引用本文： 楊成偉, 楊新樂, 藍旭, 張洪, 王明, 張亞強, 徐雅潔, 甄平. 綿羊脊柱不同節段硬脊膜的結構及力學特點. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(2): 232-238. doi: 10.7507/1002-1892.201807085 復制
硬脊膜起源于中胚層，由原始腦膜發育而來，是一種富含膠原的致密結締組織膜，包繞整個脊髓，作為脊髓被膜中最堅韌的結構，硬脊膜維持著腦脊液的流動和壓力并減少外界應力對脊髓的影響[1-3]。嚴重外傷或手術操作都可能造成硬脊膜損傷，如果不能進行有效修復，則可能導致腦脊液漏、中樞神經系統感染、癲癇等嚴重并發癥[4-6]。對硬脊膜進行有效修補或者開發人工硬脊膜修復材料，都需要對硬脊膜的結構和力學特性進行深入研究。
目前已有許多研究對硬脊膜的結構進行了仔細觀察，并對其生物力學特征進行了測定[7-15]。通過對人和牛的硬脊膜標本進行單軸拉伸力學測試發現，硬脊膜在縱軸方向的強度明顯大于橫軸[7-9]。大鼠脊髓標本也得到相似結論[10]。以上研究通過組織學觀察發現膠原纖維的結構特征與各向異性的力學特點相吻合。但最近有關硬脊膜彈性和黏彈性行為的研究卻發現，硬脊膜橫軸的拉伸力學強度大于縱軸[11-13]。此外，一些組織學研究也指出，硬脊膜的膠原纖維并不是完全沿縱軸方向排列，也有相當數量的膠原纖維沿橫軸排列[14-15]。因此，目前對于硬脊膜的生物力學特性和超微結構的關系還存在廣泛爭議，對人工硬脊膜的研發造成了巨大阻礙。
我們對以上存在爭議的研究仔細分析后發現，標本差異可能是造成結果爭議的主要原因。選取頸段硬脊膜標本進行分析的研究發現橫軸拉伸力學強度大于縱軸，而選取腰段硬脊膜標本進行分析的研究卻得到相反結果。本研究選取綿羊頸、胸、腰段硬脊膜標本進行組織學觀察和生物力學測試，旨在明確不同節段硬脊膜的組織結構和力學特征，為人工硬脊膜的研發提供理論依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要儀器
成年 1 歲齡雄性白綿羊 5 只，體質量 23～25 kg，由解放軍聯勤保障部隊第 940 醫院動物實驗中心提供。所有動物實驗均經解放軍聯勤保障部隊第 940 醫院實驗動物倫理委員會批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2015-0001。
動物手術臺（上海醫療器械廠）；骨科手術器械（江蘇創生醫療器械有限公司）；冷凍切片機（北京盛科信德科技有限公司）；光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；SIGMA 500/VP 掃面電鏡、LIBRA 120 透射電鏡、KS400 圖像分析軟件（Carl Zeiss 公司，德國）；AG-IS/10KN 力學試驗機（Shimadzu 公司，日本）。
1.2 標本制備
取 5 只成年雄性白綿羊，臀部肌肉注射過量鹽酸塞拉嗪注射液（0.015 mL/kg）處死后固定于動物手術臺，剔除頸胸腰背部羊毛。分別選取 C5～7、T10～12 及 L3～5 椎體平面，縱行切開皮膚及皮下組織，剔除棘突及椎板表面附著的肌肉，切除同平面棘突及椎板暴露椎管。清除椎管內脂肪，暴露硬脊膜背側。切斷神經根，將脊髓及其被膜整段剪下，分離硬脊膜制備測試標本。其中 C5、T10 和 L3 平面的硬脊膜剪成 15 mm×15 mm 正方形標本，而后剪成對稱的 2 份，分別行組織學和電鏡觀察。C6、C7、T11、T12、L4、L5 平面的硬脊膜沿著縱軸方向和橫軸方向分別制備長 20 mm、寬 5 mm 的矩形標本，進行單軸生物力學測試。
1.3 觀測指標
1.3.1 組織學觀察
將硬脊膜標本經 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片（片厚 3～5 μm），70℃ 下烤片 30 min；再用甲苯脫蠟 2 次，每次 5 min；然后用 100%、95%、85%、70% 乙醇梯度脫水，各 2 min；蒸餾水沖洗 1 min，然后蘇木精染色 10 min；蒸餾水沖洗 3 min，75% 鹽酸乙醇分色 2 s 后，蒸餾水沖洗 10 min 返藍，酸化伊紅染液染色 12 s；蒸餾水沖洗 1 min，70%、85%、95%、100% 乙醇梯度脫水，各 2 min；二甲苯透明 3 次，每次 2 min，中性樹膠封片；光鏡下觀察硬脊膜橫斷面并對其厚度進行測量：分別在顯微鏡目鏡和載物臺上安置目鏡測微尺（5 mm/50 格）和物鏡測微尺（1 mm/100 格），在低倍鏡下確認目鏡測微尺的每一格長度［目尺每格長度（mm）=物尺的格數/目尺的格數×10 μm］，拿開物鏡測微尺，放上組織標本片，測量標本厚度。每個部位硬脊膜平行測量 5 個標本。
1.3.2 硬脊膜內、外表面形態掃描電鏡觀察
將硬脊膜標本經 4% 多聚甲醛 4℃ 固定過夜，然后使用 PBS 液洗滌 3 次，1% 鋨酸溶液避光固定 1 h，PBS 液洗滌 3 次；用 25%、50%、75%、85%、95%、100% 乙醇梯度脫水，各 15 min，使用乙腈置換法干燥處理后，固定于電鏡專用托上，噴金處理后掃描電鏡觀察硬脊膜的內表面和外表面，加速電壓 20 kV。
1.3.3 硬脊膜內部結構透射電鏡觀察
將硬脊膜標本脫水干燥后，包埋于環氧樹脂中，冷卻后使用超薄切片機對硬脊膜進行切片，獲得硬脊膜橫斷面超薄切片，片厚約 80 nm，透射電鏡觀察，工作電壓為 80 kV。通過 KS400 圖像分析軟件測量各部位硬脊膜膠原纖維直徑。
1.3.4 單軸生物力學測試
將制備的硬脊膜矩形標本放入生理鹽水中，并在取材后立刻進行生物力學測試，該測試在恒溫（25℃）、恒濕（85%）環境中進行。將剪裁好的樣品固定于 AG-IS/10KN 力學試驗機上，根據郭興鋒等[16]描述的單軸拉伸力學測試方法進行測試，拉伸速度 0.016 mm/s，當硬脊膜標本斷裂時即表示測試結束。繪制硬脊膜標本的拉力-應變曲線，計算測試標本的斷裂強度、彈性模量和斷裂伸長率。頸、胸、腰每個平面各取 1 個硬脊膜標本，為避免個體間差異，對同一個體相鄰平面硬脊膜進行隨機軸向-橫向比較。頸、胸、腰段硬脊膜分別取 5 組標本進行力學測試。為比較硬脊膜在頸、胸、腰段的各向異性特點，采用軸向彈性模量與橫向彈性模量比值進行描述。該比值越趨近于 1，則說明標本的力學特性更趨近于各向同性；該比值越大，則說明標本的各向異性生物力學特點越明顯。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 組織學觀察
HE 染色示，硬脊膜主要由板層狀交織排列的膠原纖維、彈性纖維以及散在分布的成纖維細胞構成；膠原纖維及彈性纖維并非完全拉伸，而是略有皺褶，呈波浪狀；細胞分布于膠原纖維之間。硬脊膜結構并非均質，而是中間纖維排列略疏松，而內外側纖維排列更致密。這種結構上的非均質性在頸段硬脊膜表現更明顯，胸段和腰段硬脊膜內部結構差異不明顯。見圖 1。頸、胸、腰段硬脊膜厚度分別為（268.19±15.91）、（198.16±27.25）、（103.74±21.54）μm，差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖1
頸、胸、腰段硬脊膜 HE 染色觀察（×200）
a. 頸段；b. 胸段；c. 腰段
Figure1. HE staining of cervical, thoracic, and lumbar dura mater (×200)a. Cervical segment; b. Thoracic segment; c. Lumbar segment
2.2 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，硬脊膜內外表面均可見規律分布有序排列的條狀隆起，且走向幾乎一致，均沿脊髓縱軸方向排列。這些條狀隆起均為硬脊膜表面覆蓋的成纖維細胞，細胞呈拉伸狀態，拉伸方向與縱軸方向一致。同時硬脊膜內外表面并不完全一樣，與腦脊液接觸的硬脊膜內表面細胞覆蓋較少，也更為平坦，可以看見散雜裸露的膠原纖維；而硬脊膜外表面則由大量成纖維細胞嚴密覆蓋，形成了沿脊髓縱軸排列的溝壑狀隆起，未見裸露的膠原纖維。硬脊膜內、外表面特點在頸、胸、腰段均表現類似，沒有明顯差異。見圖 2。
圖2
硬脊膜內、外表面掃描電鏡觀察
從左至右分別為放大 400、3 000 倍 a. 內表面；b. 外表面
Figure2. Scanning electron microscopy observation of the inner and outer surface of dura materFrom left to right for the magnification of 400 and 3 000 times respectively a. Inner surface; b. Outer surface
2.3 透射電鏡觀察
透射電鏡觀察示，硬脊膜內部是由不同方向的膠原纖維以層狀排列；同一層內，膠原纖維走向幾乎一致，規律分布，具有明顯的取向性；其中縱向排列的膠原纖維板層厚度明顯大于橫向板層，說明縱向排列的膠原纖維占優，膠原纖維層與層之間并非完全獨立，分界并不明顯，橫向排列的膠原纖維板層插入縱向板層之中，見圖 3。這種層狀結構在頸、胸、腰段硬脊膜中均可見，無明顯差異。測量顯示，頸、胸、腰段硬脊膜膠原纖維直徑分別為（68.04±21.00）、（64.54±20.64）、（60.36±19.65）nm，差異無統計學意義（P>0.05）。
圖3
硬脊膜橫截面透射電鏡觀察
圓形或橢圓形點狀表示軸向排列膠原纖維，長條形表示橫向排列膠原纖維 a. ×5 000；b. ×50 k
Figure3. The transverse section of dura mater observed by transmission electron microscopyThe round and oval dots were aligned collagen fibers along the axial direction, the long bars were collagen fibers along the transverse direction a. ×5 000; b. ×50 k
2.4 單軸生物力學測試
組內比較：頸段硬脊膜軸向和橫向的彈性模量、斷裂強度、斷裂伸長率比較差異均無統計學意義（P>0.05）；胸段和腰段軸向各指標均顯著大于橫向，差異有統計學意義（P<0.05）。組間比較：頸、胸、腰段硬脊膜的軸向和橫向彈性模量、斷裂強度、斷裂伸長率，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），呈頸、胸、腰段逐漸減小趨勢。軸向彈性模量/橫向彈性模量比值顯示，腰段比值最大，胸段次之，頸段比值最趨近于 1；頸、胸段比值顯著小于腰段，差異有統計學意義（P<0.05）；頸、胸段間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4、表 1。
表1
頸、胸、腰段硬脊膜軸向及橫向力學性能比較（n=5，
）
Table1.
Mechanical properties along the axial and transverse direction of cervical，thoracic, and lumbar spinal dura mater (n=5, 
)
圖4
頸、胸、腰段硬脊膜拉力-應變曲線
a. 頸段；b. 胸段；c. 腰段
Figure4. Tension-strain curves of cervical, thoracic, and lumbar dura matera. Cervical segment; b. Thoracic segment; c. Lumbar segment
3 討論
硬脊膜損傷是脊柱手術或脊柱骨折的嚴重并發癥，若不及時有效處理，將極大影響患者康復。因此，越來越多學者在尋找良好的硬脊膜替代物方面作了大量研究[16-22]。生物性硬脊膜替代物由于存在免疫排斥、倫理及傳播疾病等問題，且物理特性及強度無法達到天然硬脊膜的要求，重建后易形成瘢痕造成椎管狹窄或壓迫神經，臨床應用受限[23-28]。人工硬脊膜多由人工材料合成，無傳播疾病風險及倫理問題，通過尋找低抗原性的材料，避免了免疫排斥反應，且成本低、易獲得，是近年研究熱點。但目前對天然硬脊膜的超微結構和力學特性尚不明確，現有文獻報道甚至存在相互矛盾[7-9, 11-13]，故明確硬脊膜的結構和力學特點對于人工硬脊膜的研發具有重要意義。
目前已有不少學者對硬脊膜的結構進行了研究[7-15, 29]。雖然有的研究采用人體標本[14-15, 29]，有的研究采用牛、豬、綿羊等[11-13]作為研究對象，但觀察到的硬脊膜結構相似。本研究以綿羊硬脊膜作為研究對象，通過 HE 染色發現硬脊膜主要由板層狀交織排列的膠原纖維、彈性纖維以及散在分布的成纖維細胞構成，纖維并非完全拉伸，而是呈波浪狀。膠原纖維主要為硬脊膜提供力學強度，而彈性纖維主要提供彈性和柔韌性。這與 Fink 等[14]以及 Vandenabeele 等[29]對人硬脊膜研究結果一致。此外，掃描電鏡觀察示成纖維細胞覆蓋于膠原纖維表面，形成了沿脊髓縱軸方向規律排列的溝壑狀隆起。與腦脊液接觸的腹側溝壑淺且平坦，可見散在分布的膠原纖維和彈性纖維；而背側細胞大量聚集，有明顯的溝壑，細胞沿軸向拉伸并有序排列。這一特點在頸、胸、腰段表現相似。細胞在膠原纖維表面的黏附生長、形態變化，與膠原纖維的排列密切相關。已有研究證實，在無規則的納米纖維表面，細胞隨機伸展，無明顯極性；而在取向納米纖維表面，細胞沿著纖維排列的方向拉伸并有序排列，具有明顯極性[30]。從硬脊膜內外側細胞排列的情況可以判斷，硬脊膜表面大部分膠原纖維沿縱軸方向有序排列。透射電鏡觀察發現，硬脊膜內部是由不同方向的膠原纖維板層狀排列而成，層內膠原纖維走向高度一致，具有明顯的取向性。與 Reina 等[15]以及 Vandenabeele 等[29]研究結果相吻合。
Wilcox 等[11]、Mazgajczyk 等[12]、Snehal 等[13]研究發現，硬脊膜橫向力學強度大于軸向。這些研究都選用頸段硬脊膜作為研究對象，而且越靠近上頸段，橫向拉伸力學強度越大；越靠近胸段，則軸向拉伸力學強度越大[12-13]。這表明不同節段硬脊膜的拉伸力學行為存在很大差異，不能通過某一局部的硬脊膜拉伸力學行為推測整個硬脊膜。本研究通過對綿羊 C6、C7 節段硬脊膜進行拉伸力學測試后發現，其軸向與橫向的力學強度差異無統計學意義。另有研究發現，硬脊膜軸向力學強度明顯大于橫向，硬脊膜內部膠原纖維以軸向為主[7-10]。分析相關文獻后我們發現，這些研究均是以腰段硬脊膜作為研究對象，再次印證了不同節段硬脊膜的結構和力學特點存在差異。本研究通過對綿羊 T11、T12、L4、L5 節段硬脊膜進行拉伸力學測試，同樣發現硬脊膜軸向力學強度明顯大于橫向，與上述研究結果相似。雖然不同節段硬脊膜拉伸力學特點有差異，但是卻有明顯的規律性：從頭側到尾側，硬脊膜軸向彈性模量/橫向彈性模量比值逐漸增加，說明越靠近尾側硬脊膜各向異性特點更為明顯。由于生物材料拉伸力學行為主要是由其內部結構決定，而膠原纖維是硬脊膜內最主要的力學強度提供因素，因此可以推斷，越靠近尾側，硬脊膜內軸向排列的膠原纖維比例越高，而越靠近頭側，橫向排列的膠原纖維比例越高。同時，從頸段到腰段，硬脊膜的力學強度逐漸減小。由于不同節段硬脊膜厚度也存在差異，頸段最厚，胸段次之，腰段最薄，可以部分解釋力學強度的差異。由于同一個體硬脊膜內膠原纖維粗細相似，因此可以推測頸段硬脊膜內膠原纖維排列可能更為緊密，而腰段硬脊膜內的膠原纖維排列可能更為疏松。但由于頸段硬脊膜斷裂強度和彈性模量不超過腰段的 2 倍，故不同節段膠原纖維排列的疏密程度差異可能并不會很大。
近年來，關于人硬脊膜結構和功能研究已有較多報道[7, 9, 14-15]。本實驗選擇綿羊作為動物模型，是因為綿羊脊柱和人體脊柱相似性較高，綿羊易獲得且性格溫和，是人體脊柱研究的良好動物模型[31-32]。但綿羊硬脊膜與人硬脊膜又存在差異，因此本文的研究數據尚不能直接用于指導人工硬脊膜的制備，但可以作為參考。
綜上述，本研究對綿羊不同節段硬脊膜的超微結構進行觀察并經生物力學測試，發現不同節段硬脊膜結構特征存在差異，且從頸段到腰段有一定的變化趨勢；在制備人工硬脊膜的過程中，不能用單一節段的結構和力學特征數據來模擬整個硬脊膜。本研究從整體上對硬脊膜的結構和生物力學特性進行了描述，為以后設計制備更加仿生的人工硬脊膜提供了參考。
硬脊膜起源于中胚層，由原始腦膜發育而來，是一種富含膠原的致密結締組織膜，包繞整個脊髓，作為脊髓被膜中最堅韌的結構，硬脊膜維持著腦脊液的流動和壓力并減少外界應力對脊髓的影響[1-3]。嚴重外傷或手術操作都可能造成硬脊膜損傷，如果不能進行有效修復，則可能導致腦脊液漏、中樞神經系統感染、癲癇等嚴重并發癥[4-6]。對硬脊膜進行有效修補或者開發人工硬脊膜修復材料，都需要對硬脊膜的結構和力學特性進行深入研究。
目前已有許多研究對硬脊膜的結構進行了仔細觀察，并對其生物力學特征進行了測定[7-15]。通過對人和牛的硬脊膜標本進行單軸拉伸力學測試發現，硬脊膜在縱軸方向的強度明顯大于橫軸[7-9]。大鼠脊髓標本也得到相似結論[10]。以上研究通過組織學觀察發現膠原纖維的結構特征與各向異性的力學特點相吻合。但最近有關硬脊膜彈性和黏彈性行為的研究卻發現，硬脊膜橫軸的拉伸力學強度大于縱軸[11-13]。此外，一些組織學研究也指出，硬脊膜的膠原纖維并不是完全沿縱軸方向排列，也有相當數量的膠原纖維沿橫軸排列[14-15]。因此，目前對于硬脊膜的生物力學特性和超微結構的關系還存在廣泛爭議，對人工硬脊膜的研發造成了巨大阻礙。
我們對以上存在爭議的研究仔細分析后發現，標本差異可能是造成結果爭議的主要原因。選取頸段硬脊膜標本進行分析的研究發現橫軸拉伸力學強度大于縱軸，而選取腰段硬脊膜標本進行分析的研究卻得到相反結果。本研究選取綿羊頸、胸、腰段硬脊膜標本進行組織學觀察和生物力學測試，旨在明確不同節段硬脊膜的組織結構和力學特征，為人工硬脊膜的研發提供理論依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要儀器
成年 1 歲齡雄性白綿羊 5 只，體質量 23～25 kg，由解放軍聯勤保障部隊第 940 醫院動物實驗中心提供。所有動物實驗均經解放軍聯勤保障部隊第 940 醫院實驗動物倫理委員會批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2015-0001。
動物手術臺（上海醫療器械廠）；骨科手術器械（江蘇創生醫療器械有限公司）；冷凍切片機（北京盛科信德科技有限公司）；光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；SIGMA 500/VP 掃面電鏡、LIBRA 120 透射電鏡、KS400 圖像分析軟件（Carl Zeiss 公司，德國）；AG-IS/10KN 力學試驗機（Shimadzu 公司，日本）。
1.2 標本制備
取 5 只成年雄性白綿羊，臀部肌肉注射過量鹽酸塞拉嗪注射液（0.015 mL/kg）處死后固定于動物手術臺，剔除頸胸腰背部羊毛。分別選取 C5～7、T10～12 及 L3～5 椎體平面，縱行切開皮膚及皮下組織，剔除棘突及椎板表面附著的肌肉，切除同平面棘突及椎板暴露椎管。清除椎管內脂肪，暴露硬脊膜背側。切斷神經根，將脊髓及其被膜整段剪下，分離硬脊膜制備測試標本。其中 C5、T10 和 L3 平面的硬脊膜剪成 15 mm×15 mm 正方形標本，而后剪成對稱的 2 份，分別行組織學和電鏡觀察。C6、C7、T11、T12、L4、L5 平面的硬脊膜沿著縱軸方向和橫軸方向分別制備長 20 mm、寬 5 mm 的矩形標本，進行單軸生物力學測試。
1.3 觀測指標
1.3.1 組織學觀察
將硬脊膜標本經 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片（片厚 3～5 μm），70℃ 下烤片 30 min；再用甲苯脫蠟 2 次，每次 5 min；然后用 100%、95%、85%、70% 乙醇梯度脫水，各 2 min；蒸餾水沖洗 1 min，然后蘇木精染色 10 min；蒸餾水沖洗 3 min，75% 鹽酸乙醇分色 2 s 后，蒸餾水沖洗 10 min 返藍，酸化伊紅染液染色 12 s；蒸餾水沖洗 1 min，70%、85%、95%、100% 乙醇梯度脫水，各 2 min；二甲苯透明 3 次，每次 2 min，中性樹膠封片；光鏡下觀察硬脊膜橫斷面并對其厚度進行測量：分別在顯微鏡目鏡和載物臺上安置目鏡測微尺（5 mm/50 格）和物鏡測微尺（1 mm/100 格），在低倍鏡下確認目鏡測微尺的每一格長度［目尺每格長度（mm）=物尺的格數/目尺的格數×10 μm］，拿開物鏡測微尺，放上組織標本片，測量標本厚度。每個部位硬脊膜平行測量 5 個標本。
1.3.2 硬脊膜內、外表面形態掃描電鏡觀察
將硬脊膜標本經 4% 多聚甲醛 4℃ 固定過夜，然后使用 PBS 液洗滌 3 次，1% 鋨酸溶液避光固定 1 h，PBS 液洗滌 3 次；用 25%、50%、75%、85%、95%、100% 乙醇梯度脫水，各 15 min，使用乙腈置換法干燥處理后，固定于電鏡專用托上，噴金處理后掃描電鏡觀察硬脊膜的內表面和外表面，加速電壓 20 kV。
1.3.3 硬脊膜內部結構透射電鏡觀察
將硬脊膜標本脫水干燥后，包埋于環氧樹脂中，冷卻后使用超薄切片機對硬脊膜進行切片，獲得硬脊膜橫斷面超薄切片，片厚約 80 nm，透射電鏡觀察，工作電壓為 80 kV。通過 KS400 圖像分析軟件測量各部位硬脊膜膠原纖維直徑。
1.3.4 單軸生物力學測試
將制備的硬脊膜矩形標本放入生理鹽水中，并在取材后立刻進行生物力學測試，該測試在恒溫（25℃）、恒濕（85%）環境中進行。將剪裁好的樣品固定于 AG-IS/10KN 力學試驗機上，根據郭興鋒等[16]描述的單軸拉伸力學測試方法進行測試，拉伸速度 0.016 mm/s，當硬脊膜標本斷裂時即表示測試結束。繪制硬脊膜標本的拉力-應變曲線，計算測試標本的斷裂強度、彈性模量和斷裂伸長率。頸、胸、腰每個平面各取 1 個硬脊膜標本，為避免個體間差異，對同一個體相鄰平面硬脊膜進行隨機軸向-橫向比較。頸、胸、腰段硬脊膜分別取 5 組標本進行力學測試。為比較硬脊膜在頸、胸、腰段的各向異性特點，采用軸向彈性模量與橫向彈性模量比值進行描述。該比值越趨近于 1，則說明標本的力學特性更趨近于各向同性；該比值越大，則說明標本的各向異性生物力學特點越明顯。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 組織學觀察
HE 染色示，硬脊膜主要由板層狀交織排列的膠原纖維、彈性纖維以及散在分布的成纖維細胞構成；膠原纖維及彈性纖維并非完全拉伸，而是略有皺褶，呈波浪狀；細胞分布于膠原纖維之間。硬脊膜結構并非均質，而是中間纖維排列略疏松，而內外側纖維排列更致密。這種結構上的非均質性在頸段硬脊膜表現更明顯，胸段和腰段硬脊膜內部結構差異不明顯。見圖 1。頸、胸、腰段硬脊膜厚度分別為（268.19±15.91）、（198.16±27.25）、（103.74±21.54）μm，差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖1
頸、胸、腰段硬脊膜 HE 染色觀察（×200）
a. 頸段；b. 胸段；c. 腰段
Figure1. HE staining of cervical, thoracic, and lumbar dura mater (×200)a. Cervical segment; b. Thoracic segment; c. Lumbar segment
2.2 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，硬脊膜內外表面均可見規律分布有序排列的條狀隆起，且走向幾乎一致，均沿脊髓縱軸方向排列。這些條狀隆起均為硬脊膜表面覆蓋的成纖維細胞，細胞呈拉伸狀態，拉伸方向與縱軸方向一致。同時硬脊膜內外表面并不完全一樣，與腦脊液接觸的硬脊膜內表面細胞覆蓋較少，也更為平坦，可以看見散雜裸露的膠原纖維；而硬脊膜外表面則由大量成纖維細胞嚴密覆蓋，形成了沿脊髓縱軸排列的溝壑狀隆起，未見裸露的膠原纖維。硬脊膜內、外表面特點在頸、胸、腰段均表現類似，沒有明顯差異。見圖 2。
圖2
硬脊膜內、外表面掃描電鏡觀察
從左至右分別為放大 400、3 000 倍 a. 內表面；b. 外表面
Figure2. Scanning electron microscopy observation of the inner and outer surface of dura materFrom left to right for the magnification of 400 and 3 000 times respectively a. Inner surface; b. Outer surface
2.3 透射電鏡觀察
透射電鏡觀察示，硬脊膜內部是由不同方向的膠原纖維以層狀排列；同一層內，膠原纖維走向幾乎一致，規律分布，具有明顯的取向性；其中縱向排列的膠原纖維板層厚度明顯大于橫向板層，說明縱向排列的膠原纖維占優，膠原纖維層與層之間并非完全獨立，分界并不明顯，橫向排列的膠原纖維板層插入縱向板層之中，見圖 3。這種層狀結構在頸、胸、腰段硬脊膜中均可見，無明顯差異。測量顯示，頸、胸、腰段硬脊膜膠原纖維直徑分別為（68.04±21.00）、（64.54±20.64）、（60.36±19.65）nm，差異無統計學意義（P>0.05）。
圖3
硬脊膜橫截面透射電鏡觀察
圓形或橢圓形點狀表示軸向排列膠原纖維，長條形表示橫向排列膠原纖維 a. ×5 000；b. ×50 k
Figure3. The transverse section of dura mater observed by transmission electron microscopyThe round and oval dots were aligned collagen fibers along the axial direction, the long bars were collagen fibers along the transverse direction a. ×5 000; b. ×50 k
2.4 單軸生物力學測試
組內比較：頸段硬脊膜軸向和橫向的彈性模量、斷裂強度、斷裂伸長率比較差異均無統計學意義（P>0.05）；胸段和腰段軸向各指標均顯著大于橫向，差異有統計學意義（P<0.05）。組間比較：頸、胸、腰段硬脊膜的軸向和橫向彈性模量、斷裂強度、斷裂伸長率，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），呈頸、胸、腰段逐漸減小趨勢。軸向彈性模量/橫向彈性模量比值顯示，腰段比值最大，胸段次之，頸段比值最趨近于 1；頸、胸段比值顯著小于腰段，差異有統計學意義（P<0.05）；頸、胸段間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4、表 1。
表1
頸、胸、腰段硬脊膜軸向及橫向力學性能比較（n=5，）
Table1.
Mechanical properties along the axial and transverse direction of cervical，thoracic, and lumbar spinal dura mater (n=5, )
圖4
頸、胸、腰段硬脊膜拉力-應變曲線
a. 頸段；b. 胸段；c. 腰段
Figure4. Tension-strain curves of cervical, thoracic, and lumbar dura matera. Cervical segment; b. Thoracic segment; c. Lumbar segment
3 討論
硬脊膜損傷是脊柱手術或脊柱骨折的嚴重并發癥，若不及時有效處理，將極大影響患者康復。因此，越來越多學者在尋找良好的硬脊膜替代物方面作了大量研究[16-22]。生物性硬脊膜替代物由于存在免疫排斥、倫理及傳播疾病等問題，且物理特性及強度無法達到天然硬脊膜的要求，重建后易形成瘢痕造成椎管狹窄或壓迫神經，臨床應用受限[23-28]。人工硬脊膜多由人工材料合成，無傳播疾病風險及倫理問題，通過尋找低抗原性的材料，避免了免疫排斥反應，且成本低、易獲得，是近年研究熱點。但目前對天然硬脊膜的超微結構和力學特性尚不明確，現有文獻報道甚至存在相互矛盾[7-9, 11-13]，故明確硬脊膜的結構和力學特點對于人工硬脊膜的研發具有重要意義。
目前已有不少學者對硬脊膜的結構進行了研究[7-15, 29]。雖然有的研究采用人體標本[14-15, 29]，有的研究采用牛、豬、綿羊等[11-13]作為研究對象，但觀察到的硬脊膜結構相似。本研究以綿羊硬脊膜作為研究對象，通過 HE 染色發現硬脊膜主要由板層狀交織排列的膠原纖維、彈性纖維以及散在分布的成纖維細胞構成，纖維并非完全拉伸，而是呈波浪狀。膠原纖維主要為硬脊膜提供力學強度，而彈性纖維主要提供彈性和柔韌性。這與 Fink 等[14]以及 Vandenabeele 等[29]對人硬脊膜研究結果一致。此外，掃描電鏡觀察示成纖維細胞覆蓋于膠原纖維表面，形成了沿脊髓縱軸方向規律排列的溝壑狀隆起。與腦脊液接觸的腹側溝壑淺且平坦，可見散在分布的膠原纖維和彈性纖維；而背側細胞大量聚集，有明顯的溝壑，細胞沿軸向拉伸并有序排列。這一特點在頸、胸、腰段表現相似。細胞在膠原纖維表面的黏附生長、形態變化，與膠原纖維的排列密切相關。已有研究證實，在無規則的納米纖維表面，細胞隨機伸展，無明顯極性；而在取向納米纖維表面，細胞沿著纖維排列的方向拉伸并有序排列，具有明顯極性[30]。從硬脊膜內外側細胞排列的情況可以判斷，硬脊膜表面大部分膠原纖維沿縱軸方向有序排列。透射電鏡觀察發現，硬脊膜內部是由不同方向的膠原纖維板層狀排列而成，層內膠原纖維走向高度一致，具有明顯的取向性。與 Reina 等[15]以及 Vandenabeele 等[29]研究結果相吻合。
Wilcox 等[11]、Mazgajczyk 等[12]、Snehal 等[13]研究發現，硬脊膜橫向力學強度大于軸向。這些研究都選用頸段硬脊膜作為研究對象，而且越靠近上頸段，橫向拉伸力學強度越大；越靠近胸段，則軸向拉伸力學強度越大[12-13]。這表明不同節段硬脊膜的拉伸力學行為存在很大差異，不能通過某一局部的硬脊膜拉伸力學行為推測整個硬脊膜。本研究通過對綿羊 C6、C7 節段硬脊膜進行拉伸力學測試后發現，其軸向與橫向的力學強度差異無統計學意義。另有研究發現，硬脊膜軸向力學強度明顯大于橫向，硬脊膜內部膠原纖維以軸向為主[7-10]。分析相關文獻后我們發現，這些研究均是以腰段硬脊膜作為研究對象，再次印證了不同節段硬脊膜的結構和力學特點存在差異。本研究通過對綿羊 T11、T12、L4、L5 節段硬脊膜進行拉伸力學測試，同樣發現硬脊膜軸向力學強度明顯大于橫向，與上述研究結果相似。雖然不同節段硬脊膜拉伸力學特點有差異，但是卻有明顯的規律性：從頭側到尾側，硬脊膜軸向彈性模量/橫向彈性模量比值逐漸增加，說明越靠近尾側硬脊膜各向異性特點更為明顯。由于生物材料拉伸力學行為主要是由其內部結構決定，而膠原纖維是硬脊膜內最主要的力學強度提供因素，因此可以推斷，越靠近尾側，硬脊膜內軸向排列的膠原纖維比例越高，而越靠近頭側，橫向排列的膠原纖維比例越高。同時，從頸段到腰段，硬脊膜的力學強度逐漸減小。由于不同節段硬脊膜厚度也存在差異，頸段最厚，胸段次之，腰段最薄，可以部分解釋力學強度的差異。由于同一個體硬脊膜內膠原纖維粗細相似，因此可以推測頸段硬脊膜內膠原纖維排列可能更為緊密，而腰段硬脊膜內的膠原纖維排列可能更為疏松。但由于頸段硬脊膜斷裂強度和彈性模量不超過腰段的 2 倍，故不同節段膠原纖維排列的疏密程度差異可能并不會很大。
近年來，關于人硬脊膜結構和功能研究已有較多報道[7, 9, 14-15]。本實驗選擇綿羊作為動物模型，是因為綿羊脊柱和人體脊柱相似性較高，綿羊易獲得且性格溫和，是人體脊柱研究的良好動物模型[31-32]。但綿羊硬脊膜與人硬脊膜又存在差異，因此本文的研究數據尚不能直接用于指導人工硬脊膜的制備，但可以作為參考。
綜上述，本研究對綿羊不同節段硬脊膜的超微結構進行觀察并經生物力學測試，發現不同節段硬脊膜結構特征存在差異，且從頸段到腰段有一定的變化趨勢；在制備人工硬脊膜的過程中，不能用單一節段的結構和力學特征數據來模擬整個硬脊膜。本研究從整體上對硬脊膜的結構和生物力學特性進行了描述，為以后設計制備更加仿生的人工硬脊膜提供了參考。
