引用本文： 盧昌懷, 劉志軍, 張宏波, 段揚, 曹延林. p38 絲裂原活化蛋白激酶通路介導 TGF-β1/結締組織生長因子調控人腰椎黃韌帶增生肥厚的機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(6): 730-735. doi: 10.7507/1002-1892.201811140 復制
人腰椎黃韌帶肥厚導致的腰椎管狹窄癥是臨床常見疾病之一[1]，黃韌帶增生肥厚是細胞微結構損傷后產生的瘢痕炎性反應[2]。TGF-β1 是損傷修復過程中作用最為顯著的因子之一，可以激活黃韌帶細胞中膠原蛋白的表達[3]，在黃韌帶組織纖維化中，可能在損傷、炎癥及纖維化之間起到一定的連接作用。而在腰椎肥厚的黃韌帶中，結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達增加，同時參與了黃韌帶增生肥厚的過程[4]。有研究表明 TGF-β1、CTGF 可促進細胞外基質成分表達增加，TGF-β1 通過 CTGF 協同促進黃韌帶細胞增生[5-6]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路是與創傷愈合相關的胞內信號傳導通路，許多應急原可以刺激 MAPK 通路使其活化，如機械創傷、活性氧、病原微生物刺激等[7]。近年也有研究發現 MAPK 通路參與了 CTGF 的表達調控[8-9]。目前，在哺乳動物細胞中已鑒定出 4 條 MAPK 信號傳導通路：細胞外調節蛋白激酶 1（extracellular regulated protein kinase 1，ERK1 ）通路、ERK2 通路、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路、p38 通路，其中 p38 和 ERK 是促纖維活性信號，JNK 是抑制纖維活性信號。因此，本研究通過篩選參與 TGF-β1/CTGF 調控黃韌帶肥厚的 MAPK 通路，利用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾 p38 MAPK 通路調控黃韌帶細胞中 TGF-β1/CTGF 表達，初步探討 MAPK 通路在 TGF-β1 調控 CTGF 表達過程中的作用，為臨床治療黃韌帶肥厚導致的腰椎管狹窄癥奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 人腰椎黃韌帶細胞的分離與培養
黃韌帶組織由南方醫科大學珠江醫院 13 例行腰椎間盤突出髓核摘除術患者自愿捐贈，術前均經影像學檢查確定無明顯黃韌帶增生。采用膠原酶預消化組織塊培養法[10-11]分離培養得到黃韌帶細胞。經鑒定，所培養的黃韌帶細胞具有典型的成纖維細胞樣表型，傳代細胞增殖良好，不同傳代細胞在同一時間點無明顯差別。本研究取第 3 代對數生長期細胞進行實驗。
1.2 主要試劑及儀器
TGF-β1 蛋白、CTGF 蛋白（Invitrogen 公司，美國）；JNK 通路阻斷劑 SP600125、ERK 通路阻斷劑 PD98059、p38 通路阻斷劑 SB203580（EMD Biochemicals 公司，美國）；兔抗磷酸化 p38（phosphorylation p38，p-p38）單克隆抗體、兔抗 p38 單克隆抗體（Abcam 公司，美國）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒、逆轉錄試劑盒（DBI 公司，德國）；人 p38 MAPK 特異性 siRNA 序列 355、513、714、空白對照（negative control，NC）（上海吉碼制藥技術有限公司）；山羊抗兔 IgG 二抗溶液（BOSTER 公司，美國）；DNase Ⅰ、RNasin（Promega 公司，美國）；RNA 提取試劑 Trizol（Takara 公司，日本）。 Stratagene Mx3000P qRT-PCR 儀（Agilent 公司，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；UV-1206 分光光度儀（Shimodzu 公司，日本）；SCR20B 冷凍離心機（Hitachi 公司，日本）；TGL-16G 高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；水平式電泳儀（北京東方儀器廠）。
1.3 篩選參與 TGF-β1/CTGF 調控黃韌帶肥厚的 MAPK 通路
黃韌帶細胞以 0.2% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化形成細胞懸液，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 3 min，收集細胞，以 1×104個/mL 密度接種于 96 孔板。常規培養 24 h 后更換無血清 DMEM 進一步處理 24 h，將細胞分為 5 組：DMEM 組為無血清 DMEM 組；TGF-β1 組單純加入 3 ng/mL TGF-β1 刺激；PD98059 組、SP600125 組和 SB203580 組分別加入 10 μmol/L 相應通路阻斷劑，1 h 后加入 3 ng/mL TGF-β1 處理 24 h。24 h 后分別收集各組細胞，常規消化細胞后，PBS 洗滌 2 次，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 3 min 后加入 1.5 mL EP 管中，按步驟提取 RNA，使用 RNase-free 的 DNase Ⅰ配置反應液。以 2 μg 總 RNA 為模板，按照逆轉錄試劑盒說明書配制逆轉錄反應體系，總體系 20 μL，合成 cDNA 第 1 鏈，并收集備用。配制 qPCR 擴增的反應體系，進行 PCR 檢測。PCR 反應條件：94℃、2 min，94℃、20 s，58℃、20 s，72℃、20 s，40 個循環；融解曲線分析：溫度 62～95℃。用 2?ΔΔCt法計算各組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量。實驗重復 3 次。
1.4 siRNA 干擾 p38 MAPK 通路調控黃韌帶細胞中 TGF-β1/CTGF 表達觀測
1.4.1 篩選進行細胞轉染的最終 siRNA 序列
黃韌帶細胞按 1×104個/mL 密度接種于 96 孔板，24 h 后換無血清 DMEM 培養基繼續培養過夜，進行 4 種 p38 MAPK 特異性 siRNA 序列（355、513、714、NC）轉染，分別為 355 序列組、513 序列組、714 序列組、對照組。轉染方法：細胞轉染前 1 d，將黃韌帶細胞以 2.5×105個/孔密度接種至含 2 mL 完全培養基（含 10%～20%FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的基礎培養基）的 6 孔板中，室溫培養，使轉染時細胞密度達 50%～70%。在 250 μL DMEM 無血清、無抗生素培養基中加入 8 μL siRNA，柔和混勻；在 250 μL DMEM 無血清、無抗生素培養基中加入 10 μL Lipofectamine，柔和混勻，室溫放置 5 min；將稀釋的 siRNA 和 Lipofectamine 試劑混合，柔和混勻，室溫放置 20 min，形成 siRNA/Lipofectamine 復合物；將 100 μL siRNA/Lipofectamine 復合物加入含有細胞和培養基的培養板孔中，來回輕柔搖晃培養板。將細胞培養板放入 37℃、5%CO2 培養箱中溫育 4 h 后，除去復合物，更換無血清 DMEM 培養基，放入培養箱中繼續培養。24 h 后取轉染后的細胞，以 qRT-PCR 檢測 p38 mRNA 相對表達量，取表達量最少的 siRNA 序列作為最終序列。實驗重復 3 次，取均值。
1.4.2 實驗分組
將黃韌帶細胞分為 A、B、C、D 組，分別以 siRNA（對照）、p38 siRNA、siRNA+3 ng/mL TGF-β1、p38 siRNA+3 ng/mL TGF-β1 轉染細胞。按 1.4.1 中篩選的最終 siRNA 序列進行轉染。
1.4.3 免疫熒光染色觀察
各組轉染 24 h 后制作細胞爬片，待細胞生長至 70%～80% 融合時，應用 3 ng/mL TGF-β1 刺激 6 h；終止刺激，冷丙酮固定 20 min。PBS 處理 3 次，每次 5 min；PBS-Triton X-100 通透 20 min，再次 PBS 處理 3 次，每次 5 min；正常山羊血清封閉 30 min，滴加一抗 （以 1∶100 比例稀釋的兔抗 p-p38、p38 抗體），4℃ 過夜；PBS 處理 3 次，每次 5 min；37℃ 孵育二抗 30 min，PBS 處理 3 次，每次 5 min；滴加 DAPI 染液常溫染色 10 min，晾干，抗熒光淬滅封片劑封片，4℃ 保存，熒光倒置顯微鏡下觀察。
1.4.4 qRT-PCR 檢測
轉染 24 h 后收集各組細胞，常規消化細胞，按 1.3 方法行 qRT-PCR 檢測各組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量。實驗重復 3 次。
1.4.5 Western blot 檢測
轉染 24 h 后收集各組細胞（每組約 1×107個），加入 0.5 mL 裂解液，按步驟提取樣本總蛋白并對蛋白定量，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜后將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜分別放入裝有 3 mL CTGF（1∶1 000，轉膜條件：300 mA 恒流轉膜 38 min）溶液的小槽內，置于搖床上室溫平緩搖動 1 h；再將 PVDF 膜放入含有 3 mL 辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗溶液（1∶20 000）小槽內，置于搖床上室溫平緩搖動 40 min；洗滌 PVDF 膜進行化學發光、顯影、定影。將膠片進行掃描，用 Image-Pro Plus 6.0 圖像處理系統分析條帶吸光度（A）值。以 GAPDH 為內參，將 CTGF 與 GAPDH 的 A 值比值作為 CTGF 蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 篩選參與 TGF-β1/CTGF 調控黃韌帶肥厚的 MAPK 通路
TGF-β1 組、PD98059 組和 SP600125 組黃韌帶細胞中 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量均顯著高于 SB203580 組和 DMEM 組，差異有統計學意義（P<0.05）；TGF-β1 組、PD98059 組、SP600125 組間以及 SB203580 組、DMEM 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
qRT-PCR 檢測各組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量（n=3，
）
Table1.
Relative mRNA expressions of CTGF, collagen type Ⅰ, and collagen type Ⅲ in each group detected by qRT-PCR (n=3, 
)
2.2 siRNA 干擾 p38 MAPK 通路調控黃韌帶細胞中 TGF-β1/CTGF 表達觀測
2.2.1 篩選進行細胞轉染的最終 siRNA 序列
qRT-PCR 檢測示，對照組、355 序列組、513 序列組和 714 序列組的 p38 mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.00、0.49±0.04、0.65±0.05、0.26±0.01，其中 714 序列組表達量最小，故選擇含 714 序列作為 siRNA 轉染的最終序列。
2.2.2 免疫熒光染色觀察
熒光倒置顯微鏡觀察示，A 組細胞染色呈陽性，但細胞質染色弱，有 p38、p-p38 表達；B 組細胞染色呈陰性，無 p38、p-p38 表達；而 C、D 組細胞染色均呈陽性，其中C 組染色為強陽性；兩組均強于 A 組。見圖 1。
圖1
免疫熒光染色觀察各組 p38 和 p-p38 表達（熒光倒置顯微鏡×100）
從左至右依次為 A、B、C、D 組 a. p38；b. p-p38
Figure1. The expressions of p38 and p-p38 on cells detected by immunofluorescence staining (Fluorescence inverted microscope×100)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. p38; b. p-p38
2.2.3 qRT-PCR 檢測
與 A 組相比，B 組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量顯著減少，C、D 組顯著增加；D 組較 C 組減少；組間差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
qRT-PCR 檢測各組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量（n=3，
）
Table2.
Relative mRNA expressions of CTGF, collagen type Ⅰ, and collagen type Ⅲ in each group detected by qRT-PCR (n=3, 
)
2.2.4 Western blot 檢測
A、B、C、D 組 CTGF 蛋白相對表達量分別為 0.33±0.02、0.05±0.01、0.64±0.01、0.29±0.02，B 組顯著低于 A 組，C 組顯著高于 A、D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測各組 CTGF 蛋白表達
1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組
Figure2. Protein expression of CTGF detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 討論
Smads 通路和 MAPK 通路在組織損傷愈合及瘢痕形成中起重要作用。Smads 通路是公認的 TGF-β1 胞內傳導途徑[12]，Smads 是近年來發現的新的細胞內傳導蛋白，它是目前唯一已被證實的 TGF-β1 受體作用的底物。研究顯示[13]，Smads 通路在 TGF-β1 的作用下表達并活化，表明 Smads 通路參與 CTGF 表達上調的過程，CTGF 基因啟動子中也有 Smads 結合元件，位于啟動序列 167～174 之間，該元件出現突變體時，也能完全消除 CTGF 的表達及 TGF-β1 誘導的 CTGF 表達。但有研究顯示，并不是所有組織細胞中 CTGF 的上調表達都依賴 Smads 通路[14]。由于 MAPK 通路并不影響 Smads 通路的磷酸化，因此可能是 MAPK 通路和 Smads 通路共同參與了 TGF-β1 調節 CTGF 表達的過程[15]。近年也有研究發現 MAPK 通路參與 CTGF 的表達調控[8]。p38 MAPK 通路是生物信號引起核反應的重要通路，是 MAPK 家系亞家族中的重要成員；它由 360 個氨基酸組成，可以應激活化蛋白激酶，是經典的 MAPK 通路。p38 MAPK 通路在細胞生長、死亡、細胞周期、炎癥及其應激反應的調控中起著至關重要的作用[16]，可被紫外線、促炎細胞因子激活[17-18]。p38 MAPK 存在 6 種不同異構體，不同的 p38 MAPK 異構體在體內分布、上游激酶調節、下游作用底物以及對細胞外不同刺激的反應各有不同。而不同異構體之間對底物作用的特異性和選擇性，可能影響著細胞信號傳導的特異性。在同一細胞內，也存在著不同的 p38 MAPK 異構體，這些異構體在細胞內定位的差異，可能是 p38 MAPK 在不同細胞中介導不同生物學效應的機制之一[19-20]。因此我們設想 MAPK 通路是否參與了腰椎黃韌帶增生肥厚過程中 TGF-β1 調節 CTGF 表達的過程，阻斷通路能否抑制腰椎黃韌帶增生肥厚。
本研究結果顯示，加入 TGF-β1 可增加 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 表達，加入 ERK 通路阻斷劑 PD98059 或 JNK 通路阻斷劑 SP600125 再加入 TGF-β1 后，仍表達較高的 mRNA 水平；而加入 p38 通路阻斷劑 SB203580 再加入 TGF-β1 后，CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 表達明顯降低，與 DMEM 組水平近似，說明在 MAPK 通路中，p38 是 TGF-β1 調控 CTGF 表達的特異性信號通路。本研究進一步采用 siRNA 干擾技術進行 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 檢測，結果顯示 siRNA 可沉默黃韌帶細胞內的 p38 MAPK 信號通路，使其無法發揮調控功能，導致 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 表達明顯減少，CTGF 蛋白的表達也同樣受限；再次說明 p38 MAPK 通路與 CTGF 蛋白的表達相關。而加入外源性 TGF-β1 后，受到抑制的 CTGF 表達再次上調，說明 TGF-β1 可以增加 p38、p-p38 生成，并通過 p38 MAPK 通路的作用進一步調節 CTGF 表達。
綜上述，本研究結果表明在人腰椎黃韌帶細胞中，TGF-β1/CTGF 共同參與了細胞增生肥厚的過程，而且是通過 p38 MAPK 通路途徑完成的。剔除 p38 MAPK 基因，可以抑制 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的產生，從而減少黃韌帶細胞增生肥厚的發生，為藥物治療黃韌帶肥厚引起的腰椎管狹窄提供了新的選擇。但本研究僅對黃韌帶增生肥厚機制進行了初步探討，需進一步開展調控機制的相關研究。
人腰椎黃韌帶肥厚導致的腰椎管狹窄癥是臨床常見疾病之一[1]，黃韌帶增生肥厚是細胞微結構損傷后產生的瘢痕炎性反應[2]。TGF-β1 是損傷修復過程中作用最為顯著的因子之一，可以激活黃韌帶細胞中膠原蛋白的表達[3]，在黃韌帶組織纖維化中，可能在損傷、炎癥及纖維化之間起到一定的連接作用。而在腰椎肥厚的黃韌帶中，結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達增加，同時參與了黃韌帶增生肥厚的過程[4]。有研究表明 TGF-β1、CTGF 可促進細胞外基質成分表達增加，TGF-β1 通過 CTGF 協同促進黃韌帶細胞增生[5-6]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路是與創傷愈合相關的胞內信號傳導通路，許多應急原可以刺激 MAPK 通路使其活化，如機械創傷、活性氧、病原微生物刺激等[7]。近年也有研究發現 MAPK 通路參與了 CTGF 的表達調控[8-9]。目前，在哺乳動物細胞中已鑒定出 4 條 MAPK 信號傳導通路：細胞外調節蛋白激酶 1（extracellular regulated protein kinase 1，ERK1 ）通路、ERK2 通路、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路、p38 通路，其中 p38 和 ERK 是促纖維活性信號，JNK 是抑制纖維活性信號。因此，本研究通過篩選參與 TGF-β1/CTGF 調控黃韌帶肥厚的 MAPK 通路，利用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾 p38 MAPK 通路調控黃韌帶細胞中 TGF-β1/CTGF 表達，初步探討 MAPK 通路在 TGF-β1 調控 CTGF 表達過程中的作用，為臨床治療黃韌帶肥厚導致的腰椎管狹窄癥奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 人腰椎黃韌帶細胞的分離與培養
黃韌帶組織由南方醫科大學珠江醫院 13 例行腰椎間盤突出髓核摘除術患者自愿捐贈，術前均經影像學檢查確定無明顯黃韌帶增生。采用膠原酶預消化組織塊培養法[10-11]分離培養得到黃韌帶細胞。經鑒定，所培養的黃韌帶細胞具有典型的成纖維細胞樣表型，傳代細胞增殖良好，不同傳代細胞在同一時間點無明顯差別。本研究取第 3 代對數生長期細胞進行實驗。
1.2 主要試劑及儀器
TGF-β1 蛋白、CTGF 蛋白（Invitrogen 公司，美國）；JNK 通路阻斷劑 SP600125、ERK 通路阻斷劑 PD98059、p38 通路阻斷劑 SB203580（EMD Biochemicals 公司，美國）；兔抗磷酸化 p38（phosphorylation p38，p-p38）單克隆抗體、兔抗 p38 單克隆抗體（Abcam 公司，美國）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒、逆轉錄試劑盒（DBI 公司，德國）；人 p38 MAPK 特異性 siRNA 序列 355、513、714、空白對照（negative control，NC）（上海吉碼制藥技術有限公司）；山羊抗兔 IgG 二抗溶液（BOSTER 公司，美國）；DNase Ⅰ、RNasin（Promega 公司，美國）；RNA 提取試劑 Trizol（Takara 公司，日本）。 Stratagene Mx3000P qRT-PCR 儀（Agilent 公司，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；UV-1206 分光光度儀（Shimodzu 公司，日本）；SCR20B 冷凍離心機（Hitachi 公司，日本）；TGL-16G 高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；水平式電泳儀（北京東方儀器廠）。
1.3 篩選參與 TGF-β1/CTGF 調控黃韌帶肥厚的 MAPK 通路
黃韌帶細胞以 0.2% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化形成細胞懸液，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 3 min，收集細胞，以 1×104個/mL 密度接種于 96 孔板。常規培養 24 h 后更換無血清 DMEM 進一步處理 24 h，將細胞分為 5 組：DMEM 組為無血清 DMEM 組；TGF-β1 組單純加入 3 ng/mL TGF-β1 刺激；PD98059 組、SP600125 組和 SB203580 組分別加入 10 μmol/L 相應通路阻斷劑，1 h 后加入 3 ng/mL TGF-β1 處理 24 h。24 h 后分別收集各組細胞，常規消化細胞后，PBS 洗滌 2 次，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 3 min 后加入 1.5 mL EP 管中，按步驟提取 RNA，使用 RNase-free 的 DNase Ⅰ配置反應液。以 2 μg 總 RNA 為模板，按照逆轉錄試劑盒說明書配制逆轉錄反應體系，總體系 20 μL，合成 cDNA 第 1 鏈，并收集備用。配制 qPCR 擴增的反應體系，進行 PCR 檢測。PCR 反應條件：94℃、2 min，94℃、20 s，58℃、20 s，72℃、20 s，40 個循環；融解曲線分析：溫度 62～95℃。用 2?ΔΔCt法計算各組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量。實驗重復 3 次。
1.4 siRNA 干擾 p38 MAPK 通路調控黃韌帶細胞中 TGF-β1/CTGF 表達觀測
1.4.1 篩選進行細胞轉染的最終 siRNA 序列
黃韌帶細胞按 1×104個/mL 密度接種于 96 孔板，24 h 后換無血清 DMEM 培養基繼續培養過夜，進行 4 種 p38 MAPK 特異性 siRNA 序列（355、513、714、NC）轉染，分別為 355 序列組、513 序列組、714 序列組、對照組。轉染方法：細胞轉染前 1 d，將黃韌帶細胞以 2.5×105個/孔密度接種至含 2 mL 完全培養基（含 10%～20%FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的基礎培養基）的 6 孔板中，室溫培養，使轉染時細胞密度達 50%～70%。在 250 μL DMEM 無血清、無抗生素培養基中加入 8 μL siRNA，柔和混勻；在 250 μL DMEM 無血清、無抗生素培養基中加入 10 μL Lipofectamine，柔和混勻，室溫放置 5 min；將稀釋的 siRNA 和 Lipofectamine 試劑混合，柔和混勻，室溫放置 20 min，形成 siRNA/Lipofectamine 復合物；將 100 μL siRNA/Lipofectamine 復合物加入含有細胞和培養基的培養板孔中，來回輕柔搖晃培養板。將細胞培養板放入 37℃、5%CO2 培養箱中溫育 4 h 后，除去復合物，更換無血清 DMEM 培養基，放入培養箱中繼續培養。24 h 后取轉染后的細胞，以 qRT-PCR 檢測 p38 mRNA 相對表達量，取表達量最少的 siRNA 序列作為最終序列。實驗重復 3 次，取均值。
1.4.2 實驗分組
將黃韌帶細胞分為 A、B、C、D 組，分別以 siRNA（對照）、p38 siRNA、siRNA+3 ng/mL TGF-β1、p38 siRNA+3 ng/mL TGF-β1 轉染細胞。按 1.4.1 中篩選的最終 siRNA 序列進行轉染。
1.4.3 免疫熒光染色觀察
各組轉染 24 h 后制作細胞爬片，待細胞生長至 70%～80% 融合時，應用 3 ng/mL TGF-β1 刺激 6 h；終止刺激，冷丙酮固定 20 min。PBS 處理 3 次，每次 5 min；PBS-Triton X-100 通透 20 min，再次 PBS 處理 3 次，每次 5 min；正常山羊血清封閉 30 min，滴加一抗 （以 1∶100 比例稀釋的兔抗 p-p38、p38 抗體），4℃ 過夜；PBS 處理 3 次，每次 5 min；37℃ 孵育二抗 30 min，PBS 處理 3 次，每次 5 min；滴加 DAPI 染液常溫染色 10 min，晾干，抗熒光淬滅封片劑封片，4℃ 保存，熒光倒置顯微鏡下觀察。
1.4.4 qRT-PCR 檢測
轉染 24 h 后收集各組細胞，常規消化細胞，按 1.3 方法行 qRT-PCR 檢測各組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量。實驗重復 3 次。
1.4.5 Western blot 檢測
轉染 24 h 后收集各組細胞（每組約 1×107個），加入 0.5 mL 裂解液，按步驟提取樣本總蛋白并對蛋白定量，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜后將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜分別放入裝有 3 mL CTGF（1∶1 000，轉膜條件：300 mA 恒流轉膜 38 min）溶液的小槽內，置于搖床上室溫平緩搖動 1 h；再將 PVDF 膜放入含有 3 mL 辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗溶液（1∶20 000）小槽內，置于搖床上室溫平緩搖動 40 min；洗滌 PVDF 膜進行化學發光、顯影、定影。將膠片進行掃描，用 Image-Pro Plus 6.0 圖像處理系統分析條帶吸光度（A）值。以 GAPDH 為內參，將 CTGF 與 GAPDH 的 A 值比值作為 CTGF 蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 篩選參與 TGF-β1/CTGF 調控黃韌帶肥厚的 MAPK 通路
TGF-β1 組、PD98059 組和 SP600125 組黃韌帶細胞中 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量均顯著高于 SB203580 組和 DMEM 組，差異有統計學意義（P<0.05）；TGF-β1 組、PD98059 組、SP600125 組間以及 SB203580 組、DMEM 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
qRT-PCR 檢測各組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量（n=3，）
Table1.
Relative mRNA expressions of CTGF, collagen type Ⅰ, and collagen type Ⅲ in each group detected by qRT-PCR (n=3, )
2.2 siRNA 干擾 p38 MAPK 通路調控黃韌帶細胞中 TGF-β1/CTGF 表達觀測
2.2.1 篩選進行細胞轉染的最終 siRNA 序列
qRT-PCR 檢測示，對照組、355 序列組、513 序列組和 714 序列組的 p38 mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.00、0.49±0.04、0.65±0.05、0.26±0.01，其中 714 序列組表達量最小，故選擇含 714 序列作為 siRNA 轉染的最終序列。
2.2.2 免疫熒光染色觀察
熒光倒置顯微鏡觀察示，A 組細胞染色呈陽性，但細胞質染色弱，有 p38、p-p38 表達；B 組細胞染色呈陰性，無 p38、p-p38 表達；而 C、D 組細胞染色均呈陽性，其中C 組染色為強陽性；兩組均強于 A 組。見圖 1。
圖1
免疫熒光染色觀察各組 p38 和 p-p38 表達（熒光倒置顯微鏡×100）
從左至右依次為 A、B、C、D 組 a. p38；b. p-p38
Figure1. The expressions of p38 and p-p38 on cells detected by immunofluorescence staining (Fluorescence inverted microscope×100)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. p38; b. p-p38
2.2.3 qRT-PCR 檢測
與 A 組相比，B 組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量顯著減少，C、D 組顯著增加；D 組較 C 組減少；組間差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
qRT-PCR 檢測各組 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 相對表達量（n=3，）
Table2.
Relative mRNA expressions of CTGF, collagen type Ⅰ, and collagen type Ⅲ in each group detected by qRT-PCR (n=3, )
2.2.4 Western blot 檢測
A、B、C、D 組 CTGF 蛋白相對表達量分別為 0.33±0.02、0.05±0.01、0.64±0.01、0.29±0.02，B 組顯著低于 A 組，C 組顯著高于 A、D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測各組 CTGF 蛋白表達
1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組
Figure2. Protein expression of CTGF detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 討論
Smads 通路和 MAPK 通路在組織損傷愈合及瘢痕形成中起重要作用。Smads 通路是公認的 TGF-β1 胞內傳導途徑[12]，Smads 是近年來發現的新的細胞內傳導蛋白，它是目前唯一已被證實的 TGF-β1 受體作用的底物。研究顯示[13]，Smads 通路在 TGF-β1 的作用下表達并活化，表明 Smads 通路參與 CTGF 表達上調的過程，CTGF 基因啟動子中也有 Smads 結合元件，位于啟動序列 167～174 之間，該元件出現突變體時，也能完全消除 CTGF 的表達及 TGF-β1 誘導的 CTGF 表達。但有研究顯示，并不是所有組織細胞中 CTGF 的上調表達都依賴 Smads 通路[14]。由于 MAPK 通路并不影響 Smads 通路的磷酸化，因此可能是 MAPK 通路和 Smads 通路共同參與了 TGF-β1 調節 CTGF 表達的過程[15]。近年也有研究發現 MAPK 通路參與 CTGF 的表達調控[8]。p38 MAPK 通路是生物信號引起核反應的重要通路，是 MAPK 家系亞家族中的重要成員；它由 360 個氨基酸組成，可以應激活化蛋白激酶，是經典的 MAPK 通路。p38 MAPK 通路在細胞生長、死亡、細胞周期、炎癥及其應激反應的調控中起著至關重要的作用[16]，可被紫外線、促炎細胞因子激活[17-18]。p38 MAPK 存在 6 種不同異構體，不同的 p38 MAPK 異構體在體內分布、上游激酶調節、下游作用底物以及對細胞外不同刺激的反應各有不同。而不同異構體之間對底物作用的特異性和選擇性，可能影響著細胞信號傳導的特異性。在同一細胞內，也存在著不同的 p38 MAPK 異構體，這些異構體在細胞內定位的差異，可能是 p38 MAPK 在不同細胞中介導不同生物學效應的機制之一[19-20]。因此我們設想 MAPK 通路是否參與了腰椎黃韌帶增生肥厚過程中 TGF-β1 調節 CTGF 表達的過程，阻斷通路能否抑制腰椎黃韌帶增生肥厚。
本研究結果顯示，加入 TGF-β1 可增加 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 表達，加入 ERK 通路阻斷劑 PD98059 或 JNK 通路阻斷劑 SP600125 再加入 TGF-β1 后，仍表達較高的 mRNA 水平；而加入 p38 通路阻斷劑 SB203580 再加入 TGF-β1 后，CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 表達明顯降低，與 DMEM 組水平近似，說明在 MAPK 通路中，p38 是 TGF-β1 調控 CTGF 表達的特異性信號通路。本研究進一步采用 siRNA 干擾技術進行 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 檢測，結果顯示 siRNA 可沉默黃韌帶細胞內的 p38 MAPK 信號通路，使其無法發揮調控功能，導致 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原 mRNA 表達明顯減少，CTGF 蛋白的表達也同樣受限；再次說明 p38 MAPK 通路與 CTGF 蛋白的表達相關。而加入外源性 TGF-β1 后，受到抑制的 CTGF 表達再次上調，說明 TGF-β1 可以增加 p38、p-p38 生成，并通過 p38 MAPK 通路的作用進一步調節 CTGF 表達。
綜上述，本研究結果表明在人腰椎黃韌帶細胞中，TGF-β1/CTGF 共同參與了細胞增生肥厚的過程，而且是通過 p38 MAPK 通路途徑完成的。剔除 p38 MAPK 基因，可以抑制 CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的產生，從而減少黃韌帶細胞增生肥厚的發生，為藥物治療黃韌帶肥厚引起的腰椎管狹窄提供了新的選擇。但本研究僅對黃韌帶增生肥厚機制進行了初步探討，需進一步開展調控機制的相關研究。
