引用本文： 林劍彪, 黃國鋒, 葉文斌, 朱聰, 高建廷, 劉國浚, 江惠祥, 吳本文, 丁真奇. SDF-1α/CXCR4 信號通路在軸向應力刺激促進骨再生中的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(6): 689-697. doi: 10.7507/1002-1892.201811031 復制
力學環境是骨生長與骨重建過程中的重要微環境之一，同樣也是 BMSCs 增殖與分化過程中關鍵的刺激因素[1]。BMSCs 是骨髓內一種具有多向分化潛能的干細胞，機體受損時其能在受傷組織細胞分泌的趨化因子影響下，遷移到骨折區域或骨缺損處，促進骨愈合[2-3]。研究表明，基質細胞衍生因子 1α/趨化因子 CXC 亞族受體 4（stromal cell-derived factor 1α/cysteine X cysteine receptor 4，SDF-1α/CXCR4）信號通路在 MSCs 遷移中發揮重要作用[4]。 而軸向應力刺激可加速骨折愈合[5-8]及支架降解[9]。SDF-1α/CXCR4 信號通路是否在軸向應力刺激促進骨再生中發揮作用，目前尚不明確。
本課題組主要以軸向應力刺激為中心，將脫蛋白松質骨、BMSCs 及 SDF-1α/CXCR4 信號通路相結合，以明確外界應力刺激與內部調節因子間的關系。本研究利用自行研制的骨應力刺激儀進行動物實驗，制備兔脛骨缺損修復模型模擬人體骨缺損修復過程，修復期間行軸向叩擊治療，經影像學、免疫組織化學及 Western blot 檢測，了解骨愈合情況以及 VEGF、SDF-1α 和 CXCR4 的表達情況，進一步探討軸向應力刺激促進骨再生的機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
3～4 月齡雄性新西蘭大白兔 72 只，體質量 2.0～2.5 kg，由上海市松江區松聯實驗動物場提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0011；由廈門大學附屬東南醫院/第九〇九醫院全軍骨科中心實驗動物房飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0054。實驗經廈門大學附屬東南醫院/第九〇九醫院動物倫理委員會批準，實驗過程中對動物的處置嚴格遵循國家有關動物保護和使用指南。
1.2 主要試劑及儀器
CXCR4 拮抗劑 AMD3100（上海皓元生物醫藥科技有限公司），使用前用 PBS 溶液配制成濃度為 0.1 mg/mL 的 AMD3100 溶液。一抗兔/小鼠 IgG、二抗聚合 HRP 標記兔/小鼠 IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；SDF-1α、CXCR4 羊抗大鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；羊抗兔 IgG（南京森貝伽生物科技有限公司）。
骨應力刺激儀（專利號：CNl803117；廈門大博穎精醫療器械公司）。該儀器主要由主機、連接于主機一側的凹槽式托架及遙控器 3 個部分組成。通過小錘伸縮運動，給予動態軸向循環應力刺激，模擬動物活動時負重骨受到的生理性應力。應力范圍 1～50 N，頻率 0.5～3.0 Hz，叩擊時間 5～35 s，間歇時間 3～19 s。LEO-1530 掃描電鏡（LEO 公司，德國）；Image Pro Plus 5.0 圖像分析軟件（MEDIA CYBERNETICS 公司，美國）；ChemiScope 6000 Touch 型電泳指導成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。
1.3 脫蛋白松質骨支架制備
按照文獻[10]方法制備脫蛋白松質骨支架。取市售小牛長骨干骺端，徹底剔除骨膜及軟組織，清除骨髓，玻璃鉆鉆取直徑 8 mm 圓柱狀松質骨；37℃ 水浴箱孵育條件下，將松質骨置入 20%H2O2 進行脫蛋白 72 h，乙醚循環脫脂 48 h，制備脫蛋白松質骨支架，冷凍干燥。掃描電鏡觀察支架內部密集微孔結構，直徑約 200 μm（圖 1）。選擇微孔密度、大小類似的支架樣品，環氧乙烷消毒，密封保存備用。
圖1
掃描電鏡觀察脫蛋白松質骨支架（×50）
Figure1.
Scanning electron microscopy observation of deprotei nized cancellous bone scaffold (×50)
1.4 動物模型制備
72 只新西蘭大白兔術前禁水 2 h、禁食 8 h。將氯胺酮、陸眠寧按 2∶1 比例混合后，按照 0.5 mL/kg 劑量肌肉注射麻醉實驗動物。于右后肢脛骨平臺內側下方 0.5 cm 處作長 2 cm 的縱切口，分離周圍軟組織與筋膜，向外牽開髕韌帶，暴露脛骨結節近端斜面，用執筆式電鉆制作直徑 8 mm 圓形皮質骨缺損[11]。制備過程中，鉆頭垂直于骨面，鉆取深度為 0.5～0.8 mm；注意生理鹽水連續沖洗降溫，同時清除骨碎屑。生理鹽水沖洗術區后，于骨缺損處植入大小合適的脫蛋白松質骨支架，紗布擦拭干凈后逐層縫合切口。術后每天注射青霉素 40 萬 U，連續 3 d，預防感染。石膏固定術肢于屈髖、屈膝、屈踝位，直至實驗結束。見圖 2a～c。
圖2
兔脛骨缺損修復模型制備及術肢應力刺激示意圖
a. 修復前；b. 修復后；c. 術肢石膏固定后；d. 術肢給予應力刺激
Figure2. Repair model of tibial defect in rabbits and stress stimulation sketch of operative limbsa. Before repair; b. After repair; c. After plaster fixation; d. Stress stimulation of the operative limb
1.5 實驗分組及方法
將 72 只動物模型隨機分為 3 組（n=24），分別為 PBS 組（A 組）、PBS+應力刺激組（B 組）、AMD3100+應力刺激組（C 組）。骨缺損修復模型制備后，C 組立即腹腔注射 AMD3100 溶液（5 mL/kg），隔天 1 次，直至實驗結束；A、B 組腹腔注射 PBS 溶液（5 mL/kg）。術后第 8 天開始，B、C 組采用骨應力刺激儀叩擊術側足跟部。叩擊前同上法麻醉動物，拆除術肢石膏后將脛骨水平放置于固定架，足跟部與叩擊小錘圓心在同一水平面上，小錘通過往返伸縮運動叩擊足跟部（圖 2d）。每 2 天給予應力刺激 1 次，每次 30 min，直至實驗結束。叩擊參數：應力 15 N、頻率 1 Hz、叩擊時間 5 s、間歇時間 3 s。叩擊結束后術肢再次石膏固定，分籠飼養，允許自由活動。
1.6 觀測指標
1.6.1 一般情況
觀察各組術后動物成活及切口愈合情況，有無其他處骨折導致術肢畸形。
1.6.2 影像學觀測
術后 2、4、8、12 周，各組取 6 只動物攝 X 線片，觀察骨缺損愈合情況。根據 Lane-Sandhu X 線評分標準[12]，從有無新骨形成、骨折線清晰程度和骨重塑情況三方面對骨愈合評分。術后 12 周，各組 X 線片觀察后行 Micro-CT 檢查，對骨缺損區域掃描并三維重建，計算新生骨體積及新生骨密度。
1.6.3 組織學觀察
術后 2、4、8、12 周，各組影像學觀測后采用空氣栓塞法處死動物，按照原切口入路切取脛骨，剔除脛骨肌肉組織，在骨缺損區域上、下各 0.25 cm 處用線鋸鋸斷，獲得長約 1.5 cm 骨組織。取部分標本脫鈣、石蠟包埋、切片，片厚約 3 μm，常規 HE 染色后，光鏡下觀察新生骨組織及支架降解情況。
1.6.4 免疫組織化學染色觀察
術后 2、4、8、12 周，取各組 1.6.3 中制備的切片脫蠟和水化，PBS 清洗后抗原修復，甲醛固定。滴加一抗兔/小鼠 IgG，4℃ 過夜，滴加聚合 HRP 標記抗兔/小鼠 IgG 二抗，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度脫水、透明、樹脂封片。光鏡下觀察骨缺損區、支架、外骨痂及內骨痂骨情況。采用 Image Pro Plus 5.0 圖像分析軟件測定 VEGF、CXCR4 陽性細胞吸光度（A）值，評價其表達水平。
1.6.5 Western blot檢測
取 3 組術后 4、8 周部分骨組織樣本，制備電泳凝膠，進行 SDS-PAGE 及轉移（半干式轉移）。一抗為 SDF-1α、CXCR4 羊抗大鼠多克隆抗體（1∶500），二抗為羊抗兔 IgG（1∶5 000）。采用電泳指導成像系統對雜交帶進行掃膜分析，測量 SDF-1α 及 CXCR4 蛋白表達水平。
1.7 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗過程中，3 只動物因麻醉原因死亡，作相應補充。各組實驗動物麻醉清醒后均正常進食，術后切口均Ⅰ期愈合。術后 12 周標本取材時大體觀察，A 組骨缺損區可見大量支架殘留，僅有部分新生骨生成；B 組骨缺損區支架被新生骨完全吸收替代，髓腔通暢；C 組骨缺損區骨痂生成，支架大部分吸收，但骨缺損仍未修復。
2.2 影像學觀測
2.2.1 X線片觀察
A 組：術后 2 周骨缺損區及支架無明顯變化；4 周時僅少量骨痂形成，骨缺損邊緣仍清晰可見；8 周時骨痂增多，但大部分支架仍存在，無明顯吸收；12 周骨痂進一步增多，但骨缺損區仍以高密度陰影為主，髓腔仍被支架堵塞。B 組：術后 2 周骨缺損區邊緣骨折線稍模糊；4 周時骨缺損區邊緣變模糊，骨痂進一步向支架長入；8 周時新生骨痂明顯增多，且支架大部分吸收，出現部分骨髓腔結構；12 周時骨缺損區新生骨組織形態與正常骨基本相同，新骨塑形好，髓腔再通，骨皮質連續。C 組：術后 2 周骨缺損區及支架無明顯變化；4 周時骨缺損中央區呈低密度組織陰影，可見少量新生骨痂；8 周時骨缺損邊緣模糊，部分骨痂形成；12 周骨缺損區未愈合，支架大部分吸收。見圖 3。
圖3
術后各組X線片檢查
從左至右分別為 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure3. X-ray films of 3 groups after operationFrom left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
X 線片評分顯示，除 2 周外，4、8、12 周時 B 組評分均明顯高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
術后各組Lane-Sandhu X線評分
Figure4.
The Lane-Sandhu scores of 3 groups after operation
2.2.2 Micro-CT觀測
術后 12 周，A 組脛骨骨缺損僅部分修復，骨痂較少，骨髓腔中仍見大量支架；B 組骨缺損完全修復，髓腔再通且修復部位骨皮質厚度較一致；C 組骨缺損未完全修復，髓腔中仍有少量支架。見圖 5。
圖5
各組術后12 周骨缺損區域Micro-CT 三維重建
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure5. Micro-CT three-dimensional reconstruction of bone defect at 12 weeks after operation in 3 groupsa. Group A; b. Group B; c. Group C
B 組新生骨體積為（192.3±9.9）mm3，明顯高于 A 組的（88.6±8.0）mm3 和 C 組的（87.3±103）mm3，差異均有統計學意義（P<0.05）；B 組新生骨密度為（969.2±102.2）mg HA/ccm，明顯高于 A 組（627.8±95.3）mg HA/ccm 和 C 組的（605.1±95.4）mg HA/ccm，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 組織學觀察
A 組：術后 2 周，支架無明顯吸收且未見新生骨組織；4 周，支架無明顯吸收，材料孔隙內充滿纖維組織及炎性細胞，極少量新生骨形成；8 周，支架部分吸收，周圍仍被纖維組織包裹，缺損區邊緣少量新生骨形成；12 周，仍可見大部分支架存在，有部分新骨形成，以缺損區邊緣為主，新生骨與宿主部分連接。見圖 6a。
圖6
術后各組HE染色觀察（×40）
從左至右分別為 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure6. HE staining observation of 3 groups after operation (×40)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
B 組：術后 2 周，支架材料孔隙內有部分纖維結締組織、血管和炎性細胞聚集，支架上可見少量新生骨組織；4 周，支架材料部分吸收，纖維結締組織、血管及新生骨組織進一步增多；8 周，支架材料大部分吸收，以新生骨組織替代，新生骨與骨端連接緊密；12 周，支架完全吸收，部分新生骨形成板層骨，有典型骨小梁形成，其內可見大量成骨細胞，缺損區骨皮質連續。見圖 6b。
C 組：術后 2 周，支架無明顯吸收及無新生骨組織；4 周，支架少量吸收且可見少量新生骨組織，纖維結締組織、血管；8 周，支架進一步吸收，少量骨小梁，周圍分布大量纖維結締組織、炎性細胞及新生血管；12 周，仍可見部分殘余支架，骨組織雖呈一定序列排列，且骨小梁數量較少、間隙寬大，未見明顯成骨細胞。見圖 6c。
2.4 免疫組織化學染色觀察
2.4.1 VEGF
術后 2 周，3 組基質中間充質細胞、軟骨細胞及成纖維細胞中均有 VEGF 陽性表達。4 周，與 A、C 組相比，B 組支架周邊及新生骨組織陽性表達均增強。8 周后，3 組 VEGF 陽性表達較前下降，但 B 組陽性表達仍高于 A、C 組。見圖 7。
圖7
術后各組免疫組織化學染色觀察VEGF表達（×200）
從左至右分別為 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure7. Immunohistochemical staining of VEGF in 3 groups after operation (×200)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.4.2 CXCR4
術后 2 周，A 組僅有少量細胞顯色，B 組較多，C 組偶有細胞顯色。4 周，A、B 組顯色細胞進一步增多，B 組顯色程度強于 A 組，C 組仍僅有少數細胞顯色。8 周后，3 組顯色程度較前減弱，但 B 組仍強于 A、C 組。見圖 8。
圖8
術后各組免疫組織化學染色觀察CXCR4表達（×200）
從左至右分別為 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure8. Immunohistochemical staining of CXCR4 in 3 groups after operation (×200)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
術后各時間點 B 組 VEGF、CXCR4 陽性表達量明顯高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 9。
圖9
各組VEGF及CXCR4表達比較
a. VEGF；b. CXCR4
Figure9. Comparison of VEGF and CXCR4 expressions between groupsa. VEGF; b. CXCR4
2.5 Western blot檢測
4、8 周時 B 組 SDF-1α 與 CXCR4 蛋白表達均高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 10、11。
圖10
Western blot檢測SDF-1α及CXCR4蛋白表達1：A組 2：B組 3：C組 a. 4 周; b. 8 周
Figure10.
The SDF-1α and CXCR4 protein expressions detected by Western blot
1: Group A 2: Group B 3: Group C a. Four weeks; b. Eight weeks
圖11
各組 SDF-1α 及 CXCR4 蛋白表達量比較
a. 4 周; b. 8 周
Figure11. Comparison of SDF-1α and CXCR4 protein expressions between groupsa. Four weeks; b. Eight weeks
3 討論
骨折愈合是一個錯綜復雜的生物學過程，與應力環境密切相關。應力對骨折愈合的影響主要包括 3 個因素。① 應力方向：骨折愈合初期，軸向應力可促進軟骨基質礦化及 BMSCs 分化、增殖，并形成不同的組織類型，有利于編織骨改建成板層骨[13-14]。臨床研究已經證實軸向應力叩擊治療能明顯加速骨再生，促進骨愈合，具有良好的臨床應用價值[6]。② 應力方式：與連續性應力刺激相比，間歇性應力刺激更能增強成骨細胞活性。喻鑫罡等[15]對綿羊雙側脛骨中段橫行截骨，在單邊外固定支架固定后予低頻微動刺激，結果顯示在骨折愈合早期頻率 1.0 Hz 的微動刺激能有效促進骨組織生長及骨痂礦化。③ 應力大小：應力刺激過大、過小均不利于骨折愈合，只有適宜的應力才能促進成骨作用。本課題組前期研究[9]還發現，術后 1 周給予兔自身體質量 1/2 的軸向叩擊刺激最有利于骨缺損修復，刺激最佳參數組合為每 2 天刺激 1 次，每次 30 min，應力 15 N，頻率 1 Hz，叩擊時間 5 s，間歇時間 3 s，有利于成骨的最終形成及支架材料降解。因此，本次研究中我們選擇了該應力刺激參數組合，結果顯示該種叩擊式應力刺激可以促進骨再生。
本次研究一個重要目的是探索叩擊式應力刺激促進骨再生的機制。既往研究發現，SDF-1α 在機械應力刺激骨折愈合的過程中起重要作用。人體內 SDF-lα/CXCR4 是 BMSCs 動員、遷移、歸巢的關鍵性因素之一。同時，在骨損傷早期各種炎性介質亦能調節 SDF-lα 表達，相關動物實驗發現通過給予間歇性應力刺激，在一定程度上造成細微的二次損傷，可明顯延長骨折區域的炎性反應期[16]，使骨膜表達 SDF-1α 明顯增強，誘導 BMSCs 遷移至骨損傷部位[17]。BMSCs 進入骨缺損區域后，不但可以分泌促進新生骨組織細胞生長因子，還可以間接促進骨組織血管化，對于加速骨愈合形成起著重要作用[18-19]。另外，BMSCs 增殖與分化過程中離不開機械應力刺激[1]。Simmons 等[20]采用周期性機械牽張力刺激 BMSCs，發現實驗組細胞外基質礦化明顯優于對照組。而缺乏機械應力刺激時，BMSCs 向脂肪細胞轉化的能力增強，向成骨細胞轉化的能力受到抑制。
為進一步驗證 SDF-lα/CXCR4 信號通路的作用，我們采用了 AMD3100 阻斷 SDF-lα/CXCR4 信號通路，觀察骨再生是否受影響。本次研究所用的 AMD3100 是人工合成的大環類 CXCR4 的非肽類阻斷劑，可有效地與 CXCR4 結合阻斷 SDF-1α 與 CXCR4 啟動下游信號通路，但不對 CXCR4 產生激動作用。AMD3100 具有阻止 BMSCs 順 SDF-1α 濃度梯度遷移的作用，大劑量 AMD3100 具備動員干細胞作用，而小劑量 AMD3100 動員干細胞能力明顯減弱。有研究發現 SDF-1α 能刺激 VEGF、TGF-β 的表達[21-23]，利用鼠模型研究 VEGF 誘導血管形成，發現新生血管周圍聚集著 BMSCs，同時 SDF-1α 大量表達，當給予 AMD3100 阻斷信號通路后 BMSCs 和新生血管數量明顯減少，提示 VEGF 能夠誘導 BMSCs，且 SDF-1α 能協助 VEGF 促血管形成，兩者具有相互影響、協同分泌作用。本次研究中，相同應力刺激下連續應用小劑量 AMD3100 使骨折愈合時間明顯延長，提示 SDF-lα/CXCR4 信號通路在軸向應力促進骨再生中發揮重要調節作用。另外，本次研究觀察了術后 2、4、8、12 周骨缺損區移植支架吸收與骨愈合情況，分析早期應力刺激狀態下骨愈合與 SDF-lα 的相關性。研究表明，僅有胞膜表達 CXCR4 的 BMSCs 才會順 SDF-lα 濃度差遷移至骨折部位，無 CXCR4 的 BMSCs 則不受誘導[24]。本次研究中，CXCR4 免疫組織化學染色觀察發現，B 組術后染色程度強于 A、C 組，而 C 組僅微量表達。這提示骨愈合早期，應力刺激可能延長炎癥期，骨缺損區組織 SDF-lα 表達得到加強，軸向應力叩擊同時促使 BMSCs 不斷增殖、分化，成骨細胞和軟骨細胞數量劇增，形成放大效應，骨愈合后期骨損傷處逐漸修復，SDF-1α 表達減少，陽性結果表達呈遞減趨勢。同時，Western blot 檢測結果顯示，應力刺激下 SDF-1α 及 CXCR4 在骨愈合早期得到充分表達，隨著骨缺損區的修復，受損組織局部氧張力趨于正常，SDF-1α 表達量逐漸下降，亦接近于正常[25]，此與免疫組織化學染色結果一致。上述結果表明，給予應力刺激下，骨損傷組織 SDF-1α 蛋白表達明顯增多，表達有 CXCR4 受體的 BMSCs 隨之增多，反之也提示若缺少應力刺激可能會影響 BMSCs 增殖及分化進程。
本研究不足包括未闡明應力刺激治療后，骨缺損 SDF-1α 表達上調的具體分泌組織結構、檢測誘導 BMSCs 的 SDF-1α 最佳濃度，未能驗證除此因素是否還受其他生長因子的調控。傳統觀點認為 SDF-1α 僅有唯一受體 CXCR4[26]，但隨著研究深入，發現 CXCR7 為 SDF-1α 新受體[27]。雖然 AMD3100 能夠同時抑制 BMSCs 膜上 CXCR4 及 CXCR7 蛋白的表達[28]，但對 SDF-1α/CXCR7 信號通路在 BMSCs 中的作用機制有待進一步探索。
力學環境是骨生長與骨重建過程中的重要微環境之一，同樣也是 BMSCs 增殖與分化過程中關鍵的刺激因素[1]。BMSCs 是骨髓內一種具有多向分化潛能的干細胞，機體受損時其能在受傷組織細胞分泌的趨化因子影響下，遷移到骨折區域或骨缺損處，促進骨愈合[2-3]。研究表明，基質細胞衍生因子 1α/趨化因子 CXC 亞族受體 4（stromal cell-derived factor 1α/cysteine X cysteine receptor 4，SDF-1α/CXCR4）信號通路在 MSCs 遷移中發揮重要作用[4]。 而軸向應力刺激可加速骨折愈合[5-8]及支架降解[9]。SDF-1α/CXCR4 信號通路是否在軸向應力刺激促進骨再生中發揮作用，目前尚不明確。
本課題組主要以軸向應力刺激為中心，將脫蛋白松質骨、BMSCs 及 SDF-1α/CXCR4 信號通路相結合，以明確外界應力刺激與內部調節因子間的關系。本研究利用自行研制的骨應力刺激儀進行動物實驗，制備兔脛骨缺損修復模型模擬人體骨缺損修復過程，修復期間行軸向叩擊治療，經影像學、免疫組織化學及 Western blot 檢測，了解骨愈合情況以及 VEGF、SDF-1α 和 CXCR4 的表達情況，進一步探討軸向應力刺激促進骨再生的機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
3～4 月齡雄性新西蘭大白兔 72 只，體質量 2.0～2.5 kg，由上海市松江區松聯實驗動物場提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0011；由廈門大學附屬東南醫院/第九〇九醫院全軍骨科中心實驗動物房飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0054。實驗經廈門大學附屬東南醫院/第九〇九醫院動物倫理委員會批準，實驗過程中對動物的處置嚴格遵循國家有關動物保護和使用指南。
1.2 主要試劑及儀器
CXCR4 拮抗劑 AMD3100（上海皓元生物醫藥科技有限公司），使用前用 PBS 溶液配制成濃度為 0.1 mg/mL 的 AMD3100 溶液。一抗兔/小鼠 IgG、二抗聚合 HRP 標記兔/小鼠 IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；SDF-1α、CXCR4 羊抗大鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；羊抗兔 IgG（南京森貝伽生物科技有限公司）。
骨應力刺激儀（專利號：CNl803117；廈門大博穎精醫療器械公司）。該儀器主要由主機、連接于主機一側的凹槽式托架及遙控器 3 個部分組成。通過小錘伸縮運動，給予動態軸向循環應力刺激，模擬動物活動時負重骨受到的生理性應力。應力范圍 1～50 N，頻率 0.5～3.0 Hz，叩擊時間 5～35 s，間歇時間 3～19 s。LEO-1530 掃描電鏡（LEO 公司，德國）；Image Pro Plus 5.0 圖像分析軟件（MEDIA CYBERNETICS 公司，美國）；ChemiScope 6000 Touch 型電泳指導成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。
1.3 脫蛋白松質骨支架制備
按照文獻[10]方法制備脫蛋白松質骨支架。取市售小牛長骨干骺端，徹底剔除骨膜及軟組織，清除骨髓，玻璃鉆鉆取直徑 8 mm 圓柱狀松質骨；37℃ 水浴箱孵育條件下，將松質骨置入 20%H2O2 進行脫蛋白 72 h，乙醚循環脫脂 48 h，制備脫蛋白松質骨支架，冷凍干燥。掃描電鏡觀察支架內部密集微孔結構，直徑約 200 μm（圖 1）。選擇微孔密度、大小類似的支架樣品，環氧乙烷消毒，密封保存備用。
圖1
掃描電鏡觀察脫蛋白松質骨支架（×50）
Figure1.
Scanning electron microscopy observation of deprotei nized cancellous bone scaffold (×50)
1.4 動物模型制備
72 只新西蘭大白兔術前禁水 2 h、禁食 8 h。將氯胺酮、陸眠寧按 2∶1 比例混合后，按照 0.5 mL/kg 劑量肌肉注射麻醉實驗動物。于右后肢脛骨平臺內側下方 0.5 cm 處作長 2 cm 的縱切口，分離周圍軟組織與筋膜，向外牽開髕韌帶，暴露脛骨結節近端斜面，用執筆式電鉆制作直徑 8 mm 圓形皮質骨缺損[11]。制備過程中，鉆頭垂直于骨面，鉆取深度為 0.5～0.8 mm；注意生理鹽水連續沖洗降溫，同時清除骨碎屑。生理鹽水沖洗術區后，于骨缺損處植入大小合適的脫蛋白松質骨支架，紗布擦拭干凈后逐層縫合切口。術后每天注射青霉素 40 萬 U，連續 3 d，預防感染。石膏固定術肢于屈髖、屈膝、屈踝位，直至實驗結束。見圖 2a～c。
圖2
兔脛骨缺損修復模型制備及術肢應力刺激示意圖
a. 修復前；b. 修復后；c. 術肢石膏固定后；d. 術肢給予應力刺激
Figure2. Repair model of tibial defect in rabbits and stress stimulation sketch of operative limbsa. Before repair; b. After repair; c. After plaster fixation; d. Stress stimulation of the operative limb
1.5 實驗分組及方法
將 72 只動物模型隨機分為 3 組（n=24），分別為 PBS 組（A 組）、PBS+應力刺激組（B 組）、AMD3100+應力刺激組（C 組）。骨缺損修復模型制備后，C 組立即腹腔注射 AMD3100 溶液（5 mL/kg），隔天 1 次，直至實驗結束；A、B 組腹腔注射 PBS 溶液（5 mL/kg）。術后第 8 天開始，B、C 組采用骨應力刺激儀叩擊術側足跟部。叩擊前同上法麻醉動物，拆除術肢石膏后將脛骨水平放置于固定架，足跟部與叩擊小錘圓心在同一水平面上，小錘通過往返伸縮運動叩擊足跟部（圖 2d）。每 2 天給予應力刺激 1 次，每次 30 min，直至實驗結束。叩擊參數：應力 15 N、頻率 1 Hz、叩擊時間 5 s、間歇時間 3 s。叩擊結束后術肢再次石膏固定，分籠飼養，允許自由活動。
1.6 觀測指標
1.6.1 一般情況
觀察各組術后動物成活及切口愈合情況，有無其他處骨折導致術肢畸形。
1.6.2 影像學觀測
術后 2、4、8、12 周，各組取 6 只動物攝 X 線片，觀察骨缺損愈合情況。根據 Lane-Sandhu X 線評分標準[12]，從有無新骨形成、骨折線清晰程度和骨重塑情況三方面對骨愈合評分。術后 12 周，各組 X 線片觀察后行 Micro-CT 檢查，對骨缺損區域掃描并三維重建，計算新生骨體積及新生骨密度。
1.6.3 組織學觀察
術后 2、4、8、12 周，各組影像學觀測后采用空氣栓塞法處死動物，按照原切口入路切取脛骨，剔除脛骨肌肉組織，在骨缺損區域上、下各 0.25 cm 處用線鋸鋸斷，獲得長約 1.5 cm 骨組織。取部分標本脫鈣、石蠟包埋、切片，片厚約 3 μm，常規 HE 染色后，光鏡下觀察新生骨組織及支架降解情況。
1.6.4 免疫組織化學染色觀察
術后 2、4、8、12 周，取各組 1.6.3 中制備的切片脫蠟和水化，PBS 清洗后抗原修復，甲醛固定。滴加一抗兔/小鼠 IgG，4℃ 過夜，滴加聚合 HRP 標記抗兔/小鼠 IgG 二抗，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度脫水、透明、樹脂封片。光鏡下觀察骨缺損區、支架、外骨痂及內骨痂骨情況。采用 Image Pro Plus 5.0 圖像分析軟件測定 VEGF、CXCR4 陽性細胞吸光度（A）值，評價其表達水平。
1.6.5 Western blot檢測
取 3 組術后 4、8 周部分骨組織樣本，制備電泳凝膠，進行 SDS-PAGE 及轉移（半干式轉移）。一抗為 SDF-1α、CXCR4 羊抗大鼠多克隆抗體（1∶500），二抗為羊抗兔 IgG（1∶5 000）。采用電泳指導成像系統對雜交帶進行掃膜分析，測量 SDF-1α 及 CXCR4 蛋白表達水平。
1.7 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗過程中，3 只動物因麻醉原因死亡，作相應補充。各組實驗動物麻醉清醒后均正常進食，術后切口均Ⅰ期愈合。術后 12 周標本取材時大體觀察，A 組骨缺損區可見大量支架殘留，僅有部分新生骨生成；B 組骨缺損區支架被新生骨完全吸收替代，髓腔通暢；C 組骨缺損區骨痂生成，支架大部分吸收，但骨缺損仍未修復。
2.2 影像學觀測
2.2.1 X線片觀察
A 組：術后 2 周骨缺損區及支架無明顯變化；4 周時僅少量骨痂形成，骨缺損邊緣仍清晰可見；8 周時骨痂增多，但大部分支架仍存在，無明顯吸收；12 周骨痂進一步增多，但骨缺損區仍以高密度陰影為主，髓腔仍被支架堵塞。B 組：術后 2 周骨缺損區邊緣骨折線稍模糊；4 周時骨缺損區邊緣變模糊，骨痂進一步向支架長入；8 周時新生骨痂明顯增多，且支架大部分吸收，出現部分骨髓腔結構；12 周時骨缺損區新生骨組織形態與正常骨基本相同，新骨塑形好，髓腔再通，骨皮質連續。C 組：術后 2 周骨缺損區及支架無明顯變化；4 周時骨缺損中央區呈低密度組織陰影，可見少量新生骨痂；8 周時骨缺損邊緣模糊，部分骨痂形成；12 周骨缺損區未愈合，支架大部分吸收。見圖 3。
圖3
術后各組X線片檢查
從左至右分別為 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure3. X-ray films of 3 groups after operationFrom left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
X 線片評分顯示，除 2 周外，4、8、12 周時 B 組評分均明顯高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
術后各組Lane-Sandhu X線評分
Figure4.
The Lane-Sandhu scores of 3 groups after operation
2.2.2 Micro-CT觀測
術后 12 周，A 組脛骨骨缺損僅部分修復，骨痂較少，骨髓腔中仍見大量支架；B 組骨缺損完全修復，髓腔再通且修復部位骨皮質厚度較一致；C 組骨缺損未完全修復，髓腔中仍有少量支架。見圖 5。
圖5
各組術后12 周骨缺損區域Micro-CT 三維重建
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure5. Micro-CT three-dimensional reconstruction of bone defect at 12 weeks after operation in 3 groupsa. Group A; b. Group B; c. Group C
B 組新生骨體積為（192.3±9.9）mm3，明顯高于 A 組的（88.6±8.0）mm3 和 C 組的（87.3±103）mm3，差異均有統計學意義（P<0.05）；B 組新生骨密度為（969.2±102.2）mg HA/ccm，明顯高于 A 組（627.8±95.3）mg HA/ccm 和 C 組的（605.1±95.4）mg HA/ccm，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 組織學觀察
A 組：術后 2 周，支架無明顯吸收且未見新生骨組織；4 周，支架無明顯吸收，材料孔隙內充滿纖維組織及炎性細胞，極少量新生骨形成；8 周，支架部分吸收，周圍仍被纖維組織包裹，缺損區邊緣少量新生骨形成；12 周，仍可見大部分支架存在，有部分新骨形成，以缺損區邊緣為主，新生骨與宿主部分連接。見圖 6a。
圖6
術后各組HE染色觀察（×40）
從左至右分別為 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure6. HE staining observation of 3 groups after operation (×40)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
B 組：術后 2 周，支架材料孔隙內有部分纖維結締組織、血管和炎性細胞聚集，支架上可見少量新生骨組織；4 周，支架材料部分吸收，纖維結締組織、血管及新生骨組織進一步增多；8 周，支架材料大部分吸收，以新生骨組織替代，新生骨與骨端連接緊密；12 周，支架完全吸收，部分新生骨形成板層骨，有典型骨小梁形成，其內可見大量成骨細胞，缺損區骨皮質連續。見圖 6b。
C 組：術后 2 周，支架無明顯吸收及無新生骨組織；4 周，支架少量吸收且可見少量新生骨組織，纖維結締組織、血管；8 周，支架進一步吸收，少量骨小梁，周圍分布大量纖維結締組織、炎性細胞及新生血管；12 周，仍可見部分殘余支架，骨組織雖呈一定序列排列，且骨小梁數量較少、間隙寬大，未見明顯成骨細胞。見圖 6c。
2.4 免疫組織化學染色觀察
2.4.1 VEGF
術后 2 周，3 組基質中間充質細胞、軟骨細胞及成纖維細胞中均有 VEGF 陽性表達。4 周，與 A、C 組相比，B 組支架周邊及新生骨組織陽性表達均增強。8 周后，3 組 VEGF 陽性表達較前下降，但 B 組陽性表達仍高于 A、C 組。見圖 7。
圖7
術后各組免疫組織化學染色觀察VEGF表達（×200）
從左至右分別為 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure7. Immunohistochemical staining of VEGF in 3 groups after operation (×200)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.4.2 CXCR4
術后 2 周，A 組僅有少量細胞顯色，B 組較多，C 組偶有細胞顯色。4 周，A、B 組顯色細胞進一步增多，B 組顯色程度強于 A 組，C 組仍僅有少數細胞顯色。8 周后，3 組顯色程度較前減弱，但 B 組仍強于 A、C 組。見圖 8。
圖8
術后各組免疫組織化學染色觀察CXCR4表達（×200）
從左至右分別為 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure8. Immunohistochemical staining of CXCR4 in 3 groups after operation (×200)From left to right for 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
術后各時間點 B 組 VEGF、CXCR4 陽性表達量明顯高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 9。
圖9
各組VEGF及CXCR4表達比較
a. VEGF；b. CXCR4
Figure9. Comparison of VEGF and CXCR4 expressions between groupsa. VEGF; b. CXCR4
2.5 Western blot檢測
4、8 周時 B 組 SDF-1α 與 CXCR4 蛋白表達均高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 10、11。
圖10
Western blot檢測SDF-1α及CXCR4蛋白表達1：A組 2：B組 3：C組 a. 4 周; b. 8 周
Figure10.
The SDF-1α and CXCR4 protein expressions detected by Western blot
1: Group A 2: Group B 3: Group C a. Four weeks; b. Eight weeks
圖11
各組 SDF-1α 及 CXCR4 蛋白表達量比較
a. 4 周; b. 8 周
Figure11. Comparison of SDF-1α and CXCR4 protein expressions between groupsa. Four weeks; b. Eight weeks
3 討論
骨折愈合是一個錯綜復雜的生物學過程，與應力環境密切相關。應力對骨折愈合的影響主要包括 3 個因素。① 應力方向：骨折愈合初期，軸向應力可促進軟骨基質礦化及 BMSCs 分化、增殖，并形成不同的組織類型，有利于編織骨改建成板層骨[13-14]。臨床研究已經證實軸向應力叩擊治療能明顯加速骨再生，促進骨愈合，具有良好的臨床應用價值[6]。② 應力方式：與連續性應力刺激相比，間歇性應力刺激更能增強成骨細胞活性。喻鑫罡等[15]對綿羊雙側脛骨中段橫行截骨，在單邊外固定支架固定后予低頻微動刺激，結果顯示在骨折愈合早期頻率 1.0 Hz 的微動刺激能有效促進骨組織生長及骨痂礦化。③ 應力大小：應力刺激過大、過小均不利于骨折愈合，只有適宜的應力才能促進成骨作用。本課題組前期研究[9]還發現，術后 1 周給予兔自身體質量 1/2 的軸向叩擊刺激最有利于骨缺損修復，刺激最佳參數組合為每 2 天刺激 1 次，每次 30 min，應力 15 N，頻率 1 Hz，叩擊時間 5 s，間歇時間 3 s，有利于成骨的最終形成及支架材料降解。因此，本次研究中我們選擇了該應力刺激參數組合，結果顯示該種叩擊式應力刺激可以促進骨再生。
本次研究一個重要目的是探索叩擊式應力刺激促進骨再生的機制。既往研究發現，SDF-1α 在機械應力刺激骨折愈合的過程中起重要作用。人體內 SDF-lα/CXCR4 是 BMSCs 動員、遷移、歸巢的關鍵性因素之一。同時，在骨損傷早期各種炎性介質亦能調節 SDF-lα 表達，相關動物實驗發現通過給予間歇性應力刺激，在一定程度上造成細微的二次損傷，可明顯延長骨折區域的炎性反應期[16]，使骨膜表達 SDF-1α 明顯增強，誘導 BMSCs 遷移至骨損傷部位[17]。BMSCs 進入骨缺損區域后，不但可以分泌促進新生骨組織細胞生長因子，還可以間接促進骨組織血管化，對于加速骨愈合形成起著重要作用[18-19]。另外，BMSCs 增殖與分化過程中離不開機械應力刺激[1]。Simmons 等[20]采用周期性機械牽張力刺激 BMSCs，發現實驗組細胞外基質礦化明顯優于對照組。而缺乏機械應力刺激時，BMSCs 向脂肪細胞轉化的能力增強，向成骨細胞轉化的能力受到抑制。
為進一步驗證 SDF-lα/CXCR4 信號通路的作用，我們采用了 AMD3100 阻斷 SDF-lα/CXCR4 信號通路，觀察骨再生是否受影響。本次研究所用的 AMD3100 是人工合成的大環類 CXCR4 的非肽類阻斷劑，可有效地與 CXCR4 結合阻斷 SDF-1α 與 CXCR4 啟動下游信號通路，但不對 CXCR4 產生激動作用。AMD3100 具有阻止 BMSCs 順 SDF-1α 濃度梯度遷移的作用，大劑量 AMD3100 具備動員干細胞作用，而小劑量 AMD3100 動員干細胞能力明顯減弱。有研究發現 SDF-1α 能刺激 VEGF、TGF-β 的表達[21-23]，利用鼠模型研究 VEGF 誘導血管形成，發現新生血管周圍聚集著 BMSCs，同時 SDF-1α 大量表達，當給予 AMD3100 阻斷信號通路后 BMSCs 和新生血管數量明顯減少，提示 VEGF 能夠誘導 BMSCs，且 SDF-1α 能協助 VEGF 促血管形成，兩者具有相互影響、協同分泌作用。本次研究中，相同應力刺激下連續應用小劑量 AMD3100 使骨折愈合時間明顯延長，提示 SDF-lα/CXCR4 信號通路在軸向應力促進骨再生中發揮重要調節作用。另外，本次研究觀察了術后 2、4、8、12 周骨缺損區移植支架吸收與骨愈合情況，分析早期應力刺激狀態下骨愈合與 SDF-lα 的相關性。研究表明，僅有胞膜表達 CXCR4 的 BMSCs 才會順 SDF-lα 濃度差遷移至骨折部位，無 CXCR4 的 BMSCs 則不受誘導[24]。本次研究中，CXCR4 免疫組織化學染色觀察發現，B 組術后染色程度強于 A、C 組，而 C 組僅微量表達。這提示骨愈合早期，應力刺激可能延長炎癥期，骨缺損區組織 SDF-lα 表達得到加強，軸向應力叩擊同時促使 BMSCs 不斷增殖、分化，成骨細胞和軟骨細胞數量劇增，形成放大效應，骨愈合后期骨損傷處逐漸修復，SDF-1α 表達減少，陽性結果表達呈遞減趨勢。同時，Western blot 檢測結果顯示，應力刺激下 SDF-1α 及 CXCR4 在骨愈合早期得到充分表達，隨著骨缺損區的修復，受損組織局部氧張力趨于正常，SDF-1α 表達量逐漸下降，亦接近于正常[25]，此與免疫組織化學染色結果一致。上述結果表明，給予應力刺激下，骨損傷組織 SDF-1α 蛋白表達明顯增多，表達有 CXCR4 受體的 BMSCs 隨之增多，反之也提示若缺少應力刺激可能會影響 BMSCs 增殖及分化進程。
本研究不足包括未闡明應力刺激治療后，骨缺損 SDF-1α 表達上調的具體分泌組織結構、檢測誘導 BMSCs 的 SDF-1α 最佳濃度，未能驗證除此因素是否還受其他生長因子的調控。傳統觀點認為 SDF-1α 僅有唯一受體 CXCR4[26]，但隨著研究深入，發現 CXCR7 為 SDF-1α 新受體[27]。雖然 AMD3100 能夠同時抑制 BMSCs 膜上 CXCR4 及 CXCR7 蛋白的表達[28]，但對 SDF-1α/CXCR7 信號通路在 BMSCs 中的作用機制有待進一步探索。
