引用本文： 閆亮, 姜金, 馬崇文, 李睿, 夏亞一. 沉默 Piezo1 機械敏感型離子通道對 MC3T3-E1 成骨細胞遷移的影響. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(1): 28-34. doi: 10.7507/1002-1892.201806121 復制
骨骼是一種具有代謝活性的組織，它會根據骨吸收和骨骼形成重復進行不斷改造，正常情況下，骨形成和骨吸收分別通過成骨細胞和破骨細胞的活性偶聯和平衡[1-2]。成骨細胞的分化和遷移是骨骼發生、骨塑形及骨折愈合的關鍵[3-4]。成骨細胞譜系中的細胞遷移，包括前體成骨細胞和成骨細胞，已被公認為可以影響骨形成過程。然而，介導成骨細胞遷移和骨形成的分子基礎尚不完全清楚。關于骨骼重塑中大部分重要運動性遷移受到 TGF-β1 募集的前體成骨細胞的影響，這些細胞在 IGF-1 的控制下在重塑位點處分化[5-6]。在骨損傷后修復的情況下，成骨細胞的遷移和附著也很重要，這些細胞遷移到骨損傷部位隨即開始增殖并產生新骨[7]。然而，成骨細胞遷移相對于細胞骨架調節的分子基礎及其骨量測定的相關性仍未完全理解。
Piezo 機械敏感型通道蛋白是 2010 年 Coste 等[8]將 RNA 干擾技術作用于小鼠 Neuro2A 細胞系，而發現的一種新型機械敏感型離子通道，自發現以來迅速引起各個領域學者的廣泛關注。我們的前期預實驗已表明 Piezo1/2 蛋白在小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞的細胞質及細胞核均有表達。Sugimoto 等[9]首次證明 Piezo1 作為 MSCs 中靜水壓力的受體發揮功能，并促進成骨細胞分化，同時抑制脂肪細胞分化。但其是否在成骨細胞遷移中也起到一定作用尚不可知。鑒于此，本實驗采用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）技術轉染小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞，觀察 Piezo1 機械敏感型通道蛋白對小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞遷移及其相關蛋白的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞（中國醫學科學院北京庫）。FBS（PAN-Biotech 公司，德國）；α-MEM 培養基（HyClone 公司，美國）；胰蛋白酶（Sigma 公司，美國）；兔抗小鼠 Piezo1 單克隆抗體（Novus 公司，美國）；Piezo1 siRNA、siRNA 轉染培養基、siRNA 轉染試劑（Santa Cruz Biotechnology 公司，美國）；β-actin 單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量檢測試劑盒、山羊血清（碧云天生物技術有限公司）；488 山羊抗兔熒光二抗（PTG 公司，美國）；DAPI、結晶紫染色液（北京索萊寶生物技術有限公司）。細胞培養箱（上海力申科學儀器有限公司）；垂直電泳儀、電轉儀（Bio-Rad 公司，美國）；倒置相差顯微鏡、BX51 熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 細胞培養及 Piezo1-siRNA 轉染
將小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞按 4×104 個/mL 密度接種至 25 cm2 無菌培養瓶中，用完全培養基（含 10%FBS 和 100 U/mL 青鏈霉素的 α-MEM 培養基）于 37℃、5%CO2 培養箱中孵育細胞，每隔 2～3 d 用 PBS 緩沖液輕柔洗滌細胞 1～2 次并更換培養基，待細胞融合至 80%～90% 時，用 0.25% 胰蛋白酶消化，接種至 25 cm2培養瓶中繼續傳代培養，備用。
根據前期預實驗結果及細胞形態變化趨勢決定取第 5～10 代小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞，將細胞按 5×105 個/mL 密度接種到 6 孔板中，分為 Piezo1-siRNA 轉染組（A 組）、陰性對照組（B 組）和空白對照組（C 組），每組設 2 個復孔。于 37℃、5%CO2 培養箱中繼續孵育 24 h，待 3 組細胞融合至 60%～80% 時準備溶液 a 和溶液 b。溶液 a 是將 2～8 μL Piezo1-siRNA 稀釋到 100 μL siRNA 轉染培養基中，溶液 b 是將 2～8 μL siRNA 轉染試劑稀釋到 100 μL siRNA 轉染培養基中；將 a、b 溶液混勻，室溫放置 30 min，使其充分反應形成轉染復合物。用 2 mL siRNA 轉染培養基洗滌所有細胞 1 次，吸出培養基，A 組細胞中加入約 200 μL 轉染復合物及 800 μL siRNA 轉染培養基；B 組細胞中加入 2～8 μL siRNA 轉染試劑及 1 mL siRNA 轉染培養基；C 組細胞中加入 1 mL siRNA 轉染試劑。控制 3 組細胞培養基總量約 1 mL。Piezo1-siRNA 序列：正義 5'-CCUUGU-UCCAGGUCUACUATT-3'，反義 5'-UAGUAGACCU-GGAACAAGGTT-3'；陰性對照 siRNA 序列：正義 5'-UGGUAGUCUGUAAGCUUCGGAACGA-3'，反義 5'-CCGAUCUAAACCUCACCGGACAC-AC-3'。
1.3 觀測指標
1.3.1 轉染后細胞形態觀察
3 組細胞于 37℃、5%CO2 培養箱中繼續孵育 48 h，倒置相差顯微鏡觀察 A 組轉染后細胞形態。B 組于每個細胞孔加入帶有 FITC 熒光標記的轉染試劑 2～8 μL，繼續培養 2 h，于熒光顯微鏡下觀察并計算轉染效率（視野內熒光細胞數量與細胞總數的比值）。
1.3.2 免疫熒光染色觀察
待 3 組細胞融合至 80%～90% 時，用 0.25% 胰蛋白酶消化，調整細胞密度為 5×105 個/mL 后接種至載玻片上，于 37℃、5%CO2 培養箱中繼續孵育 24 h；PBS 洗滌 3 遍，4% 多聚甲醛固定細胞 30 min；PBS 洗滌 3 遍，0.2%Triton X-100 通透 15～20 min；PBS 洗滌 3 遍，山羊封閉血清 37℃ 下封閉 30 min；然后去除封閉液，勿洗，加入兔抗小鼠 Piezo1 單克隆抗體（1∶100），將載玻片置于濕盒中，4℃ 冰箱孵育過夜。PBS 洗滌 3 遍、每遍 5 min，避光下加山羊抗兔熒光二抗（1∶300），37℃ 恒溫箱中避光孵育 90 min；PBS 洗滌 3 遍，避光下滴加 DAPI 染核，室溫孵育 20 min；PBS 洗滌 3 遍，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。使用 Image J 軟件進行半定量熒光強度分析，以吸光度（A）值表示。實驗重復 3 次，取均值。
1.3.3 Western blot 檢測
3 組細胞轉染 48 h 后，用 4℃ 預冷的 PBS 緩沖液輕柔沖洗細胞 2 遍，將完全培養基更換為無血清培養基，繼續 37℃、5%CO2 培養箱中培養 4 h；PBS 再次沖洗 2 遍，吸凈培養皿中的 PBS，用 RIPA 和 PMSF 的混合液（100∶1）冰上裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒測定總蛋白濃度。提取的蛋白質行 6%～10% SDS-PAGE 電泳（濃縮膠 80 V、分離膠 120 V），轉膜，室溫封閉 2 h，TBST 洗滌 3 遍、每遍 10 min，加兔抗小鼠 Piezo1 單克隆抗體（2 μg/mL）、β-actin 單克隆抗體（1∶2 000），4℃ 搖床上孵育過夜；TBST 洗膜，加辣根過氧化物標記的山羊抗兔或抗小鼠 IgG（1∶5 000），4℃ 搖床上孵育 2 h；TBST 洗膜。滴加 ECL 發光液，使用 Kodak 醫用 X 射線膠片曝光，經顯影液、定影液處理后得到條帶，使用 Image J 軟件測量各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與其所對應內參 β-actin 蛋白條帶的灰度值之比作為目的蛋白的表達水平。實驗重復 3 次，取均值。
1.3.4 Transwell 細胞遷移實驗
更換培養基靜置細胞 4 h（方法同前），用 0.25% 胰蛋白酶消化并分別收集 3 組小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞，使用細胞計數板調整細胞密度為 2×105 個/mL。于 Transwell 上室中加入細胞懸液 200 μL，下室加入 600 μL 含 20% FBS 的 α-MEM 培養基，置于 37℃、5%CO2 培養箱中繼續培養 48 h；然后取出 Transwell 小室，移除上下室液體，用 PBS 清洗小室 3 遍，4% 多聚甲醛溶液固定細胞 30 min；用棉簽小心拭去上室膜上未穿過小室膜的細胞，PBS 清洗 3 遍，風干后加入 0.25% 結晶紫染色 30 min；PBS 清洗 3 遍，倒置相差顯微鏡下每組隨機選取 5 個視野（放大 400 倍）計數遷移到下室的細胞數。實驗重復 3 次，取均值。
1.3.5 細胞劃痕實驗
取第 5～10 代呈指數生長的小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化后，以 5×105 個/孔密度接種至 6 孔板（提前使用消毒干凈的直尺和記號筆在 6 孔板背后均勻劃 6 條平行橫線，線間距 1 cm）中，按分組方法分別轉染細胞，每組設 2 個復孔。待細胞貼壁達 80%～90% 時，更換培養基靜置細胞 4 h（方法同前）。借助直尺，使用 200 μL 槍頭在板底垂直于所標記橫線劃 3 條平行直線，用 PBS 輕柔沖洗 3 次，除去殘留懸浮細胞，分別于培養 1、2、3、4 d 時，倒置相差顯微鏡下觀察細胞遷移情況。用 Image J 軟件測量各時間點愈合劃痕面積，并計算劃痕愈合率，公式為：（1－劃痕面積/最初劃痕面積）×100%。實驗重復 3 次，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 轉染后細胞形態觀察
未轉染的小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞均貼壁生長，呈矮柱狀或立方形，可見細胞輪廓清晰，并帶有小突起；核大而圓、核仁清楚，細胞膜完整。轉染 48 h 后，A 組可見細胞體積較未轉染細胞略有增大，細胞突變長增粗，但細胞集落有所減少，懸浮細胞較未轉染增多，細胞碎片增多。熒光顯微鏡下可見 B 組小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞中出現綠色熒光，轉染效率為 68.56%±4.12%。見圖 1。
圖1
轉染前后小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞形態觀察
a. 未轉染細胞（倒置相差顯微鏡×400）；b. A 組細胞轉染 48 h（倒置相差顯微鏡×400）；c. B 組細胞轉染 48 h（熒光顯微鏡×100）
Figure1. Morphological observation of mouse MC3T3-E1 osteoblasts before and after transfectiona. Untransfected cells (Inverted phase contrast microscope×400); b. Cells transfected for 48 hours in group A (Inverted phase contrast microscope×400); c. Cells transfected for 48 hours in group B (Fluorescence microscope×100)
2.2 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡觀察示，B、C 組細胞界限明顯較 A 組清楚，細胞質及細胞核熒光強度均高于 A 組。見圖 2。A 組細胞 A 值（0.234±0.006）顯著低于 B 組（0.435±0.012）和 C 組（0.403±0.034），差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
免疫熒光染色觀察各組 Piezo1 蛋白表達（熒光顯微鏡×200）
從左至右依次為 Piezo1、細胞核、二者重疊 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. Immunofluorescence staining observation for Piezo1 protein expression in each group (Fluorescence microscope×200)From left to right for Piezo1, nucleus, and merge a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3 Western blot 檢測
Western blot 檢測示，A 組 Piezo1 蛋白相對表達量（0.507±0.034）顯著低于 B 組（0.829±0.062）和 C 組（0.808±0.058），差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
Western blot 檢測各組 Piezo1 蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：C 組 2：B 組 3：A 組
Figure3. Piezo1 protein expression in each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group C 2: Group B 3: Group A
2.4 Transwell 細胞遷移實驗
倒置相差顯微鏡觀察示，B、C 組細胞密度明顯大于 A 組。見圖 4。A、B、C 組遷移細胞數分別為（39.400±9.502）、（66.400±12.992）、（68.200±11.713）個/孔，A 組明顯少于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖4
倒置相差顯微鏡觀察各組細胞遷移能力（結晶紫染色×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Cell migration ability of each group observed by inverted phase contrast microscope (Crystal violet staining×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.5 細胞劃痕實驗
倒置相差顯微鏡觀察示，劃痕愈合率隨時間延長逐漸增加，第 4 天劃痕基本愈合完整，且 B、C 組愈合速度明顯快于 A 組。見圖 5。培養 1～4 d，A 組細胞劃痕愈合率均明顯小于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
圖5
細胞劃痕實驗檢測各時間點各組細胞遷移能力（倒置相差顯微鏡×100）
從左至右分別為 A、B、C 組 a. 0 d；b. 1 d；c. 2 d；d. 3 d；e. 4 d
Figure5. Cell migration ability of each group at different time points detected by cell scratch test (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for groups A, B, and C a. Zero day; b. One day; c. Two days; d. Three days; e. Four days
表1
細胞劃痕實驗檢測各時間點各組細胞劃痕愈合率（n=3，%，
）
Table1.
Cell scratch test for detecting the healing rate of cell scratches at different time points in each group (n=3, %, 
)
3 討論
骨折愈合是一個復雜而神秘的生物學修復過程，受多方面因素的影響[10]。骨折愈合過程經歷炎癥期、修復期、重塑期，3 個階段相互交織演進，無法截然分開。有諸多因素可以影響骨折愈合，一般認為生長因子、骨傳導支架、MSCs 以及機械環境是影響骨折愈合的 4 個主要因素[11]；其中，成骨細胞分化及遷移對骨折愈合起著至關重要的作用。Eleniste 等[12]的研究結果表明，動力蛋白 GTPase 的活性對成骨細胞的分化及遷移至關重要。Aryal 等[7]的研究顯示，Nck（酪氨酸激酶的非催化區域，統稱為 Nck1 和 Nck2）是維持骨質量的前成骨細胞和成骨細胞遷移，從而促進骨形成的關鍵調節劑。同時，Vishnuprasad 等[13]的研究提供了 aurantio-obtusin（一種新提取的藥用植物化合物）可以刺激成骨細胞遷移和分化的諸多證據。
近年研究發現，多條信號通路參與骨折愈合過程，如機械敏感性離子通道-瞬時感受器電位通道（TRP）[14-15]等。而作為機械敏感性離子通道的較新成員，新型離子通道蛋白 Piezo 在骨折愈合中的機制研究目前尚無報道。本研究以此為切入點，旨在明確 Piezo1 在小鼠骨折愈合生理過程中的作用，有助于闡明其在骨折愈合中的生理機制，為治療骨折提供新的靶點。
本實驗將 Piezo1-siRNA 轉染至小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞中抑制 Piezo1 的表達，初步探討沉默 Piezo1 離子通道表達對小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞遷移特性的影響。結果顯示，沉默 Piezo1 后小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞中 Piezo1 蛋白的表達以及細胞遷移能力均有明顯下降，提示 Piezo1 離子通道蛋白在促進小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞遷移特性方面起著一定作用。
綜上述，本研究結果表明，采用 Piezo1-siRNA 可以成功沉默 Piezo1 蛋白的表達，小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞在 Piezo1 蛋白被沉默后，其遷移能力明顯受抑制。由此，我們推測機械敏感型離子通道 Piezo1 可能參與成骨細胞遷移以及骨形成的調控，但其具體分子機制有待進一步研究證實。因此，研究 Piezo1 離子通道在骨質疏松發病機制以及骨折治療中的作用非常重要，尤其是隨著人們對各種 Piezo1 離子通道抑制劑 GsMTx4[16-18]和激活劑 Yoda1[19-21]的了解，它有可能成為治療骨折和研發抗骨質疏松藥物的新靶點。但以上實驗所反映出來的遷移抑制效果究竟是抑制 Piezo1 蛋白所達到的直接效應，還是通過抑制 Piezo1 蛋白間接抑制其他一些與遷移直接相關蛋白的表達，如基質金屬蛋白酶[22-23]、整合素[24]等，進而調節小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞的遷移能力，還需更進一步研究。
骨骼是一種具有代謝活性的組織，它會根據骨吸收和骨骼形成重復進行不斷改造，正常情況下，骨形成和骨吸收分別通過成骨細胞和破骨細胞的活性偶聯和平衡[1-2]。成骨細胞的分化和遷移是骨骼發生、骨塑形及骨折愈合的關鍵[3-4]。成骨細胞譜系中的細胞遷移，包括前體成骨細胞和成骨細胞，已被公認為可以影響骨形成過程。然而，介導成骨細胞遷移和骨形成的分子基礎尚不完全清楚。關于骨骼重塑中大部分重要運動性遷移受到 TGF-β1 募集的前體成骨細胞的影響，這些細胞在 IGF-1 的控制下在重塑位點處分化[5-6]。在骨損傷后修復的情況下，成骨細胞的遷移和附著也很重要，這些細胞遷移到骨損傷部位隨即開始增殖并產生新骨[7]。然而，成骨細胞遷移相對于細胞骨架調節的分子基礎及其骨量測定的相關性仍未完全理解。
Piezo 機械敏感型通道蛋白是 2010 年 Coste 等[8]將 RNA 干擾技術作用于小鼠 Neuro2A 細胞系，而發現的一種新型機械敏感型離子通道，自發現以來迅速引起各個領域學者的廣泛關注。我們的前期預實驗已表明 Piezo1/2 蛋白在小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞的細胞質及細胞核均有表達。Sugimoto 等[9]首次證明 Piezo1 作為 MSCs 中靜水壓力的受體發揮功能，并促進成骨細胞分化，同時抑制脂肪細胞分化。但其是否在成骨細胞遷移中也起到一定作用尚不可知。鑒于此，本實驗采用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）技術轉染小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞，觀察 Piezo1 機械敏感型通道蛋白對小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞遷移及其相關蛋白的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞（中國醫學科學院北京庫）。FBS（PAN-Biotech 公司，德國）；α-MEM 培養基（HyClone 公司，美國）；胰蛋白酶（Sigma 公司，美國）；兔抗小鼠 Piezo1 單克隆抗體（Novus 公司，美國）；Piezo1 siRNA、siRNA 轉染培養基、siRNA 轉染試劑（Santa Cruz Biotechnology 公司，美國）；β-actin 單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量檢測試劑盒、山羊血清（碧云天生物技術有限公司）；488 山羊抗兔熒光二抗（PTG 公司，美國）；DAPI、結晶紫染色液（北京索萊寶生物技術有限公司）。細胞培養箱（上海力申科學儀器有限公司）；垂直電泳儀、電轉儀（Bio-Rad 公司，美國）；倒置相差顯微鏡、BX51 熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 細胞培養及 Piezo1-siRNA 轉染
將小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞按 4×104 個/mL 密度接種至 25 cm2 無菌培養瓶中，用完全培養基（含 10%FBS 和 100 U/mL 青鏈霉素的 α-MEM 培養基）于 37℃、5%CO2 培養箱中孵育細胞，每隔 2～3 d 用 PBS 緩沖液輕柔洗滌細胞 1～2 次并更換培養基，待細胞融合至 80%～90% 時，用 0.25% 胰蛋白酶消化，接種至 25 cm2培養瓶中繼續傳代培養，備用。
根據前期預實驗結果及細胞形態變化趨勢決定取第 5～10 代小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞，將細胞按 5×105 個/mL 密度接種到 6 孔板中，分為 Piezo1-siRNA 轉染組（A 組）、陰性對照組（B 組）和空白對照組（C 組），每組設 2 個復孔。于 37℃、5%CO2 培養箱中繼續孵育 24 h，待 3 組細胞融合至 60%～80% 時準備溶液 a 和溶液 b。溶液 a 是將 2～8 μL Piezo1-siRNA 稀釋到 100 μL siRNA 轉染培養基中，溶液 b 是將 2～8 μL siRNA 轉染試劑稀釋到 100 μL siRNA 轉染培養基中；將 a、b 溶液混勻，室溫放置 30 min，使其充分反應形成轉染復合物。用 2 mL siRNA 轉染培養基洗滌所有細胞 1 次，吸出培養基，A 組細胞中加入約 200 μL 轉染復合物及 800 μL siRNA 轉染培養基；B 組細胞中加入 2～8 μL siRNA 轉染試劑及 1 mL siRNA 轉染培養基；C 組細胞中加入 1 mL siRNA 轉染試劑。控制 3 組細胞培養基總量約 1 mL。Piezo1-siRNA 序列：正義 5'-CCUUGU-UCCAGGUCUACUATT-3'，反義 5'-UAGUAGACCU-GGAACAAGGTT-3'；陰性對照 siRNA 序列：正義 5'-UGGUAGUCUGUAAGCUUCGGAACGA-3'，反義 5'-CCGAUCUAAACCUCACCGGACAC-AC-3'。
1.3 觀測指標
1.3.1 轉染后細胞形態觀察
3 組細胞于 37℃、5%CO2 培養箱中繼續孵育 48 h，倒置相差顯微鏡觀察 A 組轉染后細胞形態。B 組于每個細胞孔加入帶有 FITC 熒光標記的轉染試劑 2～8 μL，繼續培養 2 h，于熒光顯微鏡下觀察并計算轉染效率（視野內熒光細胞數量與細胞總數的比值）。
1.3.2 免疫熒光染色觀察
待 3 組細胞融合至 80%～90% 時，用 0.25% 胰蛋白酶消化，調整細胞密度為 5×105 個/mL 后接種至載玻片上，于 37℃、5%CO2 培養箱中繼續孵育 24 h；PBS 洗滌 3 遍，4% 多聚甲醛固定細胞 30 min；PBS 洗滌 3 遍，0.2%Triton X-100 通透 15～20 min；PBS 洗滌 3 遍，山羊封閉血清 37℃ 下封閉 30 min；然后去除封閉液，勿洗，加入兔抗小鼠 Piezo1 單克隆抗體（1∶100），將載玻片置于濕盒中，4℃ 冰箱孵育過夜。PBS 洗滌 3 遍、每遍 5 min，避光下加山羊抗兔熒光二抗（1∶300），37℃ 恒溫箱中避光孵育 90 min；PBS 洗滌 3 遍，避光下滴加 DAPI 染核，室溫孵育 20 min；PBS 洗滌 3 遍，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。使用 Image J 軟件進行半定量熒光強度分析，以吸光度（A）值表示。實驗重復 3 次，取均值。
1.3.3 Western blot 檢測
3 組細胞轉染 48 h 后，用 4℃ 預冷的 PBS 緩沖液輕柔沖洗細胞 2 遍，將完全培養基更換為無血清培養基，繼續 37℃、5%CO2 培養箱中培養 4 h；PBS 再次沖洗 2 遍，吸凈培養皿中的 PBS，用 RIPA 和 PMSF 的混合液（100∶1）冰上裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒測定總蛋白濃度。提取的蛋白質行 6%～10% SDS-PAGE 電泳（濃縮膠 80 V、分離膠 120 V），轉膜，室溫封閉 2 h，TBST 洗滌 3 遍、每遍 10 min，加兔抗小鼠 Piezo1 單克隆抗體（2 μg/mL）、β-actin 單克隆抗體（1∶2 000），4℃ 搖床上孵育過夜；TBST 洗膜，加辣根過氧化物標記的山羊抗兔或抗小鼠 IgG（1∶5 000），4℃ 搖床上孵育 2 h；TBST 洗膜。滴加 ECL 發光液，使用 Kodak 醫用 X 射線膠片曝光，經顯影液、定影液處理后得到條帶，使用 Image J 軟件測量各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與其所對應內參 β-actin 蛋白條帶的灰度值之比作為目的蛋白的表達水平。實驗重復 3 次，取均值。
1.3.4 Transwell 細胞遷移實驗
更換培養基靜置細胞 4 h（方法同前），用 0.25% 胰蛋白酶消化并分別收集 3 組小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞，使用細胞計數板調整細胞密度為 2×105 個/mL。于 Transwell 上室中加入細胞懸液 200 μL，下室加入 600 μL 含 20% FBS 的 α-MEM 培養基，置于 37℃、5%CO2 培養箱中繼續培養 48 h；然后取出 Transwell 小室，移除上下室液體，用 PBS 清洗小室 3 遍，4% 多聚甲醛溶液固定細胞 30 min；用棉簽小心拭去上室膜上未穿過小室膜的細胞，PBS 清洗 3 遍，風干后加入 0.25% 結晶紫染色 30 min；PBS 清洗 3 遍，倒置相差顯微鏡下每組隨機選取 5 個視野（放大 400 倍）計數遷移到下室的細胞數。實驗重復 3 次，取均值。
1.3.5 細胞劃痕實驗
取第 5～10 代呈指數生長的小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化后，以 5×105 個/孔密度接種至 6 孔板（提前使用消毒干凈的直尺和記號筆在 6 孔板背后均勻劃 6 條平行橫線，線間距 1 cm）中，按分組方法分別轉染細胞，每組設 2 個復孔。待細胞貼壁達 80%～90% 時，更換培養基靜置細胞 4 h（方法同前）。借助直尺，使用 200 μL 槍頭在板底垂直于所標記橫線劃 3 條平行直線，用 PBS 輕柔沖洗 3 次，除去殘留懸浮細胞，分別于培養 1、2、3、4 d 時，倒置相差顯微鏡下觀察細胞遷移情況。用 Image J 軟件測量各時間點愈合劃痕面積，并計算劃痕愈合率，公式為：（1－劃痕面積/最初劃痕面積）×100%。實驗重復 3 次，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 轉染后細胞形態觀察
未轉染的小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞均貼壁生長，呈矮柱狀或立方形，可見細胞輪廓清晰，并帶有小突起；核大而圓、核仁清楚，細胞膜完整。轉染 48 h 后，A 組可見細胞體積較未轉染細胞略有增大，細胞突變長增粗，但細胞集落有所減少，懸浮細胞較未轉染增多，細胞碎片增多。熒光顯微鏡下可見 B 組小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞中出現綠色熒光，轉染效率為 68.56%±4.12%。見圖 1。
圖1
轉染前后小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞形態觀察
a. 未轉染細胞（倒置相差顯微鏡×400）；b. A 組細胞轉染 48 h（倒置相差顯微鏡×400）；c. B 組細胞轉染 48 h（熒光顯微鏡×100）
Figure1. Morphological observation of mouse MC3T3-E1 osteoblasts before and after transfectiona. Untransfected cells (Inverted phase contrast microscope×400); b. Cells transfected for 48 hours in group A (Inverted phase contrast microscope×400); c. Cells transfected for 48 hours in group B (Fluorescence microscope×100)
2.2 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡觀察示，B、C 組細胞界限明顯較 A 組清楚，細胞質及細胞核熒光強度均高于 A 組。見圖 2。A 組細胞 A 值（0.234±0.006）顯著低于 B 組（0.435±0.012）和 C 組（0.403±0.034），差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
免疫熒光染色觀察各組 Piezo1 蛋白表達（熒光顯微鏡×200）
從左至右依次為 Piezo1、細胞核、二者重疊 a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. Immunofluorescence staining observation for Piezo1 protein expression in each group (Fluorescence microscope×200)From left to right for Piezo1, nucleus, and merge a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3 Western blot 檢測
Western blot 檢測示，A 組 Piezo1 蛋白相對表達量（0.507±0.034）顯著低于 B 組（0.829±0.062）和 C 組（0.808±0.058），差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
Western blot 檢測各組 Piezo1 蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：C 組 2：B 組 3：A 組
Figure3. Piezo1 protein expression in each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group C 2: Group B 3: Group A
2.4 Transwell 細胞遷移實驗
倒置相差顯微鏡觀察示，B、C 組細胞密度明顯大于 A 組。見圖 4。A、B、C 組遷移細胞數分別為（39.400±9.502）、（66.400±12.992）、（68.200±11.713）個/孔，A 組明顯少于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖4
倒置相差顯微鏡觀察各組細胞遷移能力（結晶紫染色×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Cell migration ability of each group observed by inverted phase contrast microscope (Crystal violet staining×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.5 細胞劃痕實驗
倒置相差顯微鏡觀察示，劃痕愈合率隨時間延長逐漸增加，第 4 天劃痕基本愈合完整，且 B、C 組愈合速度明顯快于 A 組。見圖 5。培養 1～4 d，A 組細胞劃痕愈合率均明顯小于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
圖5
細胞劃痕實驗檢測各時間點各組細胞遷移能力（倒置相差顯微鏡×100）
從左至右分別為 A、B、C 組 a. 0 d；b. 1 d；c. 2 d；d. 3 d；e. 4 d
Figure5. Cell migration ability of each group at different time points detected by cell scratch test (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for groups A, B, and C a. Zero day; b. One day; c. Two days; d. Three days; e. Four days
表1
細胞劃痕實驗檢測各時間點各組細胞劃痕愈合率（n=3，%，）
Table1.
Cell scratch test for detecting the healing rate of cell scratches at different time points in each group (n=3, %, )
3 討論
骨折愈合是一個復雜而神秘的生物學修復過程，受多方面因素的影響[10]。骨折愈合過程經歷炎癥期、修復期、重塑期，3 個階段相互交織演進，無法截然分開。有諸多因素可以影響骨折愈合，一般認為生長因子、骨傳導支架、MSCs 以及機械環境是影響骨折愈合的 4 個主要因素[11]；其中，成骨細胞分化及遷移對骨折愈合起著至關重要的作用。Eleniste 等[12]的研究結果表明，動力蛋白 GTPase 的活性對成骨細胞的分化及遷移至關重要。Aryal 等[7]的研究顯示，Nck（酪氨酸激酶的非催化區域，統稱為 Nck1 和 Nck2）是維持骨質量的前成骨細胞和成骨細胞遷移，從而促進骨形成的關鍵調節劑。同時，Vishnuprasad 等[13]的研究提供了 aurantio-obtusin（一種新提取的藥用植物化合物）可以刺激成骨細胞遷移和分化的諸多證據。
近年研究發現，多條信號通路參與骨折愈合過程，如機械敏感性離子通道-瞬時感受器電位通道（TRP）[14-15]等。而作為機械敏感性離子通道的較新成員，新型離子通道蛋白 Piezo 在骨折愈合中的機制研究目前尚無報道。本研究以此為切入點，旨在明確 Piezo1 在小鼠骨折愈合生理過程中的作用，有助于闡明其在骨折愈合中的生理機制，為治療骨折提供新的靶點。
本實驗將 Piezo1-siRNA 轉染至小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞中抑制 Piezo1 的表達，初步探討沉默 Piezo1 離子通道表達對小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞遷移特性的影響。結果顯示，沉默 Piezo1 后小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞中 Piezo1 蛋白的表達以及細胞遷移能力均有明顯下降，提示 Piezo1 離子通道蛋白在促進小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞遷移特性方面起著一定作用。
綜上述，本研究結果表明，采用 Piezo1-siRNA 可以成功沉默 Piezo1 蛋白的表達，小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞在 Piezo1 蛋白被沉默后，其遷移能力明顯受抑制。由此，我們推測機械敏感型離子通道 Piezo1 可能參與成骨細胞遷移以及骨形成的調控，但其具體分子機制有待進一步研究證實。因此，研究 Piezo1 離子通道在骨質疏松發病機制以及骨折治療中的作用非常重要，尤其是隨著人們對各種 Piezo1 離子通道抑制劑 GsMTx4[16-18]和激活劑 Yoda1[19-21]的了解，它有可能成為治療骨折和研發抗骨質疏松藥物的新靶點。但以上實驗所反映出來的遷移抑制效果究竟是抑制 Piezo1 蛋白所達到的直接效應，還是通過抑制 Piezo1 蛋白間接抑制其他一些與遷移直接相關蛋白的表達，如基質金屬蛋白酶[22-23]、整合素[24]等，進而調節小鼠 MC3T3-E1 成骨細胞的遷移能力，還需更進一步研究。
