引用本文： 尹剛, 劉蔡鉞, 林耀發, 謝錚, 侯春林, 林浩東. 脂肪干細胞來源外泌體對周圍神經損傷后再生作用的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(12): 1592-1596. doi: 10.7507/1002-1892.201707051 復制
周圍神經損傷在臨床上極為常見，每年因創傷導致的周圍神經損傷患者超過 50 萬例，約占所有創傷患者總數的 2.8%[1]。周圍神經損傷后常導致肢體運動和感覺功能障礙，給患者的生活和工作帶來嚴重影響。周圍神經損傷的修復主要采用顯微縫合方法，但臨床效果欠佳。近年來，國內外學者對如何促進周圍神經損傷修復進行了大量研究，如利用電刺激、NGF、BMSCs 等治療[2-3]，雖然具有一定作用，但效果仍不滿意。因此，進一步探索周圍神經再生機制，尋找新的治療靶點，探索新的治療方法，是提高周圍神經損傷治療效果的重要方向。外泌體是細胞內多泡體與細胞膜融合后釋放到細胞外基質中的一種膜性囊泡[4]。近年研究發現，脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）與雪旺細胞（Schwann cells，SCs）共培養后，能上調髓鞘相關指標，進而對神經損傷修復再生起到一定作用[5]。另有多名學者發現多種干細胞來源的外泌體均可促進損傷的神經組織修復[6-8]。因此，本研究擬觀察 ADSCs 來源外泌體對坐骨神經損傷后再生的作用，為臨床應用外泌體治療周圍神經損傷奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年 SD 大鼠 40 只，雌雄不限，體質量 220～240 g，由海軍軍醫大學（第二軍醫大學）動物實驗中心提供。
戊巴比妥鈉（上海科豐化學試劑有限公司）；TUNEL 試劑盒（Roche 公司，瑞士）；外泌體提取試劑盒（和光公司，日本）。酶標儀（Thermo 公司，美國）；LE2202S 型電子天平（Sartorius 公司，德國）；Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；LeicaDC500 病理圖像分析系統（Leica 公司，德國）；H-7650 透射電鏡（Hitachi 公司，日本）。
1.2 ADSCs 來源外泌體的提取及分析
取 4 只 SD 大鼠斷頸處死，固定于解剖平板上。① 參照 Nielsen 等[9]和張靜等[10]的方法分離 ADSCs。無菌環境下取大鼠腹股溝脂肪組織，剪碎至糊狀，PBS 洗滌 1 次，以 300×g 離心 3 min；棄上清，加入 0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃ 水浴消化 60 min，待組織塊沉淀后吸取上清液至另一 5 mL 離心管，用含 10%FBS 的 L-DMEM 終止消化，以 400×g 離心 5 min；棄上清液，用含 10%FBS 的 L-DMEM 重懸沉淀后接種至一 6 cm 培養皿中，37℃、5%CO2 培養箱中培養，24 h 首次換培養液，以后每 3 天換液 1 次。② 參照 Hervera 等[7]的方法提取外泌體。取上述第 3 代對數生長期 ADSCs，用無血清 L-DMEM 繼續培養，待細胞匯合度達 70%～80% 時，FBS 洗滌，經 0.22 μm 濾膜過濾，將濾液經 100 000×g 離心 18 h，去除上清液，用外泌體提取試劑盒提取外泌體。采用 BCA 法對提取的外泌體進行蛋白濃度定量分析，于 750 nm 波長下用酶標儀測吸光度（A）值，根據 BCA 標準曲線測得外泌體蛋白濃度標準曲線。采用納米粒子追蹤分析技術（nanosight tracking analysis，NTA）檢測外泌體直徑分布。
1.3 大鼠坐骨神經損傷模型建立及分組
將 36 只 SD 大鼠隨機分成 3 組，每組 12 只。A 組為正常對照組，B 組為坐骨神經擠壓損傷組，C 組為 ADSCs 來源外泌體治療坐骨神經擠壓損傷組。將所有大鼠以 2.5% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，取俯臥位，于左側股后正中行縱切口，長約 1 cm，分離皮下肌肉，暴露坐骨神經。A 組距坐骨結節 6～8 mm 處標記后縫合切口；B、C 組距坐骨結節 6～8 mm 處用大止血鉗上兩扣夾閉坐骨神經干，造成坐骨神經擠壓損傷模型，縫合切口[11]。術后次日開始，A、B 組大鼠尾靜脈注射 PBS 液 200 μL，C 組大鼠尾靜脈注射含 100 μg（蛋白量）ADSCs 來源外泌體的 PBS 液 200 μL；每周注射 1 次，持續 12 周。注射結束 1 周后（造模 13 周時）處死大鼠，取標記或損傷處上、下 2 mm 坐骨神經進行觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
術后觀察實驗大鼠存活、切口愈合、肌肉萎縮及后肢運動情況。
1.4.2 組織學觀察
取各組坐骨神經置于甲醛固定，石蠟包埋、切片，片厚 4 μm，取部分切片行常規 HE 染色，鏡下觀察神經束情況。
1.4.3 TUNEL 檢測 SCs 凋亡
將上述各組坐骨神經組織切片脫蠟，按 TUNEL 試劑盒方法染色后，鏡下觀察 SCs 細胞凋亡情況，凋亡細胞核呈棕褐色顆粒。采用 Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，于 400 倍下取 5 個視野計數凋亡細胞，取均值。
1.4.4 透射電鏡觀察 SCs 自噬情況
取各組坐骨神經組織置于 2.5% 戊二醛固定，制備電鏡樣品，透射電鏡下觀察 SCs 自噬情況。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs 來源外泌體相關分析
BCA 定量分析測得 ADSCs 來源外泌體蛋白濃度為 1.44 μg/mL。見圖 1。
圖1
ADSCs 來源外泌體的 BCA 標準曲線
Figure1.
BCA standard curve of the exosomes from ADSCs
根據 NTA 檢測外泌體直徑分布和數量，外泌體平均直徑約為 86.07 nm，濃度為 1.83×107個/mL；檢測外泌體分布可知 30.56% 外泌體直徑介于 60～80 nm，68.31% 外泌體直徑介于 80～100 nm。見表 1。
表1
ADSCs 來源外泌體分布
Table1.
Distribution of the exosomes from ADSCs
2.2 大體觀察
動物造模術后第 1 天開始進食；13 周時切口愈合良好，無感染發生。A 組左下肢無明顯異常，行走功能正常。B、C 組足趾癱瘓，張開受限，肌肉萎縮，小腿前側萎縮較后側明顯；其中，C 組癱瘓、足趾攣縮及肌肉萎縮程度均輕于 B 組，且行走功能好于 B 組。見圖 2。
圖2
造模后 13 周各組動物大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. Gross observation of animals at 13 weeks after modelinga. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3 組織學觀察
HE 染色示，A 組神經束排列緊密完整，束膜形態規則；與 A 組相比，B 組神經束形態破壞、束膜不規則，有較多無細胞結構和組織碎片；與 B 組相比，C 組神經束內損傷減輕，神經束膜較完整、有序，但其完整性不及 A 組。見圖 3。
圖3
造模后 13 周各組坐骨神經 HE 染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure3. HE staining of sciatic nerve at 13 weeks after modeling (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.4 TUNEL 檢測細胞凋亡
A、B、C 組 SCs 凋亡細胞數分別為（8.40±1.72）、（49.60±5.38）、（23.80±4.93）個/視野；B、C 組顯著多于 A 組，B 組顯著多于 C 組，差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 4。
圖4
造模后 13 周 TUNEL 法檢測各組坐骨神經 SCs 凋亡情況（×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. TUNEL staining of SCs apoptosis in sciatic nerve at 13 weeks after modeling (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.5 透射電鏡觀察 SCs 自噬情況
透射電鏡觀察示，A 組大鼠坐骨神經中 SCs 細胞核完整，無明顯自噬體；與 A 組相比，B 組 SCs 自噬體數量明顯增多，細胞核變形；與 B 組相比，C 組 SCs 自噬體數量明顯減少，細胞核呈圓形。見圖 5。
圖5
造模后 13 周透射電鏡觀察各組坐骨神經 SCs 自噬情況（×10 k）
a. A組；b. B組；c. C組
Figure5. Transmission electron microscope observation of SCs autophagy in sciatic nerve at 13 weeks after modeling (×10 k)a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 討論
周圍神經損傷后常導致肢體運動和感覺功能障礙，嚴重影響患者的生活和工作。由于神經損傷后再生速度緩慢，軸突需要相當長的時間才能再生到達靶器官，在靶器官重新獲得神經支配之前，肌肉可能已發生不可逆萎縮[12-13]。此外，周圍神經損傷后，脊髓運動神經元和脊神經節的感覺神經元因失去與周圍靶器官的聯系而死亡[14-15]，這些因素均嚴重影響了周圍神經損傷后的再生效果。因此，進一步探索治療周圍神經損傷新方法，如何加速周圍神經損傷后軸突再生，是急需解決的重要問題。
外泌體包含的生物活性物質在組織損傷中具有修復作用，為臨床治療組織損傷提供了新思路[16-17]。近年研究發現，ADSCs 與 SCs 共培養后能上調髓鞘相關指標，進而對損傷神經的再生起到一定作用[5]。另有研究發現多種干細胞來源的外泌體均可促進神經再生修復[18]，但是 ADSCs 分泌的外泌體是否可以促進周圍神經的再生目前未見相關報道。鑒于此，我們將 ADSCs 來源外泌體注入坐骨神經損傷的 SD 大鼠體內，通過大體觀察、神經纖維束髓鞘再生情況及 SCs 凋亡和自噬等指標，來評價其對大鼠坐骨神經損傷后再生的作用。結果發現與 B 組相比，C 組大鼠損傷患肢的肌肉萎縮較輕，坐骨神經束膜較完整，纖維束再生良好，SCs 凋亡顯著降低，自噬減輕。表明 ADSCs 來源外泌體可以促進大鼠坐骨神經損傷后的纖維再生。
此外，我們在本實驗中還發現，大鼠坐骨神經損傷后給予 ADSCs 來源外泌體治療后，SCs 內自噬體明顯減少。而在周圍神經損傷修復過程中，SCs 發揮了關鍵作用[19]。周圍神經損傷后經歷一系列復雜變化，局部發生瓦勒變性，其核心變化是髓鞘和軸突的崩解，SCs 自噬作為瓦勒變性的開始，在周圍神經損傷后的一系列病理生理變化過程中起到了重要作用[20]。早期，SCs 通過自噬作用清除瓦勒變性所產生的壞死組織；后期，SCs 逐漸增生，在各類蛋白及黏附分子作用下，使排列紊亂、無序的 SCs 重新排列，形成有序管道結構—Büngner 帶，引導神經元再生的軸突在其中生長并到達效應器[21]。本研究結果提示，ADSCs 來源外泌體在周圍神經損傷修復過程中起重要作用，通過減少 SCs 凋亡、減輕其自噬作用并促進 Büngner 帶形成，有利于神經元軸突再生，從而加速周圍神經損傷的修復。
周圍神經損傷在臨床上極為常見，每年因創傷導致的周圍神經損傷患者超過 50 萬例，約占所有創傷患者總數的 2.8%[1]。周圍神經損傷后常導致肢體運動和感覺功能障礙，給患者的生活和工作帶來嚴重影響。周圍神經損傷的修復主要采用顯微縫合方法，但臨床效果欠佳。近年來，國內外學者對如何促進周圍神經損傷修復進行了大量研究，如利用電刺激、NGF、BMSCs 等治療[2-3]，雖然具有一定作用，但效果仍不滿意。因此，進一步探索周圍神經再生機制，尋找新的治療靶點，探索新的治療方法，是提高周圍神經損傷治療效果的重要方向。外泌體是細胞內多泡體與細胞膜融合后釋放到細胞外基質中的一種膜性囊泡[4]。近年研究發現，脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）與雪旺細胞（Schwann cells，SCs）共培養后，能上調髓鞘相關指標，進而對神經損傷修復再生起到一定作用[5]。另有多名學者發現多種干細胞來源的外泌體均可促進損傷的神經組織修復[6-8]。因此，本研究擬觀察 ADSCs 來源外泌體對坐骨神經損傷后再生的作用，為臨床應用外泌體治療周圍神經損傷奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年 SD 大鼠 40 只，雌雄不限，體質量 220～240 g，由海軍軍醫大學（第二軍醫大學）動物實驗中心提供。
戊巴比妥鈉（上海科豐化學試劑有限公司）；TUNEL 試劑盒（Roche 公司，瑞士）；外泌體提取試劑盒（和光公司，日本）。酶標儀（Thermo 公司，美國）；LE2202S 型電子天平（Sartorius 公司，德國）；Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；LeicaDC500 病理圖像分析系統（Leica 公司，德國）；H-7650 透射電鏡（Hitachi 公司，日本）。
1.2 ADSCs 來源外泌體的提取及分析
取 4 只 SD 大鼠斷頸處死，固定于解剖平板上。① 參照 Nielsen 等[9]和張靜等[10]的方法分離 ADSCs。無菌環境下取大鼠腹股溝脂肪組織，剪碎至糊狀，PBS 洗滌 1 次，以 300×g 離心 3 min；棄上清，加入 0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃ 水浴消化 60 min，待組織塊沉淀后吸取上清液至另一 5 mL 離心管，用含 10%FBS 的 L-DMEM 終止消化，以 400×g 離心 5 min；棄上清液，用含 10%FBS 的 L-DMEM 重懸沉淀后接種至一 6 cm 培養皿中，37℃、5%CO2 培養箱中培養，24 h 首次換培養液，以后每 3 天換液 1 次。② 參照 Hervera 等[7]的方法提取外泌體。取上述第 3 代對數生長期 ADSCs，用無血清 L-DMEM 繼續培養，待細胞匯合度達 70%～80% 時，FBS 洗滌，經 0.22 μm 濾膜過濾，將濾液經 100 000×g 離心 18 h，去除上清液，用外泌體提取試劑盒提取外泌體。采用 BCA 法對提取的外泌體進行蛋白濃度定量分析，于 750 nm 波長下用酶標儀測吸光度（A）值，根據 BCA 標準曲線測得外泌體蛋白濃度標準曲線。采用納米粒子追蹤分析技術（nanosight tracking analysis，NTA）檢測外泌體直徑分布。
1.3 大鼠坐骨神經損傷模型建立及分組
將 36 只 SD 大鼠隨機分成 3 組，每組 12 只。A 組為正常對照組，B 組為坐骨神經擠壓損傷組，C 組為 ADSCs 來源外泌體治療坐骨神經擠壓損傷組。將所有大鼠以 2.5% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，取俯臥位，于左側股后正中行縱切口，長約 1 cm，分離皮下肌肉，暴露坐骨神經。A 組距坐骨結節 6～8 mm 處標記后縫合切口；B、C 組距坐骨結節 6～8 mm 處用大止血鉗上兩扣夾閉坐骨神經干，造成坐骨神經擠壓損傷模型，縫合切口[11]。術后次日開始，A、B 組大鼠尾靜脈注射 PBS 液 200 μL，C 組大鼠尾靜脈注射含 100 μg（蛋白量）ADSCs 來源外泌體的 PBS 液 200 μL；每周注射 1 次，持續 12 周。注射結束 1 周后（造模 13 周時）處死大鼠，取標記或損傷處上、下 2 mm 坐骨神經進行觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
術后觀察實驗大鼠存活、切口愈合、肌肉萎縮及后肢運動情況。
1.4.2 組織學觀察
取各組坐骨神經置于甲醛固定，石蠟包埋、切片，片厚 4 μm，取部分切片行常規 HE 染色，鏡下觀察神經束情況。
1.4.3 TUNEL 檢測 SCs 凋亡
將上述各組坐骨神經組織切片脫蠟，按 TUNEL 試劑盒方法染色后，鏡下觀察 SCs 細胞凋亡情況，凋亡細胞核呈棕褐色顆粒。采用 Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，于 400 倍下取 5 個視野計數凋亡細胞，取均值。
1.4.4 透射電鏡觀察 SCs 自噬情況
取各組坐骨神經組織置于 2.5% 戊二醛固定，制備電鏡樣品，透射電鏡下觀察 SCs 自噬情況。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs 來源外泌體相關分析
BCA 定量分析測得 ADSCs 來源外泌體蛋白濃度為 1.44 μg/mL。見圖 1。
圖1
ADSCs 來源外泌體的 BCA 標準曲線
Figure1.
BCA standard curve of the exosomes from ADSCs
根據 NTA 檢測外泌體直徑分布和數量，外泌體平均直徑約為 86.07 nm，濃度為 1.83×107個/mL；檢測外泌體分布可知 30.56% 外泌體直徑介于 60～80 nm，68.31% 外泌體直徑介于 80～100 nm。見表 1。
表1
ADSCs 來源外泌體分布
Table1.
Distribution of the exosomes from ADSCs
2.2 大體觀察
動物造模術后第 1 天開始進食；13 周時切口愈合良好，無感染發生。A 組左下肢無明顯異常，行走功能正常。B、C 組足趾癱瘓，張開受限，肌肉萎縮，小腿前側萎縮較后側明顯；其中，C 組癱瘓、足趾攣縮及肌肉萎縮程度均輕于 B 組，且行走功能好于 B 組。見圖 2。
圖2
造模后 13 周各組動物大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. Gross observation of animals at 13 weeks after modelinga. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3 組織學觀察
HE 染色示，A 組神經束排列緊密完整，束膜形態規則；與 A 組相比，B 組神經束形態破壞、束膜不規則，有較多無細胞結構和組織碎片；與 B 組相比，C 組神經束內損傷減輕，神經束膜較完整、有序，但其完整性不及 A 組。見圖 3。
圖3
造模后 13 周各組坐骨神經 HE 染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure3. HE staining of sciatic nerve at 13 weeks after modeling (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.4 TUNEL 檢測細胞凋亡
A、B、C 組 SCs 凋亡細胞數分別為（8.40±1.72）、（49.60±5.38）、（23.80±4.93）個/視野；B、C 組顯著多于 A 組，B 組顯著多于 C 組，差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 4。
圖4
造模后 13 周 TUNEL 法檢測各組坐骨神經 SCs 凋亡情況（×400）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. TUNEL staining of SCs apoptosis in sciatic nerve at 13 weeks after modeling (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.5 透射電鏡觀察 SCs 自噬情況
透射電鏡觀察示，A 組大鼠坐骨神經中 SCs 細胞核完整，無明顯自噬體；與 A 組相比，B 組 SCs 自噬體數量明顯增多，細胞核變形；與 B 組相比，C 組 SCs 自噬體數量明顯減少，細胞核呈圓形。見圖 5。
圖5
造模后 13 周透射電鏡觀察各組坐骨神經 SCs 自噬情況（×10 k）
a. A組；b. B組；c. C組
Figure5. Transmission electron microscope observation of SCs autophagy in sciatic nerve at 13 weeks after modeling (×10 k)a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 討論
周圍神經損傷后常導致肢體運動和感覺功能障礙，嚴重影響患者的生活和工作。由于神經損傷后再生速度緩慢，軸突需要相當長的時間才能再生到達靶器官，在靶器官重新獲得神經支配之前，肌肉可能已發生不可逆萎縮[12-13]。此外，周圍神經損傷后，脊髓運動神經元和脊神經節的感覺神經元因失去與周圍靶器官的聯系而死亡[14-15]，這些因素均嚴重影響了周圍神經損傷后的再生效果。因此，進一步探索治療周圍神經損傷新方法，如何加速周圍神經損傷后軸突再生，是急需解決的重要問題。
外泌體包含的生物活性物質在組織損傷中具有修復作用，為臨床治療組織損傷提供了新思路[16-17]。近年研究發現，ADSCs 與 SCs 共培養后能上調髓鞘相關指標，進而對損傷神經的再生起到一定作用[5]。另有研究發現多種干細胞來源的外泌體均可促進神經再生修復[18]，但是 ADSCs 分泌的外泌體是否可以促進周圍神經的再生目前未見相關報道。鑒于此，我們將 ADSCs 來源外泌體注入坐骨神經損傷的 SD 大鼠體內，通過大體觀察、神經纖維束髓鞘再生情況及 SCs 凋亡和自噬等指標，來評價其對大鼠坐骨神經損傷后再生的作用。結果發現與 B 組相比，C 組大鼠損傷患肢的肌肉萎縮較輕，坐骨神經束膜較完整，纖維束再生良好，SCs 凋亡顯著降低，自噬減輕。表明 ADSCs 來源外泌體可以促進大鼠坐骨神經損傷后的纖維再生。
此外，我們在本實驗中還發現，大鼠坐骨神經損傷后給予 ADSCs 來源外泌體治療后，SCs 內自噬體明顯減少。而在周圍神經損傷修復過程中，SCs 發揮了關鍵作用[19]。周圍神經損傷后經歷一系列復雜變化，局部發生瓦勒變性，其核心變化是髓鞘和軸突的崩解，SCs 自噬作為瓦勒變性的開始，在周圍神經損傷后的一系列病理生理變化過程中起到了重要作用[20]。早期，SCs 通過自噬作用清除瓦勒變性所產生的壞死組織；后期，SCs 逐漸增生，在各類蛋白及黏附分子作用下，使排列紊亂、無序的 SCs 重新排列，形成有序管道結構—Büngner 帶，引導神經元再生的軸突在其中生長并到達效應器[21]。本研究結果提示，ADSCs 來源外泌體在周圍神經損傷修復過程中起重要作用，通過減少 SCs 凋亡、減輕其自噬作用并促進 Büngner 帶形成，有利于神經元軸突再生，從而加速周圍神經損傷的修復。
