引用本文： 林冠宇, 林博杰, 朱江英, 潘新元, 殷國前. 天然水蛭素對人微血管再生作用的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(12): 1586-1591. doi: 10.7507/1002-1892.201806055 復制
天然水蛭素為水蛭的主要成分，臨床首先將其用于治療血栓類疾病。近年來研究發現，天然水蛭素還具有抗炎、改善循環、促進血管生成等作用，進一步擴展了臨床應用范圍[1-2]。本課題組研究發現，天然水蛭素能緩解微動脈壁痙攣、擴張血管、加快血液循環，通過刺激內皮細胞釋放 VEGF 來促進微血管生成[3]。有研究者[4]還發現，天然水蛭素具有促進內皮細胞釋放 VEGF 和提高在淤血皮瓣局部起抗炎作用的超氧化物歧化酶含量，且效果優于重組水蛭素。Pan 等[5]的相關作用機制研究證實，天然水蛭素可通過調節 p38、MAPK 和 ERK 分子的交互作用，促進大鼠缺血皮瓣模型的血管生成。
Notch 信號通路在人血管形成中起重要作用[6]，它有 4 個受體（Notch1、2、3、4）[7]。Notch 信號通路被配體激活后釋放 Notch 胞內段，進入細胞核激活 Notch 下游靶基因。人體中只有 Notch1 和 Notch4 在血管內皮表達，研究表明敲除 Notch1 會導致缺少血管重塑必需的原始血管叢[8]，其在后天血管形成中起重要作用[9]。而 VEGF 作為 Notch 信號通路的上游啟動因子共同參與了血管形成過程[10]。本實驗擬探究天然水蛭素是否通過 VEGF-Notch 信號通路，發揮促人微血管內皮細胞（human microvascular endothelial cells，HMVECs）增殖和血管再生的作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
HMVECs 購自北京北納創聯生物技術研究院。天然水蛭素（南寧市凈雪皇生物工程有限公司）；Matrigel 基質膠（Corning 公司，美國）；VEGF 抗體、Notch1 抗體（Abcam 公司，英國）；H-DMEM 培養液、FBS（Thermo Fisher 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）。
血管生成載玻片（Ibidi 公司，德國）；超凈工作臺、細胞培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）；低溫高速離心機（Eppendorf 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；37℃ 溫水浴箱（寧波新芝生物科技股份有限公司）；酶標儀（Synergy 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞三維培養模型制備及分組
取 Matrigel 基質膠 4℃ 過夜后，轉移至血管生成載玻片，每孔 10 μL，置于 37℃ 培養箱 20 min，使液態基質膠凝固。取 HMVECs 以胰蛋白酶消化后，采用含 10%FBS 的 DMEM 培養基制成密度為 2×105個/mL 的細胞懸液，并充分混勻；將已成膠的血管生成載玻片置于冰上，每孔接種 50 μL 細胞懸液后，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 24 h，制備細胞三維培養模型，倒置相差顯微鏡下觀察細胞成管情況。
取細胞三維培養模型，隨機分為不同濃度天然水蛭素培養組（1、4、7 ATU/mL 組）以及單純含 10%FBS 的 DMEM 培養基培養組（對照組）。各組細胞三維培養模型加入對應培養基后，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，于相應時間點取標本進行觀察。
1.2.2 CCK-8 細胞增殖實驗
培養 24、48、72 h 后，各組取 6 個復孔分別加入 5 μL CCK-8 溶液，繼續培養 2 h 后，用酶標儀測定 450 nm 處吸光度（A）值。以無細胞的單純培養基作為空白對照。實驗重復 3 次。
1.2.3 細胞成管實驗
培養 24 h 后，各組取 6 個復孔，倒置相差顯微鏡下觀察細胞成管情況，并應用 Image J 軟件計數成管數量。
1.2.4 免疫熒光染色測定 VEGF 和 Notch1 表達
培養 24 h 后，各組取 6 個復孔，細胞回收液收集細胞并接種至細胞爬片。細胞爬片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min；4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 浸洗；0.5%TritonX-100 室溫通透 20 min。滴加正常山羊血清封閉后，滴加稀釋的一抗（VEGF、Notch1）、4℃ 過夜；滴加熒光二抗，1 h 后 PBST 洗 2 次、每次 2 min；滴加 DAPI 復染，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。最后，置于熒光顯微鏡下觀察，呈綠色熒光為陽性染色細胞。
1.3 統計學方法
采用 SPSS25.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05
2 結果
2.1 細胞三維培養模型構建觀察
HMVECs 接種至基質膠三維培養至 24 h 時，細胞基本形成血管腔隙結構，形態規則，成管情況較好。見圖 1。
圖1
三維培養 24 h 后倒置相差顯微鏡下觀察 HMVECs （×200）
Figure1.
HMVECs observation by inverted phase contrast micro scope at 24 hours after three-dimensional culture (×200)
2.2 CCK-8 細胞增殖實驗
各時間點，1、4 ATU/mL 組 A 值均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），提示該濃度天然水蛭素促進細胞增殖。其中，24 h 時 4 ATU/mL 組A 值高于 1 ATU/mL 組，差異有統計學意義（P<0.05）；而 48、72 h 時兩組A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）。各時間點，7 ATU/mL 組A 值顯著低于其他 3 組，組間差異均有統計學意義（P<0.05），提示該濃度天然水蛭素抑制細胞增殖。見圖 2。
圖2
CCK-8 檢測 HMVECs 生長曲線
Figure2.
The growth curve of HMVECs by CCK-8
2.3 細胞成管實驗
培養 24 h，對照組及 1、4、7 ATU/mL 組成管數量分別為（3.33±0.57）、（5.66±1.52）、（9.33±1.15）、（3.00±1.00）個。1、4 ATU/mL 組成管數較對照組及 7 ATU/mL 組明顯增多，4 ATU/mL 組多于 1 ATU/mL 組，差異有統計學意義（P<0.05）。而 7 ATU/mL 組與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
各組細胞成管實驗觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 對照組；b. 1 ATU/mL 組；c. 4 ATU/mL 組；d. 7 ATU/mL 組
Figure3. The tube formation observations of different groups (Inverted phase contrast microscope×100)a. Control group; b. 1 ATU/mL group ; c. 4 ATU/mL group; d. 7 ATU/mL group
2.4 細胞 VEGF 和 Notch1 表達測定
熒光染色檢測示，對照組及 1、4、7 ATU/mL 組 Notch1 表達量分別為 181.33±6.65、183.33±7.50、263.00±7.93、141.00±8.88。與對照組比較，1、4 ATU/mL 組 Notch1 表達量增高，7 ATU/mL 組降低；其中 4、7 ATU/mL 組與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），1 ATU/mL 組與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；1、4、7 ATU/mL 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
各組 Notch1 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 1 ATU/mL 組；c. 4 ATU/mL 組；d. 7 ATU/mL 組
Figure4. The Notch1 expressions of different groups by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×200)a. Control group; b. 1 ATU/mL group; c. 4 ATU/mL group; d. 7 ATU/mL group
對照組及 1、4、7 ATU/mL 組 VEGF 表達量分別為 88.60±5.50、184.00±11.53、283.33±16.16、176.33±9.71。1、4、7 ATU/mL 組 VEGF 表達量均較對照組增高，差異有統計學意義（P<0.05）；4 ATU/mL 組高于 1、7 ATU/mL 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而 1、7 ATU/mL 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
各組 VEGF 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 1 ATU/mL 組；c. 4 ATU/mL 組；d. 7 ATU/mL 組
Figure5. The VEGF expressions of different groups by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×200)a. Control group;b. 1 ATU/mL group; c. 4 ATU/mL group; d. 7 ATU/mL group
3 討論
國內外研究已證實，水蛭素可以改善動物微循環[11-12]，但其改善血運的機制尚不清楚。1992 年 Donayre 等[13]的研究證實水蛭素抗凝作用遠優于肝素，其作用不依賴凝血酶Ⅲ，可以直接與凝血酶結合，特異性強。而凝血酶有致炎作用，Huang 等[14]研究發現 EGFR 是凝血酶導致炎癥的重要調節點。近年在腫瘤學領域，Turpin 等[15]和 Xu 等[16]發現凝血酶具有通過炎性反應促進腫瘤生長的作用，因此反向分析水蛭素可能是通過拮抗凝血酶抑制各種炎性因子。結合國內外文獻和本課題組前期研究結果，我們分析水蛭素除了通過拮抗凝血酶起到抗炎作用外，可能還具有直接促進微血管再生的作用。
本課題組既往研究主要采用鼠皮瓣淤血模型，本次改用細胞三維培養技術。主要原因為，傳統單層培養細胞在體外環境會逐漸喪失原有性狀，不能產生體內細胞外基質屏障，生長特性與體內差異較大[17]。而動物實驗雖在體內進行，但由于體內多種因素制約以及體內和外界環境相互影響，不能觀察中間細胞生長過程，其為研究重點關注內容。而細胞三維培養技術能模擬人體內微環境，培養細胞呈立體生長，更接近于人體內自然生長環境[18]，填補了單層細胞培養和動物實驗的不足[19]。近年來，國內外一些研究者已通過各種細胞三維培養模型來研究人類疾病的發生發展規律[20]。
VEGF-Notch 信號通路是經典的促血管生成分子通路，可以使人多功能干細胞分化成 HMVECs [21]。本實驗采用細胞三維培養模型，通過細胞增殖實驗、成管實驗和免疫熒光染色直接測定水蛭素作用下 HMVECs 的 VEGF、Notch1 表達情況，結果提示天然水蛭素可能通過上調 VEGF-Notch 信號通路，促進細胞增殖和微血管形成。同時，我們也觀察到這種促進作用僅在 1、4 ATU/mL 濃度時明顯。隨著藥物濃度的增加，VEGF-Notch 信號通路表達量開始下降并逐漸轉向抑制，且高濃度水蛭素明顯抑制細胞增長，分析可能與高濃度水蛭素開始表現抗炎作用有關。當水蛭素表現抗炎作用抑制各種炎性因子釋放時，也抑制了促進細胞增殖的 VEGF、Notch1 等再生因子的作用。
免疫熒光染色觀察發現 3 個濃度的天然水蛭素均能促進 HMVECs 分泌 VEGF。但是僅 4 ATU/mL 濃度天然水蛭素能促進 HMVECs 分泌 Notch1，1 ATU/mL 濃度時促進作用不明顯，而濃度為 7 ATU/mL 時表現為抑制作用。我們分析 VEGF 是 Notch1 的上游因子[10]，所以低濃度天然水蛭素作用時，VEGF 受體敏感性較高，開始釋放 VEGF；當濃度達 4 ATU/mL 時，大量釋放的 VEGF 刺激下游 Notch1 受體釋放 Notch1。而濃度為 7 ATU/mL 時，天然水蛭素主要表現為抗炎作用，VEGF 受體開始關閉，雖然細胞中還殘存大量 VEGF，但不能達到下游 Notch1 受體的閾值，導致下游 Notch1 受體關閉，進而 Notch1 表達水平下降。
綜上述，天然水蛭素濃度為 4 ATU/mL 時，可能通過 VEGF-Notch 信號通路促進 HMVECs 增殖及血管生成；而濃度為 7 ATU/mL 時則主要通過拮抗凝血酶和抗炎改善微循環，對 HMVECs 的增殖和微血管生成起抑制作用。但天然水蛭素通過 VEGF-Notch 信號通路促進血管生成的作用機制仍不明確；VEGF-Notch 信號通路與其他細胞增殖通路的是否存在交互作用，也需進一步研究探討。
天然水蛭素為水蛭的主要成分，臨床首先將其用于治療血栓類疾病。近年來研究發現，天然水蛭素還具有抗炎、改善循環、促進血管生成等作用，進一步擴展了臨床應用范圍[1-2]。本課題組研究發現，天然水蛭素能緩解微動脈壁痙攣、擴張血管、加快血液循環，通過刺激內皮細胞釋放 VEGF 來促進微血管生成[3]。有研究者[4]還發現，天然水蛭素具有促進內皮細胞釋放 VEGF 和提高在淤血皮瓣局部起抗炎作用的超氧化物歧化酶含量，且效果優于重組水蛭素。Pan 等[5]的相關作用機制研究證實，天然水蛭素可通過調節 p38、MAPK 和 ERK 分子的交互作用，促進大鼠缺血皮瓣模型的血管生成。
Notch 信號通路在人血管形成中起重要作用[6]，它有 4 個受體（Notch1、2、3、4）[7]。Notch 信號通路被配體激活后釋放 Notch 胞內段，進入細胞核激活 Notch 下游靶基因。人體中只有 Notch1 和 Notch4 在血管內皮表達，研究表明敲除 Notch1 會導致缺少血管重塑必需的原始血管叢[8]，其在后天血管形成中起重要作用[9]。而 VEGF 作為 Notch 信號通路的上游啟動因子共同參與了血管形成過程[10]。本實驗擬探究天然水蛭素是否通過 VEGF-Notch 信號通路，發揮促人微血管內皮細胞（human microvascular endothelial cells，HMVECs）增殖和血管再生的作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
HMVECs 購自北京北納創聯生物技術研究院。天然水蛭素（南寧市凈雪皇生物工程有限公司）；Matrigel 基質膠（Corning 公司，美國）；VEGF 抗體、Notch1 抗體（Abcam 公司，英國）；H-DMEM 培養液、FBS（Thermo Fisher 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）。
血管生成載玻片（Ibidi 公司，德國）；超凈工作臺、細胞培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）；低溫高速離心機（Eppendorf 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；37℃ 溫水浴箱（寧波新芝生物科技股份有限公司）；酶標儀（Synergy 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞三維培養模型制備及分組
取 Matrigel 基質膠 4℃ 過夜后，轉移至血管生成載玻片，每孔 10 μL，置于 37℃ 培養箱 20 min，使液態基質膠凝固。取 HMVECs 以胰蛋白酶消化后，采用含 10%FBS 的 DMEM 培養基制成密度為 2×105個/mL 的細胞懸液，并充分混勻；將已成膠的血管生成載玻片置于冰上，每孔接種 50 μL 細胞懸液后，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 24 h，制備細胞三維培養模型，倒置相差顯微鏡下觀察細胞成管情況。
取細胞三維培養模型，隨機分為不同濃度天然水蛭素培養組（1、4、7 ATU/mL 組）以及單純含 10%FBS 的 DMEM 培養基培養組（對照組）。各組細胞三維培養模型加入對應培養基后，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，于相應時間點取標本進行觀察。
1.2.2 CCK-8 細胞增殖實驗
培養 24、48、72 h 后，各組取 6 個復孔分別加入 5 μL CCK-8 溶液，繼續培養 2 h 后，用酶標儀測定 450 nm 處吸光度（A）值。以無細胞的單純培養基作為空白對照。實驗重復 3 次。
1.2.3 細胞成管實驗
培養 24 h 后，各組取 6 個復孔，倒置相差顯微鏡下觀察細胞成管情況，并應用 Image J 軟件計數成管數量。
1.2.4 免疫熒光染色測定 VEGF 和 Notch1 表達
培養 24 h 后，各組取 6 個復孔，細胞回收液收集細胞并接種至細胞爬片。細胞爬片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min；4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 浸洗；0.5%TritonX-100 室溫通透 20 min。滴加正常山羊血清封閉后，滴加稀釋的一抗（VEGF、Notch1）、4℃ 過夜；滴加熒光二抗，1 h 后 PBST 洗 2 次、每次 2 min；滴加 DAPI 復染，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片。最后，置于熒光顯微鏡下觀察，呈綠色熒光為陽性染色細胞。
1.3 統計學方法
采用 SPSS25.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05
2 結果
2.1 細胞三維培養模型構建觀察
HMVECs 接種至基質膠三維培養至 24 h 時，細胞基本形成血管腔隙結構，形態規則，成管情況較好。見圖 1。
圖1
三維培養 24 h 后倒置相差顯微鏡下觀察 HMVECs （×200）
Figure1.
HMVECs observation by inverted phase contrast micro scope at 24 hours after three-dimensional culture (×200)
2.2 CCK-8 細胞增殖實驗
各時間點，1、4 ATU/mL 組 A 值均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），提示該濃度天然水蛭素促進細胞增殖。其中，24 h 時 4 ATU/mL 組A 值高于 1 ATU/mL 組，差異有統計學意義（P<0.05）；而 48、72 h 時兩組A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）。各時間點，7 ATU/mL 組A 值顯著低于其他 3 組，組間差異均有統計學意義（P<0.05），提示該濃度天然水蛭素抑制細胞增殖。見圖 2。
圖2
CCK-8 檢測 HMVECs 生長曲線
Figure2.
The growth curve of HMVECs by CCK-8
2.3 細胞成管實驗
培養 24 h，對照組及 1、4、7 ATU/mL 組成管數量分別為（3.33±0.57）、（5.66±1.52）、（9.33±1.15）、（3.00±1.00）個。1、4 ATU/mL 組成管數較對照組及 7 ATU/mL 組明顯增多，4 ATU/mL 組多于 1 ATU/mL 組，差異有統計學意義（P<0.05）。而 7 ATU/mL 組與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
各組細胞成管實驗觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 對照組；b. 1 ATU/mL 組；c. 4 ATU/mL 組；d. 7 ATU/mL 組
Figure3. The tube formation observations of different groups (Inverted phase contrast microscope×100)a. Control group; b. 1 ATU/mL group ; c. 4 ATU/mL group; d. 7 ATU/mL group
2.4 細胞 VEGF 和 Notch1 表達測定
熒光染色檢測示，對照組及 1、4、7 ATU/mL 組 Notch1 表達量分別為 181.33±6.65、183.33±7.50、263.00±7.93、141.00±8.88。與對照組比較，1、4 ATU/mL 組 Notch1 表達量增高，7 ATU/mL 組降低；其中 4、7 ATU/mL 組與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），1 ATU/mL 組與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；1、4、7 ATU/mL 組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
各組 Notch1 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 1 ATU/mL 組；c. 4 ATU/mL 組；d. 7 ATU/mL 組
Figure4. The Notch1 expressions of different groups by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×200)a. Control group; b. 1 ATU/mL group; c. 4 ATU/mL group; d. 7 ATU/mL group
對照組及 1、4、7 ATU/mL 組 VEGF 表達量分別為 88.60±5.50、184.00±11.53、283.33±16.16、176.33±9.71。1、4、7 ATU/mL 組 VEGF 表達量均較對照組增高，差異有統計學意義（P<0.05）；4 ATU/mL 組高于 1、7 ATU/mL 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而 1、7 ATU/mL 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
各組 VEGF 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
a. 對照組；b. 1 ATU/mL 組；c. 4 ATU/mL 組；d. 7 ATU/mL 組
Figure5. The VEGF expressions of different groups by immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×200)a. Control group;b. 1 ATU/mL group; c. 4 ATU/mL group; d. 7 ATU/mL group
3 討論
國內外研究已證實，水蛭素可以改善動物微循環[11-12]，但其改善血運的機制尚不清楚。1992 年 Donayre 等[13]的研究證實水蛭素抗凝作用遠優于肝素，其作用不依賴凝血酶Ⅲ，可以直接與凝血酶結合，特異性強。而凝血酶有致炎作用，Huang 等[14]研究發現 EGFR 是凝血酶導致炎癥的重要調節點。近年在腫瘤學領域，Turpin 等[15]和 Xu 等[16]發現凝血酶具有通過炎性反應促進腫瘤生長的作用，因此反向分析水蛭素可能是通過拮抗凝血酶抑制各種炎性因子。結合國內外文獻和本課題組前期研究結果，我們分析水蛭素除了通過拮抗凝血酶起到抗炎作用外，可能還具有直接促進微血管再生的作用。
本課題組既往研究主要采用鼠皮瓣淤血模型，本次改用細胞三維培養技術。主要原因為，傳統單層培養細胞在體外環境會逐漸喪失原有性狀，不能產生體內細胞外基質屏障，生長特性與體內差異較大[17]。而動物實驗雖在體內進行，但由于體內多種因素制約以及體內和外界環境相互影響，不能觀察中間細胞生長過程，其為研究重點關注內容。而細胞三維培養技術能模擬人體內微環境，培養細胞呈立體生長，更接近于人體內自然生長環境[18]，填補了單層細胞培養和動物實驗的不足[19]。近年來，國內外一些研究者已通過各種細胞三維培養模型來研究人類疾病的發生發展規律[20]。
VEGF-Notch 信號通路是經典的促血管生成分子通路，可以使人多功能干細胞分化成 HMVECs [21]。本實驗采用細胞三維培養模型，通過細胞增殖實驗、成管實驗和免疫熒光染色直接測定水蛭素作用下 HMVECs 的 VEGF、Notch1 表達情況，結果提示天然水蛭素可能通過上調 VEGF-Notch 信號通路，促進細胞增殖和微血管形成。同時，我們也觀察到這種促進作用僅在 1、4 ATU/mL 濃度時明顯。隨著藥物濃度的增加，VEGF-Notch 信號通路表達量開始下降并逐漸轉向抑制，且高濃度水蛭素明顯抑制細胞增長，分析可能與高濃度水蛭素開始表現抗炎作用有關。當水蛭素表現抗炎作用抑制各種炎性因子釋放時，也抑制了促進細胞增殖的 VEGF、Notch1 等再生因子的作用。
免疫熒光染色觀察發現 3 個濃度的天然水蛭素均能促進 HMVECs 分泌 VEGF。但是僅 4 ATU/mL 濃度天然水蛭素能促進 HMVECs 分泌 Notch1，1 ATU/mL 濃度時促進作用不明顯，而濃度為 7 ATU/mL 時表現為抑制作用。我們分析 VEGF 是 Notch1 的上游因子[10]，所以低濃度天然水蛭素作用時，VEGF 受體敏感性較高，開始釋放 VEGF；當濃度達 4 ATU/mL 時，大量釋放的 VEGF 刺激下游 Notch1 受體釋放 Notch1。而濃度為 7 ATU/mL 時，天然水蛭素主要表現為抗炎作用，VEGF 受體開始關閉，雖然細胞中還殘存大量 VEGF，但不能達到下游 Notch1 受體的閾值，導致下游 Notch1 受體關閉，進而 Notch1 表達水平下降。
綜上述，天然水蛭素濃度為 4 ATU/mL 時，可能通過 VEGF-Notch 信號通路促進 HMVECs 增殖及血管生成；而濃度為 7 ATU/mL 時則主要通過拮抗凝血酶和抗炎改善微循環，對 HMVECs 的增殖和微血管生成起抑制作用。但天然水蛭素通過 VEGF-Notch 信號通路促進血管生成的作用機制仍不明確；VEGF-Notch 信號通路與其他細胞增殖通路的是否存在交互作用，也需進一步研究探討。
