引用本文： 孔憲敏, 田姍姍, 陳濤, 黃映輝. 利用微流控技術體外構建三維海馬神經元網絡的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(2): 239-242. doi: 10.7507/1002-1892.201809094 復制
腦的基本功能單位是神經元，神經元包含胞體和突起，突起又包括軸突和樹突。神經突起接受刺激從而產生神經沖動，并將這個沖動傳遞給其他效應細胞，從而完成生物信息傳遞這一調控功能。神經元調控功能包括細胞膜的電信號傳導、突觸信號傳導、跨膜信號傳導和細胞內信使介導的功能。生物體的神經行為機制極為復雜，需要從神經網絡層面去認識相互聯系的神經元功能[1]。然而，目前人在體神經元網絡研究還存在多種困難，所以體外構建神經元網絡進行相關研究提供了一個思路。
微流控技術既往主要作為生物分析方法的補充[1-4]，目前主要集中在細胞培養和為疾病診斷與藥物篩選提供平臺[5-6]。與傳統二維培養不同，微流控芯片是三維培養體系，可以高度模擬生物體內細胞生長環境[7]，進而實現整個器官或者組織功能的構建[8-11]。已有研究采用微流控技術對海馬區神經干細胞進行培養及誘導定向分化[12]。Taylor 等[13]設計了微流控芯片研究細胞刺激特性。微流控技術為構建體外神經元網絡提供了新思路。本研究利用微流控技術，初步探討構建具有生物學功能的體外三維海馬神經元網絡的可行性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生 SD 大鼠6只，雌雄不拘，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，許可證號 SYXK（京）2015-0010。接種培養基、B27 添加劑、胰蛋白酶、FBS（GIBCO 公司，美國）；多聚賴氨酸、MTT、神經元特異性多克隆抗體β-tubulin、DAPI（Sigma 公司，美國）；B27（Invitrogen 公司，美國）。
MEA 電生理信號檢測系統（Multi-Channel Systems，德國）；熒光顯微鏡觀察（Zeiss 公司，德國）；離心機（Eppendorf 公司，德國）；GI80TW 立式高壓蒸汽滅菌鍋（中國科學器材公司）；CO2 培養箱（ESCO 公司，新加坡）。
1.2 圖案化的微流控芯片設計及制備
微流控芯片設計成網絡圖案，由于神經元細胞突起具有可塑性，將神經元接種在微通道中，使細胞突起因物理空間結構束縛力，沿著微通道生長，突起之間相互連接，從而構建體外神經元網絡。芯片尺寸設計為 10 mm×10 mm×5 mm，結構包括進口、出口、培養室。培養室為 10×10 微陣列網絡，其中微通道設計寬度為 100 μm、深度為 40 μm。既可以滿足神經元細胞生長，又滿足 MEA 電生理檢測系統的結構需求。
采用標準濕法腐蝕工藝制備芯片。制備過程：將鍍鉻玻璃用無水乙醇超聲清洗 1 min，再用超純水沖洗，氮氣槍吹干；甩膠機旋涂正膠；曝光前烘；將掩膜板覆蓋在基底上，用光刻機進行曝光；顯影 2 次后進行后烘豎膜；冷卻后放入去鉻液中，待鉻層徹底去除后，利用去離子水沖洗；放入預先配好的刻蝕液中，放置搖床中進行震蕩刻蝕；將刻蝕好的玻璃放入去膠液中進行去膠，待光刻膠完全去除后，去離子水沖干凈，烘干備用。將制備微流控芯片高壓滅菌處理，經多聚賴氨酸處理 30 min 后，置于 37℃、 CO2 培養箱中過夜。用去離子水沖洗、氮氣烘干玻璃蓋片，在顯微鏡下將芯片與合適尺寸的玻璃蓋片對準，放在馬弗爐中加熱控溫，完成芯片鍵合。見圖 1。
圖1
圖案化的微流控芯片
a. 芯片結構示意圖；b. 芯片實物
Figure1. Patterned microfluidic chipsa. The schematic diagram of chip structure; b. Microfluidic chip
1.3 大鼠海馬神經元分離及培養
取新生 SD 大鼠經 75% 乙醇消毒后，脫頸處死。將大腦剝離后置于預冷 PBS 中，暴露并取出丘腦組織，放置于含 10 mL 預冷 H-PBS 的 15 mL 離心管中，預冷 PBS 清洗組織 2 次，吸出 PBS，加入 2～3 mL 0.25% 胰蛋白酶，置于 37℃ 培養箱中 20 min，每 5 分鐘搖晃 1 次；取出消化后的組織，吸去胰蛋白酶，加入預冷 PBS 終止反應；加入 DMEM 進行吹打，收集上清液。
將微流控芯片置于細胞培養皿中，每個 3.5 cm 細胞培養皿中放置 5～6 個芯片。然后，將獲得的原代海馬神經元上清液轉移至細胞培養皿，每個芯片上接種 5 000～6 000 個細胞。置于培養箱中培養，4 h 后吸取未貼壁的細胞及細胞碎片，接種培養基清洗 1 次；24 h 后維持培養基半量換液，以后每隔 2 天換液 1 次。
1.4 觀測指標
1.4.1 免疫熒光染色觀察
培養 3、5、7 d 后，取細胞培養皿行免疫熒光染色觀察。使用 0.01 mol/L PBS 清洗 2 次，4% 多聚甲醛固定 15 min，加入 0.25% Triton-X100 溶液透膜處理，PBS 清洗 2 次，添加一抗β-tubulin（1∶500）室溫孵育 2 h；PBS 洗滌，室溫孵育二抗 1 h；PBS 洗滌，DAPI 染核、封片檢測。
1.4.2 海馬神經元網絡電生理檢測
培養 7 d 后，利用 MEA 電生理信號檢測系統，檢測神經元網絡單通道及多通道的自發放電信號。設置神經元放電采樣率 25 000 Hz，分辨率 9.8 mV，電位采集 5 000 μV。測試前模擬輸出生物信號，保證通道可以正常顯示波形且反應靈敏。信號檢測在細胞培養箱外進行，培養箱溫度設置為 37℃，保證細胞生長良好。
2 結果
2.1 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡下觀察示，隨培養時間延長，海馬神經元數量逐漸增加，且神經元突起亦相應增多、增長，并且均勻規則分布在微流控芯片通道，提示成功構建體外三維海馬神經元網絡。見圖 2。
圖2
各時間點免疫熒光染色觀察（×40）
a. 培養 3 d；b. 培養 5 d；c. 培養 7 d
Figure2. Observation of immunofluorescence staining at each time point (×40)a. At 3 days of culture; b. At 5 days of culture; c. At 7 days of culture
2.2 海馬神經元網絡電生理信號檢測
培養 7 d 可以檢測到海馬神經元網絡的單通道及多通道自發放電信號（圖 3），顯示神經元網絡具有初步的生物學功能，可以觀察到電極傳導模式。
圖3
培養 7 d 海馬神經元網絡電生理信號檢測
a. 單通道神經元自發放電信號；b. 多通道神經元自發放電信號
Figure3. Electrophysiological signal detection of hippocampal neuron network at 7 days after operationa. Single spontaneous firing signals; b. Multi-channel spontaneous firing signals
3 討論
人體大腦由 1011個神經元細胞構成，通過神經元突起相互聯系，形成錯綜復雜且精密的神經元網絡，對于外來的刺激和信號做出反應，從而調節人體的行為反射。大量的神經元及這些細胞形成的神經環路構成了人體的神經系統[14]，神經元網絡是研究腦的物質、能量及信息處理機制最為有效的手段。因此從細胞及神經元網絡層面去了解神經信號傳導的功能及各種行為指令的機制有著重要的意義，同時也有很大難度。
在體研究容易受到外界因素的影響[15-16]，所以體外構建神經元網絡是了解神經系統的關鍵，可以在良好可控環境下對神經元網絡生長狀況及信息處理機制進行實驗分析。而體外構建模型模擬生物體內腦神經活動的首要基礎條件就是制造出合適的細胞培養材料，讓腦神經元在類似體內條件下生長。然而，常規的細胞體外培養材料大多為微米級別，神經元細胞的生長形態受限，神經元之間能夠形成的突觸連接也較少，無法準確模擬大腦真實發育情況。與傳統細胞培養技術相比，微流控技術可高度模擬細胞生存小環境，完成細胞體外培養，反映細胞生物學特性，尤其體外神經元細胞的培養方面，可提供良好的細胞生長平臺。
本研究利用微納尺寸的微流控芯片在體外培養海馬神經元，免疫熒光染色觀察顯示隨培養時間延長，海馬神經元數量逐漸增加，且神經元突起亦相應增多、增長，并且均勻規則分布在微流控芯片通道，提示成功構建體外三維海馬神經元網絡，為體外模擬體內微環境，建立神經系統疾病模型或海馬關鍵腦區的微流控平臺奠定了基礎。培養 7 d 后，利用 MEA 電生理信號檢測系統檢測到海馬神經元網絡單通道自發放電信號，證明神經元網絡具有初步的生物學功能；同時也探測到多通道自發放電信號，可以看出電極傳導模式，說明神經元網絡功能是高度協同的電生理活動，神經元網絡中的神經元突起已經建立了密切聯系，為進一步深入了解神經元網絡生物學功能奠定了基礎。
綜上述，本研究構建的海馬神經元網絡具備神經元突起可塑的基本生物功能，這將有利于重塑突起及開展不同腦區神經元突起間信息傳導的研究，同時也有助于探討藥物等外界環境對突起功能及可塑性的影響。體外海馬神經元生長存活時間越長，越有助于研究觀測成熟的神經元網絡電生理信號傳遞及相應的生物學功能，所以我們接下來需要進一步改進芯片材料及圖案的設計，以更利于海馬神經元的培養與生長。另外，利用聚二甲基硅氧烷或瓊脂等生物材料進行細胞培養；借助激光深加工平臺對芯片中的微通道進行激光加工，設置不同規格和參數，觀察細胞的生長情況；或者在培養過程中配以不同濃度的生長因子來促進細胞生長存活，從而為微流控平臺的搭建，繼而為深入研究海馬神經元損傷修復以及神經元網絡的信息傳遞功能奠定基礎。
腦的基本功能單位是神經元，神經元包含胞體和突起，突起又包括軸突和樹突。神經突起接受刺激從而產生神經沖動，并將這個沖動傳遞給其他效應細胞，從而完成生物信息傳遞這一調控功能。神經元調控功能包括細胞膜的電信號傳導、突觸信號傳導、跨膜信號傳導和細胞內信使介導的功能。生物體的神經行為機制極為復雜，需要從神經網絡層面去認識相互聯系的神經元功能[1]。然而，目前人在體神經元網絡研究還存在多種困難，所以體外構建神經元網絡進行相關研究提供了一個思路。
微流控技術既往主要作為生物分析方法的補充[1-4]，目前主要集中在細胞培養和為疾病診斷與藥物篩選提供平臺[5-6]。與傳統二維培養不同，微流控芯片是三維培養體系，可以高度模擬生物體內細胞生長環境[7]，進而實現整個器官或者組織功能的構建[8-11]。已有研究采用微流控技術對海馬區神經干細胞進行培養及誘導定向分化[12]。Taylor 等[13]設計了微流控芯片研究細胞刺激特性。微流控技術為構建體外神經元網絡提供了新思路。本研究利用微流控技術，初步探討構建具有生物學功能的體外三維海馬神經元網絡的可行性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生 SD 大鼠6只，雌雄不拘，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供，許可證號 SYXK（京）2015-0010。接種培養基、B27 添加劑、胰蛋白酶、FBS（GIBCO 公司，美國）；多聚賴氨酸、MTT、神經元特異性多克隆抗體β-tubulin、DAPI（Sigma 公司，美國）；B27（Invitrogen 公司，美國）。
MEA 電生理信號檢測系統（Multi-Channel Systems，德國）；熒光顯微鏡觀察（Zeiss 公司，德國）；離心機（Eppendorf 公司，德國）；GI80TW 立式高壓蒸汽滅菌鍋（中國科學器材公司）；CO2 培養箱（ESCO 公司，新加坡）。
1.2 圖案化的微流控芯片設計及制備
微流控芯片設計成網絡圖案，由于神經元細胞突起具有可塑性，將神經元接種在微通道中，使細胞突起因物理空間結構束縛力，沿著微通道生長，突起之間相互連接，從而構建體外神經元網絡。芯片尺寸設計為 10 mm×10 mm×5 mm，結構包括進口、出口、培養室。培養室為 10×10 微陣列網絡，其中微通道設計寬度為 100 μm、深度為 40 μm。既可以滿足神經元細胞生長，又滿足 MEA 電生理檢測系統的結構需求。
采用標準濕法腐蝕工藝制備芯片。制備過程：將鍍鉻玻璃用無水乙醇超聲清洗 1 min，再用超純水沖洗，氮氣槍吹干；甩膠機旋涂正膠；曝光前烘；將掩膜板覆蓋在基底上，用光刻機進行曝光；顯影 2 次后進行后烘豎膜；冷卻后放入去鉻液中，待鉻層徹底去除后，利用去離子水沖洗；放入預先配好的刻蝕液中，放置搖床中進行震蕩刻蝕；將刻蝕好的玻璃放入去膠液中進行去膠，待光刻膠完全去除后，去離子水沖干凈，烘干備用。將制備微流控芯片高壓滅菌處理，經多聚賴氨酸處理 30 min 后，置于 37℃、 CO2 培養箱中過夜。用去離子水沖洗、氮氣烘干玻璃蓋片，在顯微鏡下將芯片與合適尺寸的玻璃蓋片對準，放在馬弗爐中加熱控溫，完成芯片鍵合。見圖 1。
圖1
圖案化的微流控芯片
a. 芯片結構示意圖；b. 芯片實物
Figure1. Patterned microfluidic chipsa. The schematic diagram of chip structure; b. Microfluidic chip
1.3 大鼠海馬神經元分離及培養
取新生 SD 大鼠經 75% 乙醇消毒后，脫頸處死。將大腦剝離后置于預冷 PBS 中，暴露并取出丘腦組織，放置于含 10 mL 預冷 H-PBS 的 15 mL 離心管中，預冷 PBS 清洗組織 2 次，吸出 PBS，加入 2～3 mL 0.25% 胰蛋白酶，置于 37℃ 培養箱中 20 min，每 5 分鐘搖晃 1 次；取出消化后的組織，吸去胰蛋白酶，加入預冷 PBS 終止反應；加入 DMEM 進行吹打，收集上清液。
將微流控芯片置于細胞培養皿中，每個 3.5 cm 細胞培養皿中放置 5～6 個芯片。然后，將獲得的原代海馬神經元上清液轉移至細胞培養皿，每個芯片上接種 5 000～6 000 個細胞。置于培養箱中培養，4 h 后吸取未貼壁的細胞及細胞碎片，接種培養基清洗 1 次；24 h 后維持培養基半量換液，以后每隔 2 天換液 1 次。
1.4 觀測指標
1.4.1 免疫熒光染色觀察
培養 3、5、7 d 后，取細胞培養皿行免疫熒光染色觀察。使用 0.01 mol/L PBS 清洗 2 次，4% 多聚甲醛固定 15 min，加入 0.25% Triton-X100 溶液透膜處理，PBS 清洗 2 次，添加一抗β-tubulin（1∶500）室溫孵育 2 h；PBS 洗滌，室溫孵育二抗 1 h；PBS 洗滌，DAPI 染核、封片檢測。
1.4.2 海馬神經元網絡電生理檢測
培養 7 d 后，利用 MEA 電生理信號檢測系統，檢測神經元網絡單通道及多通道的自發放電信號。設置神經元放電采樣率 25 000 Hz，分辨率 9.8 mV，電位采集 5 000 μV。測試前模擬輸出生物信號，保證通道可以正常顯示波形且反應靈敏。信號檢測在細胞培養箱外進行，培養箱溫度設置為 37℃，保證細胞生長良好。
2 結果
2.1 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡下觀察示，隨培養時間延長，海馬神經元數量逐漸增加，且神經元突起亦相應增多、增長，并且均勻規則分布在微流控芯片通道，提示成功構建體外三維海馬神經元網絡。見圖 2。
圖2
各時間點免疫熒光染色觀察（×40）
a. 培養 3 d；b. 培養 5 d；c. 培養 7 d
Figure2. Observation of immunofluorescence staining at each time point (×40)a. At 3 days of culture; b. At 5 days of culture; c. At 7 days of culture
2.2 海馬神經元網絡電生理信號檢測
培養 7 d 可以檢測到海馬神經元網絡的單通道及多通道自發放電信號（圖 3），顯示神經元網絡具有初步的生物學功能，可以觀察到電極傳導模式。
圖3
培養 7 d 海馬神經元網絡電生理信號檢測
a. 單通道神經元自發放電信號；b. 多通道神經元自發放電信號
Figure3. Electrophysiological signal detection of hippocampal neuron network at 7 days after operationa. Single spontaneous firing signals; b. Multi-channel spontaneous firing signals
3 討論
人體大腦由 1011個神經元細胞構成，通過神經元突起相互聯系，形成錯綜復雜且精密的神經元網絡，對于外來的刺激和信號做出反應，從而調節人體的行為反射。大量的神經元及這些細胞形成的神經環路構成了人體的神經系統[14]，神經元網絡是研究腦的物質、能量及信息處理機制最為有效的手段。因此從細胞及神經元網絡層面去了解神經信號傳導的功能及各種行為指令的機制有著重要的意義，同時也有很大難度。
在體研究容易受到外界因素的影響[15-16]，所以體外構建神經元網絡是了解神經系統的關鍵，可以在良好可控環境下對神經元網絡生長狀況及信息處理機制進行實驗分析。而體外構建模型模擬生物體內腦神經活動的首要基礎條件就是制造出合適的細胞培養材料，讓腦神經元在類似體內條件下生長。然而，常規的細胞體外培養材料大多為微米級別，神經元細胞的生長形態受限，神經元之間能夠形成的突觸連接也較少，無法準確模擬大腦真實發育情況。與傳統細胞培養技術相比，微流控技術可高度模擬細胞生存小環境，完成細胞體外培養，反映細胞生物學特性，尤其體外神經元細胞的培養方面，可提供良好的細胞生長平臺。
本研究利用微納尺寸的微流控芯片在體外培養海馬神經元，免疫熒光染色觀察顯示隨培養時間延長，海馬神經元數量逐漸增加，且神經元突起亦相應增多、增長，并且均勻規則分布在微流控芯片通道，提示成功構建體外三維海馬神經元網絡，為體外模擬體內微環境，建立神經系統疾病模型或海馬關鍵腦區的微流控平臺奠定了基礎。培養 7 d 后，利用 MEA 電生理信號檢測系統檢測到海馬神經元網絡單通道自發放電信號，證明神經元網絡具有初步的生物學功能；同時也探測到多通道自發放電信號，可以看出電極傳導模式，說明神經元網絡功能是高度協同的電生理活動，神經元網絡中的神經元突起已經建立了密切聯系，為進一步深入了解神經元網絡生物學功能奠定了基礎。
綜上述，本研究構建的海馬神經元網絡具備神經元突起可塑的基本生物功能，這將有利于重塑突起及開展不同腦區神經元突起間信息傳導的研究，同時也有助于探討藥物等外界環境對突起功能及可塑性的影響。體外海馬神經元生長存活時間越長，越有助于研究觀測成熟的神經元網絡電生理信號傳遞及相應的生物學功能，所以我們接下來需要進一步改進芯片材料及圖案的設計，以更利于海馬神經元的培養與生長。另外，利用聚二甲基硅氧烷或瓊脂等生物材料進行細胞培養；借助激光深加工平臺對芯片中的微通道進行激光加工，設置不同規格和參數，觀察細胞的生長情況；或者在培養過程中配以不同濃度的生長因子來促進細胞生長存活，從而為微流控平臺的搭建，繼而為深入研究海馬神經元損傷修復以及神經元網絡的信息傳遞功能奠定基礎。
