引用本文： 柴樂, 全仁夫, 胡勁濤, 黃小龍, 呂建蘭, 張燦, 邱銳, 蔡兵兵. BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統復合羥基磷灰石/二氧化鋯泡沫陶瓷與誘導多能干細胞來源 MSCs 的體外研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(2): 252-258. doi: 10.7507/1002-1892.201809060 復制
大段骨缺損修復一直是骨科臨床難題之一。組織工程骨理念的提出，為骨缺損修復提供了新思路和新途徑。組織工程骨是由種子細胞、支架、生物活性物質等組成，通過這些物質的相互調控，可促進骨組織愈合。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）/二氧化鋯（ZrO2）生物活性、抗壓強度等經深入研究，被認為可以作為組織工程骨支架材料。BMSCs 具有增殖分化、免疫調節、擴增方便等優點，但有限的增殖能力、長期培養細胞活力易喪失等因素限制了其發展[1]。誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）表現出無限增長和分化能力[2]，但其臨床使用的安全性及其衍生物尚未完全闡明[3-4]。近年有研究報道采用 iPS 來源 MSCs（iPS-MSCs）靶向骨和/或軟骨修復[5-9]，故本實驗采用 iPS-MSCs 作為種子細胞。BMP 可誘導動物或人 BMSCs 分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經組織，且 BMP-2 可增強骨缺損愈合過程中 BMSCs 成骨分化能力[10-11]。但 BMP-2 循環半衰期相當短，如果通過靜脈注射使用，血液中的酶很容易使 BMP-2 失活[12-13]；另一個缺點是靜脈注射 BMP-2 可能產生爆發效應，導致軟組織血腫和骨吸收現象[14]。而殼聚糖的遞送系統能夠使 BMP-2 在特定位置持續釋放[15]。故本實驗采用 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統復合種植人 iPS-MSCs ，與 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料體外共培養，探索緩釋系統對 iPS-MSCs 成骨分化作用，并觀察 iPS-MSCs 在HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料上的黏附及活性，為后期體內研究奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
β-甘油磷酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；ALP 試劑盒、一抗、FITC 標記二抗、Hoechst（碧云天生物技術公司）；RPMI1640 完全培養基、殼聚糖粉末、BMP-2（Sigma 公司，美國）；iPS-MSCs（本課題組黃小龍提供）；明膠粉末、氯仿、異丙醇、無水乙醇、乙酸異戊酯（上海國藥集團）；HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料（上海大學材料學院）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；DEPC 處理水、2.5% 戊二醛（上海諾辰生物技術有限公司）；SYBR Green PCR 試劑盒、逆轉錄試劑盒（Thermo 公司，美國）；4% 多聚甲醛（上海潤捷化學試劑有限公司）；5%FBS（HyClone 公司，美國）。
低溫冷凍離心機（Sigma 公司，美國）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；酶聯免疫測試儀（Thermo Scientific Varioskan Flash 公司，美國）；ABI-7500 RT-PCR 儀（Thermo Fisher 公司，美國）；S4800 掃描電鏡（日立公司，日本）。
1.2 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統構建及觀測
1.2.1 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球構建
采用油包水相溶液法制備 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球。具體方法：① 取 1 g 明膠粉末于 50°C 溶解于 10 mL 去離子水，500 r/min 磁力攪拌下將其逐滴加入預加熱至 50°C 的 60 mL 橄欖油中，持續攪拌下乳化 10 min；乳化液在攪拌中逐漸冷卻至 4°C，形成固態微球，時間約 40 min。4°C 丙酮和乙醇分別漂洗 3 次，得到明膠微球，凍干。② 將制備的凍干明膠微球分散加入制備好的含 50 mmol/L 乙二醛的乙醇溶液中，室溫 500 r/min 磁力攪拌 10 h，離心沉淀，將沉淀用乙醇洗滌 2 次，凍干；再用 100 μm 和 50 μm 濾網過濾，得到明膠微球。③ 將殼聚糖粉末溶于 0.75%（V/V）乙酸水溶液中制得 1.5%（W/V）殼聚糖溶液，待完全溶解后用 0.45 μm 濾膜過濾，4°C 保存。將 β-甘油磷酸鈉溶于去離子水得到 50%（W/V）β-甘油磷酸鈉溶液，0.22 μm 濾膜過濾，4°C 保存。④ 將上述明膠微球加入 50 mL 1.5%（W/V）殼聚糖溶液中，調節 pH 值至 6.3；再將溶解后的 BMP-2 加入 50 mL 1.5%（W/V）殼聚糖溶液中，將 50%（W/V）β-甘油磷酸鈉溶液在 500 r/min 磁力攪拌下逐滴加入 50 mL 1.5%（W/V）殼聚糖溶液中，使最后溶液含 β-甘油磷酸鈉溶度為 88 mmol/L，pH 值約 7.2。將 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球在 37°C 孵育 3 h。以上步驟均在無菌條件下進行。
1.2.2 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球藥物包封率、載藥率和體外緩釋速率檢測
采用 ELISA 試劑盒法檢測，具體方法：取 5 mL 試管 3 支，每支試管中置入 150 mg BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球，各加 PBS（pH7.2）2 mL，37℃ 水浴振蕩；分別于 6 h、12 h 及 1、2、3、6、9、12、15 d，每支試管各取上清液 100 μL，測定波長 450 nm 及校準 570 nm 處的吸光度（A）值，根據標準曲線方程計算上清液中 BMP-2 濃度，從而計算出上清液中 BMP-2 含量。按以下公式計算各指標：① 藥物包封率=（BMP-2 總含量?上清液 BMP-2 含量）/BMP-2 總含量×100%；② 載藥率=（BMP-2 總含量?上清液 BMP-2 含量）/微球總質量（150 mg）×100%；③ 體外緩釋速率=上清液 BMP-2 含量/BMP-2 總含量×100%，并繪制 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球累積釋放曲線。
1.2.3 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球形態觀察
將 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球裁剪成 3 mm×1 mm 大小，固定于樣本臺，掃描電鏡觀察微球表面結構。
1.3 支架材料-微球-細胞共培養體系的建立及相關觀測
1.3.1 共培養體系的建立
將 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料高溫滅菌后，用無菌 0.01%（W/V）多聚賴氨酸浸泡過夜，無菌條件下晾干，然后放入培養皿并用 RPMI1640 完全培養基浸潤。在培養皿底部放置磁鐵，將純化后的 iPS-MSCs 和 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統制成懸浮液，然后逐滴緩慢滴至 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料上。RPMI1640 完全培養基培養，置于 37℃、5%CO2 培養箱內液面下培養 2 周，細胞融合后改為氣?液界面培養 10 d，作為實驗組。另外，同上法將 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料僅和純化后的 iPS-MSCs 共培養，作為對照組。
1.3.2 ALP 分泌量檢測
兩組共培養體系體外培養 3、7、10、14 d，采用 ALP 檢測試劑盒檢測 ALP 分泌量。
1.3.3 RT-PCR 檢測
兩組共培養體系體外培養 3、7、10、14 d，按 miRNA 試劑盒說明書進行操作。RT-PCR 擴增程序：熱變性 95℃、10 min；擴增 95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s；40 個循環。數據采用儀器自帶軟件分析 ABI Prism 7500 SDS Software 分析，采用 2–ΔΔCt法計算目的基因［核心結合因子 α1（core binding factor α1，Cbfa1）、Ⅰ型膠原、鋅指結構轉錄因子（Osterix，OSX）］相對表達量。目的基因引物序列見表 1。
表1
RT-PCR 檢測目的基因引物序列
Table1.
Primer sequence of genes
1.3.4 免疫組織化學染色檢測Ⅰ型膠原表達
兩組共培養體系體外培養 14 d 取出，PBS 漂洗 1 次，4% 多聚甲醛固定 15～30 min，再用 PBS 漂洗 3 min×2 次；3.5%FBS 室溫下封閉 15 min，不洗；一抗Ⅰ型膠原抗體 4℃ 孵育過夜，PBS 洗 5 min×3 次；滴加二抗工作液，37℃ 孵育 1 h；室溫避光孵育 Hoechst 15 min；熒光顯微鏡下觀察。
1.3.5 掃描電鏡觀察細胞爬行及黏附狀態
兩組共培養體系培養 14 d 后取出，4℃ 預冷 PBS 漂洗，2.5% 冷戊二醛固定 24 h；吸出固定液，PBS 漂洗，徹底除去戊二醛；梯度乙醇脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，表面噴金后掃描電鏡觀察。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統相關觀測
2.1.1 藥物包封率、載藥率和體外緩釋速率
① 藥物包封率：在 1 d 內微球的藥物包封率均高達 90% 以上，隨時間推移藥物包封率逐漸降低，但在 15 d 時仍有 44.49%±0.20%。見圖 1a。② 載藥率：在 1 d 內微球的載藥率均達 60% 以上，隨時間推移載藥率緩慢下降，15 d 時仍有 29.6%±0.14%。見圖 1b。③ 體外緩釋速率：BMP-2 的釋放表現出階段性釋放規律，前 1 d 內釋放緩慢，處于適應階段；1～6 d 表現為 rhBMP-2 爆發性釋放階段，第 6 天累積釋放率達 44.27%±0.30%；之后逐漸進入 BMP-2 緩慢釋放階段（6～12 d），第 12 天時累積釋放率達 53.22%±0.18%；最后進入穩定階段（12～15 d），第 15 天時累積釋放率為 55.50%±0.20%。見圖 1 c。
圖1
BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球 ELISA 檢測
a. 藥物包封率；b. 載藥率；c. 體外緩釋速率
Figure1. ELISA detection of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microspheresa. Drug encapsulation efficiency; b. Drug loading; c. In vitro sustained release rate
2.1.2 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球的球形良好，球形表面較光滑，其直徑約為（255±26）μm。見圖 2。
圖2
BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球掃描電鏡觀察（×200）
Figure2.
Scanning electron microscopy observation of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microsphere (×200)
2.2 共培養體系相關觀測
2.2.1 ALP 分泌量檢測
隨培養時間延長，兩組 ALP 分泌量均逐漸增加；各時間點實驗組 ALP 分泌量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
兩組培養各時間點 ALP 分泌量檢測
Figure3.
Detection of ALP secretion at different time points in the two groups
2.2.2 RT-PCR 檢測
隨培養時間延長，對照組各目的基因相對表達量無明顯變化；實驗組各目的基因相對表達量均逐漸增加，其中 Cbfa1 在 3～7 d 增加明顯，Ⅰ型膠原在 7～10 d 增加明顯，OSX 增加趨勢較均勻，10 d 后各目的基因表達增幅均降低。各時間點實驗組各目的基因相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
RT-PCR 檢測兩組培養各時間點各基因相對表達量
a. Cbfa1；b. Ⅰ型膠原；c. OSX
Figure4. RT-PCR detection of relative expression of genes in the two groups at different time pointsa. Cbfa1; b. Collagen type Ⅰ; c. OSX
2.2.3 免疫組織化學染色檢測Ⅰ型膠原表達
熒光顯微鏡觀察示，實驗組熒光數量明顯多于對照組，即Ⅰ型膠原表達水平高于對照組；細胞均能較均勻地分布于材料上，細胞形態良好。見圖 5。
圖5
兩組培養 14 d 免疫組織化學染色觀察（×200）
從左至右依次為 Hoechst 染色、Ⅰ型膠原染色和兩種染色重疊 a. 對照組；b. 實驗組
Figure5. Immunohistochemical staining at 14 days after culture in the two groups (×200)From left to right for Hoechst staining, Collagen type Ⅰ staining, and merge staining, respectively a. Control group; b. Experimental group
2.2.4 掃描電鏡觀察
對照組材料表面均勻分布著 iPS-MSCs，細胞黏附良好且數量較多，可見圓球狀的 iPS-MSCs 細胞核、條索樣細胞樹突與軸突，細胞生長正常，形態良好。實驗組可見 iPS-MSCs 的細胞核與 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統中的明膠微球有效黏附在一起，細胞核旁的細小灰色部分為細胞的樹突與軸突。見圖 6。
圖6
兩組培養 14 d 掃描電鏡觀察
箭頭示細胞核 a. 對照組（×500）；b. 實驗組（×200）
Figure6. Scanning electron microscopy observation at 14 days after culture in the two groupsArrow indicated nuclei a. Control group (×500); b. Experimental group (×200)
3 討論
ZrO2 作為 HA 增強體后，可獲得力學性能和生物相容性俱佳的生物復合材料[16]。由于 HA/ZrO2 致密體強度過大，同時也帶來了應力遮蔽的問題[17]。故將 HA/ZrO2 致密體制成生物多孔泡沫陶瓷材料后，不僅可調節其強度，還有利于營養物質和代謝產物在其內的運輸，提供了穩定的細胞外基質沉積、儲存場所，促進了 iPS-MSCs 在其內的繁殖和遷移[18-19]。這也是 HA/ZrO2 生物多孔泡沫陶瓷材料的最大優勢所在。
BMP 具有激活成熟成骨細胞中 ALP 活性的作用，也可作為 iPS 和 BMSCs 成骨分化的標志物[20]。 BMP 已初步應用于脊柱外科臨床[21]。殼聚糖作為一種無毒緩釋載體，其帶正電荷和-NH2 基團的特性使其可與帶負電荷的聚合物、大分子蛋白相互作用[22]。因 BMP-2 可能會產生爆發效應，故本實驗采用 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統緩解 BMP-2 的爆發效應。殼聚糖對藥物的包封率和釋放率受殼聚糖相對分子質量、脫乙酰度和濃度等影響，既往研究表明[23]，利用殼聚糖承載緩釋牛血清白蛋白，當殼聚糖相對分子質量從 10×103提高到 210×103，牛血清白蛋白的包封率提高約 2 倍，牛血清白蛋白的釋放速率從 73.9% 降至 17.6%。黃鑫等[24]采用乳化交聯法制備出的 BMP-2 殼聚糖緩釋微球包封率達到 85.4%±4.2%，前 10 d BMP-2 累積釋藥率為 62.5%±3.6%。殼聚糖作為 BMP-2 緩釋系統載體的潛力有待進一步挖掘。本實驗制備的 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統，在 1 d 內其包封率高達 90% 以上，隨時間推移包封率逐漸降低，但 15 d 時仍有 44.49%±0.20%；1 d 內載藥率達 60%，之后緩慢下降，15 d 時仍達 29.6%±0.14%；體外緩釋速率得到顯著控制，15 d 時為 55.50%±0.20%。殼聚糖水凝膠緩釋系統可使 BMP-2 的活性延長，大大提高了 BMP-2 的生物利用度。
種子細胞必須具有較強的擴增能力，并能在支架上黏附生長。BMSCs 作為一種公認的種子細胞，不僅具有多向分化潛能，同時也是基因治療適宜的細胞載體[25-26]。但其獲取易造成額外損傷，且增殖能力會隨供體年齡的增長而下降。而胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）的獲取要破壞早期的胚囊，有悖倫理道德[27-28]。而 iPS 具有和 ESCs 類似甚至優于 ESCs 的特性，同時又不存在倫理和免疫排斥問題[29]。考慮到直接應用 iPS 或 ESCs 可能有形成畸胎瘤的潛在風險，因此我們采用 iPS 來源的 MSCs 作為新型組織工程骨種子細胞。
本實驗先將 iPS-MSCs 和 HA/ZrO2 共培養，再將 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統與其復合共培養，并與單純 HA/ZrO2 復合 iPS-MSCs 進行比較，行 ALP 分泌量檢測、RT-PCR 檢測、Ⅰ型膠原免疫組織化學染色及掃描電鏡觀察。結果顯示，實驗組培養 14 d ALP 分泌量明顯高于對照組，表明 BMP-2 促進了 iPS-MSCs 中 ALP 表達，增強了 iPS-MSCs 成骨分化能力[26]。MSCs 可增殖分化為成骨細胞，具備成骨能力[30-33]，本實驗結果顯示 iPS-MSCs 也具有成骨分化能力。對照組在無緩釋系統的作用下，Cbfa1、Ⅰ型膠原和 OSX 基因相對表達量隨時間推移無明顯變化；而實驗組隨時間推移，各目的基因相對表達量均增加，同時Ⅰ型膠原表達也顯著多于對照組，表明 BMP-2 增強了 iPS-MSCs 成骨分化潛能[34]。掃描電鏡觀察可見 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統可包裹細胞；同時表面可見均勻分布的細胞，細胞與材料黏附良好，且生長正常，提示 iPS-MSCs 可在 HA/ZrO2 貼壁生長。故以 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統復合種植 iPS-MSCs 與 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料，有望成為未來組織工程骨研究和應用的發展方向。
綜上述，本研究結果表明，BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統具有較好的藥物包封率及載藥率，可延長 BMP-2 活性時間，BMP-2 可促進 iPS-MSCs 成骨分化。同時 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統復合種植 iPS-MSCs 與 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料在體外共培養后，iPS-BMSCs 黏附良好，細胞活性較好。下一步我們將對 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統復合種植 iPS-MSCs 與 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料的體內共培養進行研究。
大段骨缺損修復一直是骨科臨床難題之一。組織工程骨理念的提出，為骨缺損修復提供了新思路和新途徑。組織工程骨是由種子細胞、支架、生物活性物質等組成，通過這些物質的相互調控，可促進骨組織愈合。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）/二氧化鋯（ZrO2）生物活性、抗壓強度等經深入研究，被認為可以作為組織工程骨支架材料。BMSCs 具有增殖分化、免疫調節、擴增方便等優點，但有限的增殖能力、長期培養細胞活力易喪失等因素限制了其發展[1]。誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）表現出無限增長和分化能力[2]，但其臨床使用的安全性及其衍生物尚未完全闡明[3-4]。近年有研究報道采用 iPS 來源 MSCs（iPS-MSCs）靶向骨和/或軟骨修復[5-9]，故本實驗采用 iPS-MSCs 作為種子細胞。BMP 可誘導動物或人 BMSCs 分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經組織，且 BMP-2 可增強骨缺損愈合過程中 BMSCs 成骨分化能力[10-11]。但 BMP-2 循環半衰期相當短，如果通過靜脈注射使用，血液中的酶很容易使 BMP-2 失活[12-13]；另一個缺點是靜脈注射 BMP-2 可能產生爆發效應，導致軟組織血腫和骨吸收現象[14]。而殼聚糖的遞送系統能夠使 BMP-2 在特定位置持續釋放[15]。故本實驗采用 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統復合種植人 iPS-MSCs ，與 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料體外共培養，探索緩釋系統對 iPS-MSCs 成骨分化作用，并觀察 iPS-MSCs 在HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料上的黏附及活性，為后期體內研究奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
β-甘油磷酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；ALP 試劑盒、一抗、FITC 標記二抗、Hoechst（碧云天生物技術公司）；RPMI1640 完全培養基、殼聚糖粉末、BMP-2（Sigma 公司，美國）；iPS-MSCs（本課題組黃小龍提供）；明膠粉末、氯仿、異丙醇、無水乙醇、乙酸異戊酯（上海國藥集團）；HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料（上海大學材料學院）；Trizol（Invitrogen 公司，美國）；DEPC 處理水、2.5% 戊二醛（上海諾辰生物技術有限公司）；SYBR Green PCR 試劑盒、逆轉錄試劑盒（Thermo 公司，美國）；4% 多聚甲醛（上海潤捷化學試劑有限公司）；5%FBS（HyClone 公司，美國）。
低溫冷凍離心機（Sigma 公司，美國）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；酶聯免疫測試儀（Thermo Scientific Varioskan Flash 公司，美國）；ABI-7500 RT-PCR 儀（Thermo Fisher 公司，美國）；S4800 掃描電鏡（日立公司，日本）。
1.2 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統構建及觀測
1.2.1 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球構建
采用油包水相溶液法制備 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球。具體方法：① 取 1 g 明膠粉末于 50°C 溶解于 10 mL 去離子水，500 r/min 磁力攪拌下將其逐滴加入預加熱至 50°C 的 60 mL 橄欖油中，持續攪拌下乳化 10 min；乳化液在攪拌中逐漸冷卻至 4°C，形成固態微球，時間約 40 min。4°C 丙酮和乙醇分別漂洗 3 次，得到明膠微球，凍干。② 將制備的凍干明膠微球分散加入制備好的含 50 mmol/L 乙二醛的乙醇溶液中，室溫 500 r/min 磁力攪拌 10 h，離心沉淀，將沉淀用乙醇洗滌 2 次，凍干；再用 100 μm 和 50 μm 濾網過濾，得到明膠微球。③ 將殼聚糖粉末溶于 0.75%（V/V）乙酸水溶液中制得 1.5%（W/V）殼聚糖溶液，待完全溶解后用 0.45 μm 濾膜過濾，4°C 保存。將 β-甘油磷酸鈉溶于去離子水得到 50%（W/V）β-甘油磷酸鈉溶液，0.22 μm 濾膜過濾，4°C 保存。④ 將上述明膠微球加入 50 mL 1.5%（W/V）殼聚糖溶液中，調節 pH 值至 6.3；再將溶解后的 BMP-2 加入 50 mL 1.5%（W/V）殼聚糖溶液中，將 50%（W/V）β-甘油磷酸鈉溶液在 500 r/min 磁力攪拌下逐滴加入 50 mL 1.5%（W/V）殼聚糖溶液中，使最后溶液含 β-甘油磷酸鈉溶度為 88 mmol/L，pH 值約 7.2。將 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球在 37°C 孵育 3 h。以上步驟均在無菌條件下進行。
1.2.2 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球藥物包封率、載藥率和體外緩釋速率檢測
采用 ELISA 試劑盒法檢測，具體方法：取 5 mL 試管 3 支，每支試管中置入 150 mg BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球，各加 PBS（pH7.2）2 mL，37℃ 水浴振蕩；分別于 6 h、12 h 及 1、2、3、6、9、12、15 d，每支試管各取上清液 100 μL，測定波長 450 nm 及校準 570 nm 處的吸光度（A）值，根據標準曲線方程計算上清液中 BMP-2 濃度，從而計算出上清液中 BMP-2 含量。按以下公式計算各指標：① 藥物包封率=（BMP-2 總含量?上清液 BMP-2 含量）/BMP-2 總含量×100%；② 載藥率=（BMP-2 總含量?上清液 BMP-2 含量）/微球總質量（150 mg）×100%；③ 體外緩釋速率=上清液 BMP-2 含量/BMP-2 總含量×100%，并繪制 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球累積釋放曲線。
1.2.3 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球形態觀察
將 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球裁剪成 3 mm×1 mm 大小，固定于樣本臺，掃描電鏡觀察微球表面結構。
1.3 支架材料-微球-細胞共培養體系的建立及相關觀測
1.3.1 共培養體系的建立
將 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料高溫滅菌后，用無菌 0.01%（W/V）多聚賴氨酸浸泡過夜，無菌條件下晾干，然后放入培養皿并用 RPMI1640 完全培養基浸潤。在培養皿底部放置磁鐵，將純化后的 iPS-MSCs 和 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統制成懸浮液，然后逐滴緩慢滴至 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料上。RPMI1640 完全培養基培養，置于 37℃、5%CO2 培養箱內液面下培養 2 周，細胞融合后改為氣?液界面培養 10 d，作為實驗組。另外，同上法將 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料僅和純化后的 iPS-MSCs 共培養，作為對照組。
1.3.2 ALP 分泌量檢測
兩組共培養體系體外培養 3、7、10、14 d，采用 ALP 檢測試劑盒檢測 ALP 分泌量。
1.3.3 RT-PCR 檢測
兩組共培養體系體外培養 3、7、10、14 d，按 miRNA 試劑盒說明書進行操作。RT-PCR 擴增程序：熱變性 95℃、10 min；擴增 95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s；40 個循環。數據采用儀器自帶軟件分析 ABI Prism 7500 SDS Software 分析，采用 2–ΔΔCt法計算目的基因［核心結合因子 α1（core binding factor α1，Cbfa1）、Ⅰ型膠原、鋅指結構轉錄因子（Osterix，OSX）］相對表達量。目的基因引物序列見表 1。
表1
RT-PCR 檢測目的基因引物序列
Table1.
Primer sequence of genes
1.3.4 免疫組織化學染色檢測Ⅰ型膠原表達
兩組共培養體系體外培養 14 d 取出，PBS 漂洗 1 次，4% 多聚甲醛固定 15～30 min，再用 PBS 漂洗 3 min×2 次；3.5%FBS 室溫下封閉 15 min，不洗；一抗Ⅰ型膠原抗體 4℃ 孵育過夜，PBS 洗 5 min×3 次；滴加二抗工作液，37℃ 孵育 1 h；室溫避光孵育 Hoechst 15 min；熒光顯微鏡下觀察。
1.3.5 掃描電鏡觀察細胞爬行及黏附狀態
兩組共培養體系培養 14 d 后取出，4℃ 預冷 PBS 漂洗，2.5% 冷戊二醛固定 24 h；吸出固定液，PBS 漂洗，徹底除去戊二醛；梯度乙醇脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，表面噴金后掃描電鏡觀察。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統相關觀測
2.1.1 藥物包封率、載藥率和體外緩釋速率
① 藥物包封率：在 1 d 內微球的藥物包封率均高達 90% 以上，隨時間推移藥物包封率逐漸降低，但在 15 d 時仍有 44.49%±0.20%。見圖 1a。② 載藥率：在 1 d 內微球的載藥率均達 60% 以上，隨時間推移載藥率緩慢下降，15 d 時仍有 29.6%±0.14%。見圖 1b。③ 體外緩釋速率：BMP-2 的釋放表現出階段性釋放規律，前 1 d 內釋放緩慢，處于適應階段；1～6 d 表現為 rhBMP-2 爆發性釋放階段，第 6 天累積釋放率達 44.27%±0.30%；之后逐漸進入 BMP-2 緩慢釋放階段（6～12 d），第 12 天時累積釋放率達 53.22%±0.18%；最后進入穩定階段（12～15 d），第 15 天時累積釋放率為 55.50%±0.20%。見圖 1 c。
圖1
BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球 ELISA 檢測
a. 藥物包封率；b. 載藥率；c. 體外緩釋速率
Figure1. ELISA detection of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microspheresa. Drug encapsulation efficiency; b. Drug loading; c. In vitro sustained release rate
2.1.2 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球的球形良好，球形表面較光滑，其直徑約為（255±26）μm。見圖 2。
圖2
BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠微球掃描電鏡觀察（×200）
Figure2.
Scanning electron microscopy observation of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microsphere (×200)
2.2 共培養體系相關觀測
2.2.1 ALP 分泌量檢測
隨培養時間延長，兩組 ALP 分泌量均逐漸增加；各時間點實驗組 ALP 分泌量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
兩組培養各時間點 ALP 分泌量檢測
Figure3.
Detection of ALP secretion at different time points in the two groups
2.2.2 RT-PCR 檢測
隨培養時間延長，對照組各目的基因相對表達量無明顯變化；實驗組各目的基因相對表達量均逐漸增加，其中 Cbfa1 在 3～7 d 增加明顯，Ⅰ型膠原在 7～10 d 增加明顯，OSX 增加趨勢較均勻，10 d 后各目的基因表達增幅均降低。各時間點實驗組各目的基因相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
RT-PCR 檢測兩組培養各時間點各基因相對表達量
a. Cbfa1；b. Ⅰ型膠原；c. OSX
Figure4. RT-PCR detection of relative expression of genes in the two groups at different time pointsa. Cbfa1; b. Collagen type Ⅰ; c. OSX
2.2.3 免疫組織化學染色檢測Ⅰ型膠原表達
熒光顯微鏡觀察示，實驗組熒光數量明顯多于對照組，即Ⅰ型膠原表達水平高于對照組；細胞均能較均勻地分布于材料上，細胞形態良好。見圖 5。
圖5
兩組培養 14 d 免疫組織化學染色觀察（×200）
從左至右依次為 Hoechst 染色、Ⅰ型膠原染色和兩種染色重疊 a. 對照組；b. 實驗組
Figure5. Immunohistochemical staining at 14 days after culture in the two groups (×200)From left to right for Hoechst staining, Collagen type Ⅰ staining, and merge staining, respectively a. Control group; b. Experimental group
2.2.4 掃描電鏡觀察
對照組材料表面均勻分布著 iPS-MSCs，細胞黏附良好且數量較多，可見圓球狀的 iPS-MSCs 細胞核、條索樣細胞樹突與軸突，細胞生長正常，形態良好。實驗組可見 iPS-MSCs 的細胞核與 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統中的明膠微球有效黏附在一起，細胞核旁的細小灰色部分為細胞的樹突與軸突。見圖 6。
圖6
兩組培養 14 d 掃描電鏡觀察
箭頭示細胞核 a. 對照組（×500）；b. 實驗組（×200）
Figure6. Scanning electron microscopy observation at 14 days after culture in the two groupsArrow indicated nuclei a. Control group (×500); b. Experimental group (×200)
3 討論
ZrO2 作為 HA 增強體后，可獲得力學性能和生物相容性俱佳的生物復合材料[16]。由于 HA/ZrO2 致密體強度過大，同時也帶來了應力遮蔽的問題[17]。故將 HA/ZrO2 致密體制成生物多孔泡沫陶瓷材料后，不僅可調節其強度，還有利于營養物質和代謝產物在其內的運輸，提供了穩定的細胞外基質沉積、儲存場所，促進了 iPS-MSCs 在其內的繁殖和遷移[18-19]。這也是 HA/ZrO2 生物多孔泡沫陶瓷材料的最大優勢所在。
BMP 具有激活成熟成骨細胞中 ALP 活性的作用，也可作為 iPS 和 BMSCs 成骨分化的標志物[20]。 BMP 已初步應用于脊柱外科臨床[21]。殼聚糖作為一種無毒緩釋載體，其帶正電荷和-NH2 基團的特性使其可與帶負電荷的聚合物、大分子蛋白相互作用[22]。因 BMP-2 可能會產生爆發效應，故本實驗采用 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統緩解 BMP-2 的爆發效應。殼聚糖對藥物的包封率和釋放率受殼聚糖相對分子質量、脫乙酰度和濃度等影響，既往研究表明[23]，利用殼聚糖承載緩釋牛血清白蛋白，當殼聚糖相對分子質量從 10×103提高到 210×103，牛血清白蛋白的包封率提高約 2 倍，牛血清白蛋白的釋放速率從 73.9% 降至 17.6%。黃鑫等[24]采用乳化交聯法制備出的 BMP-2 殼聚糖緩釋微球包封率達到 85.4%±4.2%，前 10 d BMP-2 累積釋藥率為 62.5%±3.6%。殼聚糖作為 BMP-2 緩釋系統載體的潛力有待進一步挖掘。本實驗制備的 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統，在 1 d 內其包封率高達 90% 以上，隨時間推移包封率逐漸降低，但 15 d 時仍有 44.49%±0.20%；1 d 內載藥率達 60%，之后緩慢下降，15 d 時仍達 29.6%±0.14%；體外緩釋速率得到顯著控制，15 d 時為 55.50%±0.20%。殼聚糖水凝膠緩釋系統可使 BMP-2 的活性延長，大大提高了 BMP-2 的生物利用度。
種子細胞必須具有較強的擴增能力，并能在支架上黏附生長。BMSCs 作為一種公認的種子細胞，不僅具有多向分化潛能，同時也是基因治療適宜的細胞載體[25-26]。但其獲取易造成額外損傷，且增殖能力會隨供體年齡的增長而下降。而胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）的獲取要破壞早期的胚囊，有悖倫理道德[27-28]。而 iPS 具有和 ESCs 類似甚至優于 ESCs 的特性，同時又不存在倫理和免疫排斥問題[29]。考慮到直接應用 iPS 或 ESCs 可能有形成畸胎瘤的潛在風險，因此我們采用 iPS 來源的 MSCs 作為新型組織工程骨種子細胞。
本實驗先將 iPS-MSCs 和 HA/ZrO2 共培養，再將 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統與其復合共培養，并與單純 HA/ZrO2 復合 iPS-MSCs 進行比較，行 ALP 分泌量檢測、RT-PCR 檢測、Ⅰ型膠原免疫組織化學染色及掃描電鏡觀察。結果顯示，實驗組培養 14 d ALP 分泌量明顯高于對照組，表明 BMP-2 促進了 iPS-MSCs 中 ALP 表達，增強了 iPS-MSCs 成骨分化能力[26]。MSCs 可增殖分化為成骨細胞，具備成骨能力[30-33]，本實驗結果顯示 iPS-MSCs 也具有成骨分化能力。對照組在無緩釋系統的作用下，Cbfa1、Ⅰ型膠原和 OSX 基因相對表達量隨時間推移無明顯變化；而實驗組隨時間推移，各目的基因相對表達量均增加，同時Ⅰ型膠原表達也顯著多于對照組，表明 BMP-2 增強了 iPS-MSCs 成骨分化潛能[34]。掃描電鏡觀察可見 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統可包裹細胞；同時表面可見均勻分布的細胞，細胞與材料黏附良好，且生長正常，提示 iPS-MSCs 可在 HA/ZrO2 貼壁生長。故以 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統復合種植 iPS-MSCs 與 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料，有望成為未來組織工程骨研究和應用的發展方向。
綜上述，本研究結果表明，BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統具有較好的藥物包封率及載藥率，可延長 BMP-2 活性時間，BMP-2 可促進 iPS-MSCs 成骨分化。同時 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統復合種植 iPS-MSCs 與 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料在體外共培養后，iPS-BMSCs 黏附良好，細胞活性較好。下一步我們將對 BMP-2 明膠/殼聚糖水凝膠緩釋系統復合種植 iPS-MSCs 與 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料的體內共培養進行研究。
