引用本文： 趙勝利, 殷杰, 于慶賀, 張國煒, 閔少雄. VEGF/PELA/bFGF 混合微囊促進大鼠 BMSCs 成血管分化研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(2): 243-251. doi: 10.7507/1002-1892.201808099 復制
組織工程骨內部血管化不足是其修復大段骨缺損面臨的難題之一[1-3]。BMSCs 被證實具有干細胞的一般標記，在不同生長因子調控下，可向骨組織、軟骨組織、脂肪組織分化[4-5]。近年來，大量研究集中于探討 BMSCs 成血管分化機制與效能[6-7]。在眾多參與調控體內血管生成的因子中，VEGF 和 bFGF 研究較為深入[8-9]。國內學者在大鼠皮膚缺血模型研究中發現，VEGF 在缺血局部逐漸升高，第 3 天時達峰值；而 bFGF 持續增加至 10 d 左右達峰值，說明在缺血部位損傷修復過程中，促血管生成因子的表達在時間上受到嚴格調控[10]。本課題組前期研究構建了以聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物（polylactide-polyethyleneglycol-polylactic acid copolymer，PELA）為囊材并搭載 BMP-2、7 的緩釋系統，并成功修復了大鼠股骨缺損[11]。該結果提示構建搭載 VEGF 和 bFGF 的序貫緩釋系統，有望為組織工程骨血管化創造條件。本次研究擬將可緩釋 bFGF 的 PELA 微囊與 VEGF 構成混合微囊，觀察該材料對大鼠 BMSCs 成血管分化能力的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 SD 大鼠 1 只，體質量 270 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，該動物實驗方案通過南方醫科大學動物倫理委員會審查并批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2016-0167。PELA（山東岱罡生物工程有限公司）；聚乙烯醇、二氯甲烷（山東醫學試劑研究所）；重組人 VEGF165（recombinant human VEGF165，rhVEGF165）、重組人 bFGF（recombinant human bFGF，rhbFGF）（PeproTech 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；rhVEGF165 及 rhbFGF ELISA 試劑盒（武漢華聯科生物技術有限公司）；Dil 標記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-labeled acetylated low density lipoprotein，Dil-ac-LDL；Molecular Probes 公司，美國）；FITC 標記的荊豆凝集素（FITC-labeled ulex europaeus agglutinin I，FITC-UEA-I；Sigma 公司，美國）；Matrigel 基質膠（Corning 公司，美國）；CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-PE 抗大鼠抗體（BD 公司，美國）。
多功能酶標儀（Molecular Devices 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；磁力攪拌器（北京金紫光科技發展有限公司）；臺式高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；FACSVerse 流式細胞儀（BD 公司，美國）；真空冷凍干燥機（LaboGene 公司，丹麥）。
1.2 BMSCs 分離培養及鑒定
1.2.1 BMSCs 分離培養
采用全骨髓貼壁法[5]分離培養 BMSCs。取 SD 大鼠以腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉麻醉后斷頸處死，無菌條件下剪取雙側股骨，剔除表面軟組織，PBS 反復沖洗，剪斷股骨兩側干骺端，用含 1% 青鏈霉素及 10%FBS 的 L-DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔，200 目網篩過濾沖洗液，收集濾出液，接種于培養瓶中，置于 37℃、5% CO2 細胞培養箱中培養。24 h 后首次換液，以后每 2 天換液1次，待細胞融合達 80%～90% 時，PBS 沖洗 3 次，0.25% 胰蛋白酶消化貼壁細胞，以 1∶2 比例傳代。細胞傳至第 3 代行后續實驗。
1.2.2 BMSCs 鑒定
① Wright-Giemsa 染色觀察：取第 3 代 BMSCs，倒置顯微鏡下觀察細胞集落，待細胞融合至 50%～60% 時行 Wright-Giemsa 染色。具體步驟：棄培養基，PBS 緩沖液沖洗 3 次，４% 多聚甲醛室溫固定 10 min，去離子水沖洗 3 次，室溫自然干燥，滴加 Wright-Giemsa 染液使之沒過細胞層，同時滴加等量 PBS 緩沖液，混勻后染色 3～5 min。待細胞著色后棄染液，去離子水緩慢沖洗 2 次，自然晾干后倒置顯微鏡下觀察細胞形態。
② 流式細胞術檢測細胞表面標記：取第 3 代 BMSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后 PBS 重懸，調整細胞密度約為 2×105個/mL 后分裝至 EP 管，每管 200 μL，相繼加入 CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-PE 抗大鼠抗體，充分混勻后冰上避光孵育 30 min，用小鼠 IgG1-PE 和 IgG1-FITC 作為同型對照。孵育完成后 PBS 洗滌 2 次，以離心半徑 13.9 cm、1 000 r/min 離心 5 min，加 200 μL PBS 重懸混勻，流式細胞儀上樣檢測。
1.3 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊的制備
利用復乳溶劑揮發法（W1/O/W2），按照課題組前期研究確定的最優化參數（PELA 280 mg，聚乙烯醇濃度 0.8%，bFGF 3 μg）[12]，制備內包 bFGF、外混 VEGF 的混合微囊。具體步驟：① 取 3 μg bFGF 溶入 200 μL 蒸餾水中，制成內水相 W1（A 溶液）；② 取 280 mg PELA 溶入 4 mL 二氯甲烷中，震蕩使之完全溶解（B 溶液）；③ 將上述 A 溶液加到 B 溶液中，震蕩器混勻 5 min，形成初乳夜 W1/O（C 溶液）；④ 將 320 mg 聚乙烯醇加入 40 mL 蒸餾水中，微波爐加熱使其完全溶解，形成 0.8% 的外水相 W2；⑤ 將 C 溶液加入外水相 W2 中，形成復乳液（W1/O/W2），室溫下用磁力攪拌器以 800 r/min 攪拌 30 min，溶液離心（離心半徑 13.9 cm、800 r/min 離心 5 min）、洗滌 3 次后收集微囊。⑥ 將微囊混入含有 3 μg VEGF 的超純水中，混勻，–80℃ 急凍成冰，冷凍干燥 24 h，即得到凍干 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊，密封干燥保存于–20℃ 冰箱。同法制備 bFGF/PELA、VEGF/PELA 及 PELA 微囊，備用。
1.4 PELA 微囊觀測
1.4.1 降解性能檢測
倒置顯微鏡下觀察 PELA 微囊形狀、直徑后，取 50 mg PELA 微囊溶于 1 mL PBS 緩沖液中（pH 7.4），制備懸液后置于 37℃ 恒溫箱，于 1、2、4、8、12、16、20 d 時取出觀察。具體步驟：取懸液以離心半徑 13.9 cm、800 r/min 離心 5 min，收集沉淀，冷凍干燥后稱重記錄。然后將凍干材料再次用 1 mL PBS 溶解，置于 37℃ 恒溫箱，待下一時間點時取出，重復上述操作，直至 20 d。實驗設置 6 個重復樣本。
1.4.2 細胞毒性檢測
將 PELA 微囊混入完全培養基中，制備濃度為 50 mg/mL 的混合培養基，以離心半徑 13.9 cm、800 r/min 離心 5 min 后取上清液（PELA 組）。以未添加 PELA 的完全培養基作為對照組。取融合至 80% 的第 3 代 BMSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后，分別以兩組不同培養基重懸，調整細胞密度為 5×104個/mL，接種至 96 孔板，每孔 100 μL，置于培養箱中繼續培養，每隔 2 天換液 1 次。于培養 3、7、14 d 兩組各取 6 孔，采用 CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖，以酶標儀 450 nm 波長處測定的吸光度（A）值間接反映活細胞數。
1.5 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊相關檢測
1.5.1 體外釋放檢測
于 37℃PBS（pH 7.4）緩沖液中進行 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊體外釋放檢測。取 50 mg 凍干混合微囊溶入含 1 mL PBS 的 EP 管中，混勻后置于 37℃ 恒溫箱中，固定時間點（1、2、4、8、12、16、20 d）取出，以離心半徑 13.9 cm、800 r/min 離心 5 min，收集上清液儲存于–20℃ 冰箱待最終測量。各時間點收集上清液后，重新加入 1 m PBS 重懸，置于 37℃ 恒溫箱中待下一時間點收集。20 d 收集上清液，取出各時間點樣本，參照 rhVEGF165、rhbFGF ELISA 試劑盒說明書檢測上清液中 VEGF 及 bFGF 濃度。實驗設置 6 個重復樣本。
1.5.2 微囊促進 BMSCs 成血管分化實驗
取 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊（A 組）、PELA/bFGF 微囊（B 組）、VEGF/PELA 微囊（C 組）、PELA 微囊（D 組），分別溶于 3 mL 完全培養基，調整微囊濃度為 12 mg/mL，置于 37℃ 恒溫箱中，每至用時（細胞培養換液時）取出培養基，以離心半徑 13.9 cm，800 r/min 離心 5 min。取 2 mL 上清液后等量完全培養基補充混勻放回，待下次換液時重復上述操作。
取第 3 代 BMSCs 以 1.5×106 個/孔細胞密度接種于 6 孔板，分別以上述 4 組收集的緩釋上清液為培養基進行培養。每隔 2 d 每孔 2/3 量換液，于培養 1、3、7、14、20 d 于倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化；培養 21 d 行誘導細胞攝取能力檢測及 Matrigel 基質膠小管形成實驗。
1.5.3 熒光顯微鏡觀察誘導細胞攝取能力
各組細胞經培養基誘導培養至 21 d，行攝取 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-I 實驗。取 6 孔板，PBS 沖洗 3 次，加入含 10 μg/mL Dil-ac-LDL 的完全培養基，置于 37℃、5% CO2 培養箱中孵育 4 h，去培養基，4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 沖洗 3 次，加入含 20 μg/mL FITC-UEA-I 的完全培養基，37℃、5% CO2 培養箱中孵育 1 h，PBS 清洗 3 次，熒光顯微鏡下觀察細胞攝取情況。攝取 Dil-ac-LDL 的細胞呈紅色熒光，攝取 FITC-UEA-I 的細胞呈綠色熒光；內皮細胞可同時攝取 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-I，為陽性細胞，呈黃色熒光。
1.5.4 Matrigel 基質膠小管形成實驗
各組細胞經培養基誘導培養至 21 d，行 Matrigel 基質膠小管形成實驗。于實驗前 1 d 將基質膠取出，4℃ 過夜融化，操作前 96 孔板、槍頭盒等均 4℃ 預冷。鋪膠過程在冰盒上進行，每孔加入 50 μL 基質膠，4℃ 平衡 10 min 后置于 37℃ 恒溫箱中孵育 30 min，取各組細胞 0.25% 胰蛋白酶消化重懸，調整細胞密度為 4×105個/mL，每孔加入 100 μL，37℃ 恒溫箱孵育 6 h，倒置顯微鏡 50 倍視野下觀察并拍照，利用 Image J 血管分析插件對小管形成指標（節點數、交叉點數、主干數及主干長度）進行定量分析。每組設 6 個重復孔。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用 LSD 檢驗、方差不齊時采用 Dunnett T3 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 分離培養與鑒定
全骨髓貼壁法培養原代細胞，24 h 后首次換液可見部分細胞貼壁，7 d 左右細胞融合至 80%，并傳代培養。倒置顯微鏡下，第 3 代細胞形態均勻，呈長梭形。Wright-Giemsa 染色后 BMSCs 細胞核呈淡藍色，細胞質呈淡紅色，細胞輪廓清晰，扁平長梭形，排列呈束狀；部分細胞呈雙核，胞膜不規則，正處于分裂狀態。流式細胞術鑒定顯示，CD29、CD44、CD90 呈陽性，CD45 呈陰性，證實分離培養的細胞表達常見的干細胞表面標記，為 BMSCs。見圖 1、2。
圖1
第 3 代 BMSCs 觀察
a. 細胞形態觀察（倒置顯微鏡×50）；b. Wright-Giemsa 染色（倒置顯微鏡×100）
Figure1. Observation of passage 3 BMSCsa. Morphology of cells (Inverted microscope×50); b. Wright-Giemsa staining (Inverted microscope×100)
圖2
第 3 代 BMSCs 細胞表型鑒定
a. CD29；b. CD44；c. CD90；d. CD45
Figure2. Immunophenotypic analysis of cell surface markers by flow cytometrya. CD29; b. CD44; c. CD90; d. CD45
2.2 PELA 微囊觀測
2.2.1 倒置顯微鏡觀察
倒置顯微鏡下觀察 PELA 微囊呈完整球形，形態規則，囊壁完整，偶有部分相互融合，大部分微囊直徑分布介于 30～60 μm 之間，部分超過 100 μm，與既往本課題組制備的結果[12]相似。見圖 3a。
圖3
PELA 微囊觀測
a. 倒置顯微鏡下觀察微囊結構（×100）；b. PELA 微囊降解曲線；c. CCK-8 法檢測細胞活力
Figure3. Observation of PELA microcapsulesa. Observation of PELA microcapsules by inverted microscope (×100); b. Degradation curve of PELA microcapsules; c. The cell viability evaluated by CCK-8 assay
2.2.2 降解性能檢測
PELA 微囊降解曲線見圖 3b。開始 4 d 內，材料降解速率平穩而緩慢，4～12 d 經歷快速降解期，10 d 左右材料降解為原始質量的 50%，之后再次經歷一緩慢的持續降解過程，20 d 時仍有約 30% 材料未完全降解。
2.2.3 細胞毒性檢測
CCK-8 法檢測顯示，培養 3、7、14 d PELA 組與對照組 A 值比較，差異均無統計學意義（F=0.020，P=0.890；F=1.149，P=0.309；F=1.182，P=0.302），提示以 PELA 為囊材短期內對大鼠 BMSCs 活力無影響。見圖 3c。
2.3 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊相關檢測
2.3.1 體外釋放實驗
VEGF/PELA/bFGF 混合微囊體外累積釋藥曲線見圖 4。由于 VEGF 未通過固定、直接凍干于微囊表面，在溶于 PBS 后大部分迅速溶解釋放，具體表現為 4 d 時有超過 90% 的累積釋放量，此后呈現一個較平穩的微量釋放過程，至 20 d 時釋放總量超過 95%。相比之下，包封在微囊內部的 bFGF 雖存在突釋現象，但在 2 d 后總體呈現較為穩定的緩釋過程，至 20 d 檢測到超過 80% 的累積釋放量。
圖4
VEGF/PELA/bFGF 微囊 VEGF 及 bFGF 的累積釋放率 曲線
Figure4.
The cumulative release rates of VEGF/PELA/bFGF mixed microcapsules
2.3.2 微囊促進 BMSCs 成血管分化
倒置顯微鏡觀察，培養初期各組細胞未見明顯形態學差異，直至 7 d 時 A 組部分 BMSCs 由長梭形變為多角形，B 組部分細胞形態不規則，相鄰細胞間隙增大，C、D 組細胞形態與正常 BMSCs 一致。14 d 時，A 組大部分細胞胞體變圓，B 組細胞也出現圓形改變，且局部聚集成團；C、D 組細胞形態未見明顯改變。20 d 時，A、B 組均出現典型內皮細胞“鋪路石”樣改變，C 組細胞呈現短梭形變，D 組細胞形態無明顯變化。見圖 5。
圖5
培養 20 d 各組細胞形態觀察（倒置顯微鏡×50）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. The morphology of cells in each group at 20 days (Inverted microscope×50)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.3 熒光顯微鏡觀察誘導細胞攝取能力
熒光顯微鏡下觀察，A 組雙熒光標記細胞最多，B 組次之，C 組較少，D 組幾乎不具備內皮細胞特有的攝取功能，提示經 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊誘導的 BMSCs 轉化為內皮樣細胞，且轉化效率高。見圖 6。
圖6
各組細胞攝取 Dil-ac-LDL 和 FITC-UEA-I 能力觀察（熒光顯微鏡×50）
從左至右分別為 Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I 以及雙熒光染色 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure6. The Dil-ac-LDL and FITC-UEA-I uptake ability of cells in each group (Fluorescence microscope×50)From left to right for Dil-ac-LDL, FITC-UEA-I, and double staining, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.4 Matrigel 基質膠小管形成實驗
倒置顯微鏡下可見 A、B 組均形成分支管狀結構；C 組細胞部分聚攏成團，但未形成管狀結構；D 組仍呈單細胞狀態。見圖 7。
圖7
各組培養 21 d 小管形成觀察（倒置顯微鏡× 50）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. Tube formation of cells in each group at 21 days (Inverted microscope×50)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
A、B 組節點數、交叉點數、主干數、主干長度均多于 C、D 組，差異有統計學意義（P<0.05）。A 組節點數、主干長度多于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組交叉點數、主干數比較差異無統計學意義（P>0.05）。C、D 組以上 4 個指標比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
各組小管形成檢測指標結果
a. 節點數；b. 交叉點數；c. 主干數；d. 主干長度
Figure8. The analysis of vascularize indexes of 4 groupsa. Nodes; b. Master junctions; c. Master segments; d. tot.master segments length
3 討論
骨皮質血管系統和骨髓毛細血管系統是維持骨組織正常代謝的基礎。各種原因導致的大段骨缺損及伴隨的骨骼血管系統破壞阻礙了骨組織的自我修復進程。據報道，骨細胞遷移僅限于毛細血管周圍 100 μm 范圍內[13]。因此，無論是骨組織自我修復重建還是利用組織工程填充材料修復骨缺損，實現早期有效的血管化具有重要意義[14]。
BMSCs 存在于骨髓組織中，同源性、容易純化、擴增迅速等優勢使其成為大段骨缺損修復的理想種子細胞。國內外研究證實，局部移植 BMSCs 可促進 Wnt1 和 β-catenin 在損傷部位高表達，進而激活 Wnt/β-catenin 信號通路，發揮成骨成血管效應[15-16]。Kang 等[17]將人臍靜脈內皮細胞定植在 BMSCs 片層上，共同包裹于 β-磷酸三鈣支架表面，模擬“骨膜”結構，移植入小鼠體內一段時間后檢測發現支架表面形成了豐富的毛細血管樣網絡。本實驗分離培養的 BMSCs 經 21 d 誘導后顯示出內皮細胞特有的吞噬 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-I 的能力，并在基質膠上形成典型的分支管狀結構，從功能學和行為學上表明 BMSCs 體外具有較強的可塑性及穩定性，并可在混合微囊的持續誘導培養下向內皮樣細胞轉化。但同時觀察到 C 組也出現了部分雙熒光陽性細胞，其為假陽性細胞還是內皮樣細胞尚需深入探究。值得注意的是，前期研究已證明 BMSCs 在培養過程中可分泌 VEGF 等生長因子[18]，不同培養條件可對 VEGF 分泌量產生影響[19]，因此，自身部分生長因子的釋放在 BMSCs 培養過程中也可能發揮了某種生物學作用。有文獻報道，長期體外擴增干細胞可引起基因組不穩定和染色體畸變，有學者建議通過降低增殖量、減少傳代次數來減小染色體畸變風險[20-21]。本實驗所用細胞為第 3 代，經歷 21 d 的誘導培養后其安全性及穩定性仍需進一步研究。此外，本實驗僅從目前常用的功能學和行為學兩方面驗證了所誘導的細胞具備內皮細胞特性，后續尚需在此基礎上驗證其特異性細胞標記及具體分化階段。
VEGF 和 bFGF 是血管生成初期重要的細胞因子[9, 22]。VEGF 促血管生成作用由 VEGFR-2 介導。局部組織缺氧可上調內皮細胞產生 VEGF 的能力，產生的 VEGF 使血管壁通透性增大，并反作用于內皮細胞，促進內皮細胞增殖并跨越內皮間隙，遷入缺氧部位[23]。bFGF 可誘導內皮細胞產生基質蛋白酶，分解細胞外基質，促進內皮細胞的遷移[22]。有研究認為，VEGF 在血管新生中可以誘導內皮祖細胞定向遷移和增殖，形成原始管狀結構，而 bFGF 隨后可招募周圍平滑肌細胞及周細胞，“包裝”原始管腔[8]。在本實驗中，B 組誘導細胞在基質膠中形成了僅次于 A 組的分支管狀結構，而 C 組未形成明顯管狀結構，其誘導細胞吞噬 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-I 的能力也顯著低于 A 組及 B 組，分析此結果可能與 VEGF 初期突釋現象明顯而后期作用時程較短，以及其與 bFGF 的不同生物學作用有關。在血管化指標的定量分析中，C 組細胞僅形成部分團狀聚集，未出現明顯分支點及主干，而 B 組細胞分支點及主干數遠多于 C 組，在兩種因子序貫作用下，A 組細胞在節點數、交叉點數、主干數及主干長度等指標中均處于首位，印證了兩種因子之間存在利于血管生成的協同效應[24]。
生長因子在調節細胞生物學行為過程中的釋放具有空間性和時間性，血管生成是不同生長因子程序化調控的結果[22]。搭載生物活性因子，模擬并放大局部成血管效應的組織工程支架材料是當前研究的熱點。有別于無機材料，有機高分子材料具有可完全降解，組織相容性良好等優勢，其物理學參數可通過不同基團的接枝實現定向改性[12, 25-26]。以往高分子載藥復合微囊的制備過程常需多次添加有機溶劑，并通過高溫高壓達到微囊的最佳塑形及負載狀態。本實驗以 PELA 為壁材，通過復乳溶劑揮發法制備包封 bFGF 的微囊材料，并將 VEGF 凍干于微囊表面制成混合微囊材料，大部分過程在常溫常壓下完成，這大大降低了異常環境對生長因子活性的影響。體外實驗證實其降解曲線穩定，并可大致模擬缺血部位損傷初期主要生長因子的釋放特點，細胞誘導實驗結果顯示具有序貫緩釋生長因子的 A 組材料具備優良的促進 BMSCs 定向分化能力。該混合微囊制備方法簡便，包封率穩定，易于保存，可作為構建多種不同藥物緩釋載體的新選擇。
綜上述，本研究表明具有序貫緩釋特點的 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊材料具有高效誘導 BMSCs 向內皮樣細胞分化的能力，這為克服組織工程骨修復大段骨缺損時內部血管化不足及臨床促進缺血組織再血管化提供了新思路。本課題組下一步將運用 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊復合 BMSCs 進行動物體內缺血皮瓣模型修復實驗，探討其在體內環境下促血管生成的有效性及安全性，并將其負載于組織工程骨內部，旨在為解決大段骨缺損修復過程中支架材料內部血管化不足提供新方法。
組織工程骨內部血管化不足是其修復大段骨缺損面臨的難題之一[1-3]。BMSCs 被證實具有干細胞的一般標記，在不同生長因子調控下，可向骨組織、軟骨組織、脂肪組織分化[4-5]。近年來，大量研究集中于探討 BMSCs 成血管分化機制與效能[6-7]。在眾多參與調控體內血管生成的因子中，VEGF 和 bFGF 研究較為深入[8-9]。國內學者在大鼠皮膚缺血模型研究中發現，VEGF 在缺血局部逐漸升高，第 3 天時達峰值；而 bFGF 持續增加至 10 d 左右達峰值，說明在缺血部位損傷修復過程中，促血管生成因子的表達在時間上受到嚴格調控[10]。本課題組前期研究構建了以聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物（polylactide-polyethyleneglycol-polylactic acid copolymer，PELA）為囊材并搭載 BMP-2、7 的緩釋系統，并成功修復了大鼠股骨缺損[11]。該結果提示構建搭載 VEGF 和 bFGF 的序貫緩釋系統，有望為組織工程骨血管化創造條件。本次研究擬將可緩釋 bFGF 的 PELA 微囊與 VEGF 構成混合微囊，觀察該材料對大鼠 BMSCs 成血管分化能力的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 SD 大鼠 1 只，體質量 270 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，該動物實驗方案通過南方醫科大學動物倫理委員會審查并批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2016-0167。PELA（山東岱罡生物工程有限公司）；聚乙烯醇、二氯甲烷（山東醫學試劑研究所）；重組人 VEGF165（recombinant human VEGF165，rhVEGF165）、重組人 bFGF（recombinant human bFGF，rhbFGF）（PeproTech 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；rhVEGF165 及 rhbFGF ELISA 試劑盒（武漢華聯科生物技術有限公司）；Dil 標記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-labeled acetylated low density lipoprotein，Dil-ac-LDL；Molecular Probes 公司，美國）；FITC 標記的荊豆凝集素（FITC-labeled ulex europaeus agglutinin I，FITC-UEA-I；Sigma 公司，美國）；Matrigel 基質膠（Corning 公司，美國）；CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-PE 抗大鼠抗體（BD 公司，美國）。
多功能酶標儀（Molecular Devices 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；磁力攪拌器（北京金紫光科技發展有限公司）；臺式高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；FACSVerse 流式細胞儀（BD 公司，美國）；真空冷凍干燥機（LaboGene 公司，丹麥）。
1.2 BMSCs 分離培養及鑒定
1.2.1 BMSCs 分離培養
采用全骨髓貼壁法[5]分離培養 BMSCs。取 SD 大鼠以腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉麻醉后斷頸處死，無菌條件下剪取雙側股骨，剔除表面軟組織，PBS 反復沖洗，剪斷股骨兩側干骺端，用含 1% 青鏈霉素及 10%FBS 的 L-DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔，200 目網篩過濾沖洗液，收集濾出液，接種于培養瓶中，置于 37℃、5% CO2 細胞培養箱中培養。24 h 后首次換液，以后每 2 天換液1次，待細胞融合達 80%～90% 時，PBS 沖洗 3 次，0.25% 胰蛋白酶消化貼壁細胞，以 1∶2 比例傳代。細胞傳至第 3 代行后續實驗。
1.2.2 BMSCs 鑒定
① Wright-Giemsa 染色觀察：取第 3 代 BMSCs，倒置顯微鏡下觀察細胞集落，待細胞融合至 50%～60% 時行 Wright-Giemsa 染色。具體步驟：棄培養基，PBS 緩沖液沖洗 3 次，４% 多聚甲醛室溫固定 10 min，去離子水沖洗 3 次，室溫自然干燥，滴加 Wright-Giemsa 染液使之沒過細胞層，同時滴加等量 PBS 緩沖液，混勻后染色 3～5 min。待細胞著色后棄染液，去離子水緩慢沖洗 2 次，自然晾干后倒置顯微鏡下觀察細胞形態。
② 流式細胞術檢測細胞表面標記：取第 3 代 BMSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后 PBS 重懸，調整細胞密度約為 2×105個/mL 后分裝至 EP 管，每管 200 μL，相繼加入 CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-PE 抗大鼠抗體，充分混勻后冰上避光孵育 30 min，用小鼠 IgG1-PE 和 IgG1-FITC 作為同型對照。孵育完成后 PBS 洗滌 2 次，以離心半徑 13.9 cm、1 000 r/min 離心 5 min，加 200 μL PBS 重懸混勻，流式細胞儀上樣檢測。
1.3 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊的制備
利用復乳溶劑揮發法（W1/O/W2），按照課題組前期研究確定的最優化參數（PELA 280 mg，聚乙烯醇濃度 0.8%，bFGF 3 μg）[12]，制備內包 bFGF、外混 VEGF 的混合微囊。具體步驟：① 取 3 μg bFGF 溶入 200 μL 蒸餾水中，制成內水相 W1（A 溶液）；② 取 280 mg PELA 溶入 4 mL 二氯甲烷中，震蕩使之完全溶解（B 溶液）；③ 將上述 A 溶液加到 B 溶液中，震蕩器混勻 5 min，形成初乳夜 W1/O（C 溶液）；④ 將 320 mg 聚乙烯醇加入 40 mL 蒸餾水中，微波爐加熱使其完全溶解，形成 0.8% 的外水相 W2；⑤ 將 C 溶液加入外水相 W2 中，形成復乳液（W1/O/W2），室溫下用磁力攪拌器以 800 r/min 攪拌 30 min，溶液離心（離心半徑 13.9 cm、800 r/min 離心 5 min）、洗滌 3 次后收集微囊。⑥ 將微囊混入含有 3 μg VEGF 的超純水中，混勻，–80℃ 急凍成冰，冷凍干燥 24 h，即得到凍干 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊，密封干燥保存于–20℃ 冰箱。同法制備 bFGF/PELA、VEGF/PELA 及 PELA 微囊，備用。
1.4 PELA 微囊觀測
1.4.1 降解性能檢測
倒置顯微鏡下觀察 PELA 微囊形狀、直徑后，取 50 mg PELA 微囊溶于 1 mL PBS 緩沖液中（pH 7.4），制備懸液后置于 37℃ 恒溫箱，于 1、2、4、8、12、16、20 d 時取出觀察。具體步驟：取懸液以離心半徑 13.9 cm、800 r/min 離心 5 min，收集沉淀，冷凍干燥后稱重記錄。然后將凍干材料再次用 1 mL PBS 溶解，置于 37℃ 恒溫箱，待下一時間點時取出，重復上述操作，直至 20 d。實驗設置 6 個重復樣本。
1.4.2 細胞毒性檢測
將 PELA 微囊混入完全培養基中，制備濃度為 50 mg/mL 的混合培養基，以離心半徑 13.9 cm、800 r/min 離心 5 min 后取上清液（PELA 組）。以未添加 PELA 的完全培養基作為對照組。取融合至 80% 的第 3 代 BMSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后，分別以兩組不同培養基重懸，調整細胞密度為 5×104個/mL，接種至 96 孔板，每孔 100 μL，置于培養箱中繼續培養，每隔 2 天換液 1 次。于培養 3、7、14 d 兩組各取 6 孔，采用 CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖，以酶標儀 450 nm 波長處測定的吸光度（A）值間接反映活細胞數。
1.5 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊相關檢測
1.5.1 體外釋放檢測
于 37℃PBS（pH 7.4）緩沖液中進行 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊體外釋放檢測。取 50 mg 凍干混合微囊溶入含 1 mL PBS 的 EP 管中，混勻后置于 37℃ 恒溫箱中，固定時間點（1、2、4、8、12、16、20 d）取出，以離心半徑 13.9 cm、800 r/min 離心 5 min，收集上清液儲存于–20℃ 冰箱待最終測量。各時間點收集上清液后，重新加入 1 m PBS 重懸，置于 37℃ 恒溫箱中待下一時間點收集。20 d 收集上清液，取出各時間點樣本，參照 rhVEGF165、rhbFGF ELISA 試劑盒說明書檢測上清液中 VEGF 及 bFGF 濃度。實驗設置 6 個重復樣本。
1.5.2 微囊促進 BMSCs 成血管分化實驗
取 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊（A 組）、PELA/bFGF 微囊（B 組）、VEGF/PELA 微囊（C 組）、PELA 微囊（D 組），分別溶于 3 mL 完全培養基，調整微囊濃度為 12 mg/mL，置于 37℃ 恒溫箱中，每至用時（細胞培養換液時）取出培養基，以離心半徑 13.9 cm，800 r/min 離心 5 min。取 2 mL 上清液后等量完全培養基補充混勻放回，待下次換液時重復上述操作。
取第 3 代 BMSCs 以 1.5×106 個/孔細胞密度接種于 6 孔板，分別以上述 4 組收集的緩釋上清液為培養基進行培養。每隔 2 d 每孔 2/3 量換液，于培養 1、3、7、14、20 d 于倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化；培養 21 d 行誘導細胞攝取能力檢測及 Matrigel 基質膠小管形成實驗。
1.5.3 熒光顯微鏡觀察誘導細胞攝取能力
各組細胞經培養基誘導培養至 21 d，行攝取 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-I 實驗。取 6 孔板，PBS 沖洗 3 次，加入含 10 μg/mL Dil-ac-LDL 的完全培養基，置于 37℃、5% CO2 培養箱中孵育 4 h，去培養基，4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 沖洗 3 次，加入含 20 μg/mL FITC-UEA-I 的完全培養基，37℃、5% CO2 培養箱中孵育 1 h，PBS 清洗 3 次，熒光顯微鏡下觀察細胞攝取情況。攝取 Dil-ac-LDL 的細胞呈紅色熒光，攝取 FITC-UEA-I 的細胞呈綠色熒光；內皮細胞可同時攝取 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-I，為陽性細胞，呈黃色熒光。
1.5.4 Matrigel 基質膠小管形成實驗
各組細胞經培養基誘導培養至 21 d，行 Matrigel 基質膠小管形成實驗。于實驗前 1 d 將基質膠取出，4℃ 過夜融化，操作前 96 孔板、槍頭盒等均 4℃ 預冷。鋪膠過程在冰盒上進行，每孔加入 50 μL 基質膠，4℃ 平衡 10 min 后置于 37℃ 恒溫箱中孵育 30 min，取各組細胞 0.25% 胰蛋白酶消化重懸，調整細胞密度為 4×105個/mL，每孔加入 100 μL，37℃ 恒溫箱孵育 6 h，倒置顯微鏡 50 倍視野下觀察并拍照，利用 Image J 血管分析插件對小管形成指標（節點數、交叉點數、主干數及主干長度）進行定量分析。每組設 6 個重復孔。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用 LSD 檢驗、方差不齊時采用 Dunnett T3 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 分離培養與鑒定
全骨髓貼壁法培養原代細胞，24 h 后首次換液可見部分細胞貼壁，7 d 左右細胞融合至 80%，并傳代培養。倒置顯微鏡下，第 3 代細胞形態均勻，呈長梭形。Wright-Giemsa 染色后 BMSCs 細胞核呈淡藍色，細胞質呈淡紅色，細胞輪廓清晰，扁平長梭形，排列呈束狀；部分細胞呈雙核，胞膜不規則，正處于分裂狀態。流式細胞術鑒定顯示，CD29、CD44、CD90 呈陽性，CD45 呈陰性，證實分離培養的細胞表達常見的干細胞表面標記，為 BMSCs。見圖 1、2。
圖1
第 3 代 BMSCs 觀察
a. 細胞形態觀察（倒置顯微鏡×50）；b. Wright-Giemsa 染色（倒置顯微鏡×100）
Figure1. Observation of passage 3 BMSCsa. Morphology of cells (Inverted microscope×50); b. Wright-Giemsa staining (Inverted microscope×100)
圖2
第 3 代 BMSCs 細胞表型鑒定
a. CD29；b. CD44；c. CD90；d. CD45
Figure2. Immunophenotypic analysis of cell surface markers by flow cytometrya. CD29; b. CD44; c. CD90; d. CD45
2.2 PELA 微囊觀測
2.2.1 倒置顯微鏡觀察
倒置顯微鏡下觀察 PELA 微囊呈完整球形，形態規則，囊壁完整，偶有部分相互融合，大部分微囊直徑分布介于 30～60 μm 之間，部分超過 100 μm，與既往本課題組制備的結果[12]相似。見圖 3a。
圖3
PELA 微囊觀測
a. 倒置顯微鏡下觀察微囊結構（×100）；b. PELA 微囊降解曲線；c. CCK-8 法檢測細胞活力
Figure3. Observation of PELA microcapsulesa. Observation of PELA microcapsules by inverted microscope (×100); b. Degradation curve of PELA microcapsules; c. The cell viability evaluated by CCK-8 assay
2.2.2 降解性能檢測
PELA 微囊降解曲線見圖 3b。開始 4 d 內，材料降解速率平穩而緩慢，4～12 d 經歷快速降解期，10 d 左右材料降解為原始質量的 50%，之后再次經歷一緩慢的持續降解過程，20 d 時仍有約 30% 材料未完全降解。
2.2.3 細胞毒性檢測
CCK-8 法檢測顯示，培養 3、7、14 d PELA 組與對照組 A 值比較，差異均無統計學意義（F=0.020，P=0.890；F=1.149，P=0.309；F=1.182，P=0.302），提示以 PELA 為囊材短期內對大鼠 BMSCs 活力無影響。見圖 3c。
2.3 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊相關檢測
2.3.1 體外釋放實驗
VEGF/PELA/bFGF 混合微囊體外累積釋藥曲線見圖 4。由于 VEGF 未通過固定、直接凍干于微囊表面，在溶于 PBS 后大部分迅速溶解釋放，具體表現為 4 d 時有超過 90% 的累積釋放量，此后呈現一個較平穩的微量釋放過程，至 20 d 時釋放總量超過 95%。相比之下，包封在微囊內部的 bFGF 雖存在突釋現象，但在 2 d 后總體呈現較為穩定的緩釋過程，至 20 d 檢測到超過 80% 的累積釋放量。
圖4
VEGF/PELA/bFGF 微囊 VEGF 及 bFGF 的累積釋放率 曲線
Figure4.
The cumulative release rates of VEGF/PELA/bFGF mixed microcapsules
2.3.2 微囊促進 BMSCs 成血管分化
倒置顯微鏡觀察，培養初期各組細胞未見明顯形態學差異，直至 7 d 時 A 組部分 BMSCs 由長梭形變為多角形，B 組部分細胞形態不規則，相鄰細胞間隙增大，C、D 組細胞形態與正常 BMSCs 一致。14 d 時，A 組大部分細胞胞體變圓，B 組細胞也出現圓形改變，且局部聚集成團；C、D 組細胞形態未見明顯改變。20 d 時，A、B 組均出現典型內皮細胞“鋪路石”樣改變，C 組細胞呈現短梭形變，D 組細胞形態無明顯變化。見圖 5。
圖5
培養 20 d 各組細胞形態觀察（倒置顯微鏡×50）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. The morphology of cells in each group at 20 days (Inverted microscope×50)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.3 熒光顯微鏡觀察誘導細胞攝取能力
熒光顯微鏡下觀察，A 組雙熒光標記細胞最多，B 組次之，C 組較少，D 組幾乎不具備內皮細胞特有的攝取功能，提示經 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊誘導的 BMSCs 轉化為內皮樣細胞，且轉化效率高。見圖 6。
圖6
各組細胞攝取 Dil-ac-LDL 和 FITC-UEA-I 能力觀察（熒光顯微鏡×50）
從左至右分別為 Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I 以及雙熒光染色 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure6. The Dil-ac-LDL and FITC-UEA-I uptake ability of cells in each group (Fluorescence microscope×50)From left to right for Dil-ac-LDL, FITC-UEA-I, and double staining, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3.4 Matrigel 基質膠小管形成實驗
倒置顯微鏡下可見 A、B 組均形成分支管狀結構；C 組細胞部分聚攏成團，但未形成管狀結構；D 組仍呈單細胞狀態。見圖 7。
圖7
各組培養 21 d 小管形成觀察（倒置顯微鏡× 50）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. Tube formation of cells in each group at 21 days (Inverted microscope×50)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
A、B 組節點數、交叉點數、主干數、主干長度均多于 C、D 組，差異有統計學意義（P<0.05）。A 組節點數、主干長度多于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組交叉點數、主干數比較差異無統計學意義（P>0.05）。C、D 組以上 4 個指標比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
各組小管形成檢測指標結果
a. 節點數；b. 交叉點數；c. 主干數；d. 主干長度
Figure8. The analysis of vascularize indexes of 4 groupsa. Nodes; b. Master junctions; c. Master segments; d. tot.master segments length
3 討論
骨皮質血管系統和骨髓毛細血管系統是維持骨組織正常代謝的基礎。各種原因導致的大段骨缺損及伴隨的骨骼血管系統破壞阻礙了骨組織的自我修復進程。據報道，骨細胞遷移僅限于毛細血管周圍 100 μm 范圍內[13]。因此，無論是骨組織自我修復重建還是利用組織工程填充材料修復骨缺損，實現早期有效的血管化具有重要意義[14]。
BMSCs 存在于骨髓組織中，同源性、容易純化、擴增迅速等優勢使其成為大段骨缺損修復的理想種子細胞。國內外研究證實，局部移植 BMSCs 可促進 Wnt1 和 β-catenin 在損傷部位高表達，進而激活 Wnt/β-catenin 信號通路，發揮成骨成血管效應[15-16]。Kang 等[17]將人臍靜脈內皮細胞定植在 BMSCs 片層上，共同包裹于 β-磷酸三鈣支架表面，模擬“骨膜”結構，移植入小鼠體內一段時間后檢測發現支架表面形成了豐富的毛細血管樣網絡。本實驗分離培養的 BMSCs 經 21 d 誘導后顯示出內皮細胞特有的吞噬 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-I 的能力，并在基質膠上形成典型的分支管狀結構，從功能學和行為學上表明 BMSCs 體外具有較強的可塑性及穩定性，并可在混合微囊的持續誘導培養下向內皮樣細胞轉化。但同時觀察到 C 組也出現了部分雙熒光陽性細胞，其為假陽性細胞還是內皮樣細胞尚需深入探究。值得注意的是，前期研究已證明 BMSCs 在培養過程中可分泌 VEGF 等生長因子[18]，不同培養條件可對 VEGF 分泌量產生影響[19]，因此，自身部分生長因子的釋放在 BMSCs 培養過程中也可能發揮了某種生物學作用。有文獻報道，長期體外擴增干細胞可引起基因組不穩定和染色體畸變，有學者建議通過降低增殖量、減少傳代次數來減小染色體畸變風險[20-21]。本實驗所用細胞為第 3 代，經歷 21 d 的誘導培養后其安全性及穩定性仍需進一步研究。此外，本實驗僅從目前常用的功能學和行為學兩方面驗證了所誘導的細胞具備內皮細胞特性，后續尚需在此基礎上驗證其特異性細胞標記及具體分化階段。
VEGF 和 bFGF 是血管生成初期重要的細胞因子[9, 22]。VEGF 促血管生成作用由 VEGFR-2 介導。局部組織缺氧可上調內皮細胞產生 VEGF 的能力，產生的 VEGF 使血管壁通透性增大，并反作用于內皮細胞，促進內皮細胞增殖并跨越內皮間隙，遷入缺氧部位[23]。bFGF 可誘導內皮細胞產生基質蛋白酶，分解細胞外基質，促進內皮細胞的遷移[22]。有研究認為，VEGF 在血管新生中可以誘導內皮祖細胞定向遷移和增殖，形成原始管狀結構，而 bFGF 隨后可招募周圍平滑肌細胞及周細胞，“包裝”原始管腔[8]。在本實驗中，B 組誘導細胞在基質膠中形成了僅次于 A 組的分支管狀結構，而 C 組未形成明顯管狀結構，其誘導細胞吞噬 Dil-ac-LDL 及 FITC-UEA-I 的能力也顯著低于 A 組及 B 組，分析此結果可能與 VEGF 初期突釋現象明顯而后期作用時程較短，以及其與 bFGF 的不同生物學作用有關。在血管化指標的定量分析中，C 組細胞僅形成部分團狀聚集，未出現明顯分支點及主干，而 B 組細胞分支點及主干數遠多于 C 組，在兩種因子序貫作用下，A 組細胞在節點數、交叉點數、主干數及主干長度等指標中均處于首位，印證了兩種因子之間存在利于血管生成的協同效應[24]。
生長因子在調節細胞生物學行為過程中的釋放具有空間性和時間性，血管生成是不同生長因子程序化調控的結果[22]。搭載生物活性因子，模擬并放大局部成血管效應的組織工程支架材料是當前研究的熱點。有別于無機材料，有機高分子材料具有可完全降解，組織相容性良好等優勢，其物理學參數可通過不同基團的接枝實現定向改性[12, 25-26]。以往高分子載藥復合微囊的制備過程常需多次添加有機溶劑，并通過高溫高壓達到微囊的最佳塑形及負載狀態。本實驗以 PELA 為壁材，通過復乳溶劑揮發法制備包封 bFGF 的微囊材料，并將 VEGF 凍干于微囊表面制成混合微囊材料，大部分過程在常溫常壓下完成，這大大降低了異常環境對生長因子活性的影響。體外實驗證實其降解曲線穩定，并可大致模擬缺血部位損傷初期主要生長因子的釋放特點，細胞誘導實驗結果顯示具有序貫緩釋生長因子的 A 組材料具備優良的促進 BMSCs 定向分化能力。該混合微囊制備方法簡便，包封率穩定，易于保存，可作為構建多種不同藥物緩釋載體的新選擇。
綜上述，本研究表明具有序貫緩釋特點的 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊材料具有高效誘導 BMSCs 向內皮樣細胞分化的能力，這為克服組織工程骨修復大段骨缺損時內部血管化不足及臨床促進缺血組織再血管化提供了新思路。本課題組下一步將運用 VEGF/PELA/bFGF 混合微囊復合 BMSCs 進行動物體內缺血皮瓣模型修復實驗，探討其在體內環境下促血管生成的有效性及安全性，并將其負載于組織工程骨內部，旨在為解決大段骨缺損修復過程中支架材料內部血管化不足提供新方法。
