生長因子釋放。存在于凝膠網狀結構中的生長因子，隨著交聯鍵的斷裂和支架水解緩慢釋放出來。常用的天然高分子水凝膠包括膠原、明膠、殼聚糖、透明質酸和海藻酸鹽等，以及合成高分子水凝膠聚氧乙烯等[39]。
水凝膠常作為蛋白質釋放基質，保證蛋白質在遞送生長因子過程中不被巨噬細胞所吞噬[40]。Han 等[41]制備了具有 TGF-β1 和 BMP-2 的 PLGA 微球，并負載到殼聚糖-明膠水凝膠/PLGA 支架上，觀察到 TGF-β1 在 7 d 內的釋放速率顯著快于 BMP-2，但 7～42 d 時 BMP-2 的釋放速率顯著快于 TGF-β1。這可能是因為殼聚糖-明膠涂層延緩了 PLGA 微球的降解，所以延緩 BMP-2 的釋放。Zhang 等[42]通過超聲誘導制備的 SF 水凝膠遞送 VEGF165 和 BMP-2，以提升兔上頜竇底部成骨能力，體外實驗證實兩種生長因子是持續釋放而不是突釋，并且水凝膠的摻入不會影響生長因子的生物活性。Barati 等[43]制備 PEG-丙交酯/乙交酯（lactide/glycolide，L/G）納米凝膠，PEG 的親水性維持納米凝膠在水溶液中穩定，L 片段可控制自組裝及納米凝膠的形成，G 片段可控制納米凝膠的降解及生長因子的釋放。通過改變 PEG 的相對分子質量及 L/G 的長度，調節 BMP-2 和 VEGF 的釋放動力學。實驗觀察到 VEGF 和 BMP-2 蛋白分別以恒定速率緩慢釋放 10 d 和 21 d，顯著增加納米凝膠成骨及成血管能力。
通過物理吸附及包埋，將生長因子固定在水凝膠交聯網絡中，生長因子的釋放速率通過水凝膠的降解速度控制，加大了對生長因子釋放的精確控制。然而，由于負載量低，且在交聯過程中生長因子容易被破壞而失去活性，因此近年來水凝膠多作為基質負載微球或納米顆粒，延緩了微球或納米顆粒的降解速率，從而控制生長因子的釋放速率。
3.6 基因載體
在骨組織工程中，為了克服單純蛋白質治療的缺陷，基因治療逐漸展現出獨特的優勢和潛力。其中腺病毒及質粒（非病毒載體）已被用于編碼生長因子基因，并證實可促進骨再生[44]。腺病毒是一種無包膜的雙鏈 DNA 病毒，由于其能同時表達多個基因、不與靶細胞發生基因整合，并且能將目的基因轉移到靜息或分裂的細胞中，因此成為目前常用的基因載體之一。Liao 等[8]應用 BMP-6 與 VEGF 雙基因的腺病毒載體轉染 BMSCs 治療股骨頭缺血性壞死，將轉染的 BMSCs 與仿生合成支架聚丙交酯-聚乙醇胺結合，并皮下植入裸鼠體內。4 周后，該復合支架的 VEGF 和 BMP-6 表達水平明顯升高，毛細血管和骨形成率明顯高于單獨遞送 VEGF/BMP-6 的支架組。同樣是利用腺病毒為基因載體，Zhang 等[44]研究發現，轉染后 14 d 和 21 d，BMP-2 與 VEGF165 的成骨作用略低于單獨使用 BMP-2 基因轉染組，VEGF165 可能是 BMSCs 向成骨細胞分化的有效抑制劑。這可能與生長因子的濃度有關，兩種生長因子同時作用于 BMSCs，較高濃度的生長因子可能會影響到細胞的增殖，因此有必要探索兩種生長因子合適的比例。
雖然基因載體有望成為順序生長因子傳遞的潛在系統，但相較于傳統的支架、微球、水凝膠等系統，它仍然存在許多安全問題，例如轉染早期的低表達、缺乏靶向性及表達持續時間較短等[45]，嚴重限制其臨床應用。
4 問題與展望
骨愈合是涉及細胞遷移、增殖，細胞外基質產生，骨生成和血管生成的復雜過程，需要多種因素的組合來促進骨愈合。生長因子是骨組織再生修復的關鍵組成部分，生長因子呈現的功效取決于每種生長因子的釋放時間、遞送順序和在各個階段遞送的量。因此開發多種生物分子遞送系統必不可少，其中生長因子的選擇、濃度、載體和釋放順序是多因子控制釋放系統的重點。迄今為止，已開發了許多基于聚合物載體的控制釋放系統，用于生長因子的控制遞送，以促進骨再生。理想的多種生長因子控制釋放系統應根據缺損組織的特點，將生長因子與載體材料以適當方式組合，持續或受控遞送至缺損部位促進骨再生。然而多種生長因子的控制釋放系統仍面臨許多困難和挑戰，例如生長因子釋放的最佳濃度，載體材料機械性能的改善，控制釋放系統的標準、安全性、有效性和成本效益等。為了使這種共同遞送策略實現最佳臨床結果，應優化控制釋放系統的固有性質，以維持生長因子的持續和受控制釋放，以及維持生長因子的生物活性。因此，符合臨床應用的多種因子控制釋放系統的研發，在骨組織再生工程中具有重要的臨床意義和廣闊的應用前景。