引用本文： 郭尚春, 趙麗萍, 陶詩聰, 張長青. 胞外囊泡在細菌致病機制中作用的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(12): 1597-1604. doi: 10.7507/1002-1892.201805075 復制
地球上所有生物的細胞，無論是包含人類細胞在內的真核細胞，還是沒有核膜或其他膜組分的原核細胞（例如細菌細胞），均可產生納米尺度的脂雙層囊泡[1]。這些進化上保守的囊泡由球形的磷脂雙層膜構成，內含生物活性物質，例如蛋白、脂質、核酸和代謝產物[2]。用來形容這些囊泡的術語有很多，例如用于古細菌和革蘭陽性菌（G+ 菌）來源的膜泡，革蘭陰性菌（G– 菌）來源的外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs），哺乳動物細胞的外泌體和微泡等[3]。近年來為了便于學術交流，學術界將這些位于細胞外的囊泡統稱為胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）[1-3]。
革蘭染色把細菌分為 G+ 菌和 G– 菌兩大類，G+ 菌主要包括葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、白喉桿菌和破傷風桿菌等，G– 菌主要包括痢疾桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、百日咳桿菌、霍亂弧菌及腦膜炎雙球菌等。據此，將細菌 EVs 根據來源分為 G+ 菌 EVs（G+-EVs）和 G–-EVs 兩類，其中因 G--EVs 起源于外膜更常被稱作 OMVs，故采用 OMVs 來指代 G–-EVs[3]。細菌間通過 EVs 相互交流，這種通過 EVs 的內容物進行細胞間信息交流的方式，在進化進程中高度保守，無論是細菌還是高等生物的細胞中均存在，可能是一種高效而經濟的細胞間協同工作方式[1]。細菌 EVs 可以通過介導細菌-細菌和細菌-宿主間相互作用，在生理和病理功能中發揮重要作用[4]。
抗生素的大量使用導致耐藥菌群持續增加和快速傳播，抗生素治療細菌性疾病的有效性受到了挑戰。細菌來源 EVs 在細菌感染類疾病的臨床診斷、藥物治療和疫苗預防方面的研究日新月異。本文就細菌 EVs 的生物學特點及其在細菌致病過程中的作用和臨床應用前景進行總結和展望。
1 G+-EVs
1.1 G+-EVs 的生成
2009 年，Lee 等[5] 首次從金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的培養上清液中分離出 G+-EVs。這些 EVs 直徑為 20～100 nm，具有球形脂雙層膜結構。之后，對其他 G+-EVs 的研究越來越多，炭疽芽孢桿菌[4]、天藍色鏈霉菌[6]、李斯特菌[7]、產氣莢膜梭菌[8]、枯草芽孢桿菌[9]、變形鏈球菌[10] 和肺炎鏈球菌[11] 等均可產生 EVs，其形成過程在進化上高度保守。
1.2 G+-EVs 的組分
對于真核生物 EVs 組分和作用機制的研究日漸深入[2, 12-13]，對 G+-EVs 特異性脂質、核酸和蛋白質等組分的分析和分子作用機制的解析迫在眉睫。脂質組學分析顯示 G+-EVs 由多種脂肪酸組成：特異性桿菌和肺炎鏈球菌 EVs 富含飽和脂肪酸，如肉豆蔻酸和棕櫚酸[4, 11]；產氣莢膜梭菌 EVs 含有 α-毒素和核酸[8]。變形鏈球菌在生物膜形成中主動釋放含 DNA 的 EVs，這些 EVs 有助于生物膜形成并影響其結構完整性和穩定性，是齲齒的主要致病因子[10]。蛋白質組學分析表明，金黃色葡萄球菌 EVs 含有 90 個囊泡蛋白，富含膜表面相關或胞外毒力蛋白，包括 β-內酰胺酶、凝固酶溶血素、IgG 結合蛋白和 N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶。這些 G+-EVs 因含有核酸、毒素脂蛋白和酶等組分，在細菌感染的發病機制中發揮重要作用[12, 14]。
2 OMVs
2.1 OMVs 的生成
早在 20 世紀 60 年代，OMVs 就被發現存在于大腸桿菌的培養基中，細菌通過釋放囊泡適應環境，通過 OMVs 傳遞細胞外膜蛋白、毒力因子和抗原等作用于宿主細胞[1]。Chatterjee 等[15] 在研究對數生長期霍亂弧菌的超微結構時，發現在液體培養基無菌濾液中有 G– 菌細胞壁出芽形成的囊泡。OMVs 是細菌外膜在一定機制下出芽于細菌表面形成的一種囊泡狀結構[16]，普遍存在于 G– 菌中[8, 17]，產生于細菌任何生長階段，但是它們的產量或組分會受環境影響[18]。
2.2 OMVs 的組分
有研究證實，OMVs 包含有外膜蛋白、脂蛋白、磷脂和脂多糖、核酸和其他毒力因子[3, 19]。早期通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和 Western blot 等進行蛋白分析發現，OMVs 中存在豐富的外膜蛋白、周質蛋白以及毒力因子[20-21]，經蛋白質組學檢測發現其含有的蛋白超過 3 500 種[3]。
Horstman 等[22] 首先報道了產腸毒素大腸桿菌 OMVs 的主要脂質成分為甘油磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和心磷脂。而 Chowdhury 等[23] 對丁香假單胞菌 OMVs 進行脂質組學分析，發現偶數碳鏈磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺是其囊泡雙層膜的主要組分。
OMVs 攜帶有囊泡內和囊泡膜表面 DNA[24]，由于囊泡內 DNA 對 DNase 處理有抗性，因此 DNase 處理是區分這兩種 DNA 的有效方法[20]。通過這種方法，已經在來自淋病奈瑟球菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌 OMVs 中鑒定了幾種 DNA[20, 25-27]，且有研究報道淋球菌 OMVs 內存在 RNA 酶抗性 RNA[25]。但細菌如何將特定 DNA 和 RNA 整合并分選到囊泡中，其詳細機制有待進一步闡明。
3 細菌 EVs 在其致病機制中的可能作用
細菌的毒力分為侵襲力和細菌毒素。構成侵襲力的主要物質有細菌的酶、莢膜及其他表面結構物質；細菌毒素分為外毒素和內毒素兩大類。
3.1 G+-EVs 在細菌感染中的作用
現有證據表明具有厚壁細胞壁的 G+ 菌生產 EVs，這些囊泡含有重要毒力因子，可以導致宿主細胞死亡；但在某些情況下，可以引發免疫反應保護機體，但 G+-EVs 經過厚壁細胞壁分泌到細胞外的生成機制和內容物的調控問題仍未闡明[2]。關于隱球菌的研究發現，其細胞壁的孔徑從 50 nm 到 500 nm 不等[28]，與 G+-EVs 直徑相當，可能是 G+-EVs 通過細胞壁的潛在渠道。在新型隱球菌中，誘導黑化導致細胞壁孔徑減小，可能與質膜和細胞壁間的囊泡累積有關，這可以解釋 EVs 釋放所需的孔徑偏小[28-29]。通過細胞壁重塑來促進 EVs 分泌，結果取決于分泌信號的響應；或者說，EVs 釋放可能發生在細胞壁的自然“折點”，如子代細胞出芽的薄弱區[30]。EVs 可能會通過細胞壁重塑酶對細胞壁進行重塑，其內含物中搭載有細胞壁重塑酶，如 β-葡糖苷酶和內切酶，其活性的增加利于 EVs 通過細胞壁[31-33]。這種機制可能是普遍的，如金黃色葡萄球菌 EVs 攜帶肽聚糖降解酶，可以促使其穿透富含肽聚糖的 G+ 菌細胞壁[5]。
3.2 OMVs 在細菌感染中的作用
幾乎所有 G– 菌均能分泌 OMVs[34]，通過囊泡介導激活靶細胞或通過將功能性分子轉移到受體細胞，在細菌-細菌和細菌-宿主相互作用中發揮重要作用[26-27]，有助于生物膜形成、在細菌間遞送生物分子、殺滅競爭性微生物細胞、對環境中的物理化學壓力做出反應、為細菌細胞提供營養、具有防御和抵抗等功能[21]，以各種方式影響宿主細胞[20, 35-37]。
3.2.1 OMVs 介導的細菌-宿主相互作用
由于靶細胞類型、細菌種類和 OMVs 數量不同，OMVs 介導的細菌-宿主相互作用有非免疫原性反應、促炎性反應和細胞毒性反應等[34]。
① 非免疫原性反應：體外研究報道了 OMVs 主要刺激上皮細胞、內皮細胞和各種免疫細胞活性[35-36, 38]。囊泡的不同黏附素靶向黏附不同宿主細胞，例如黏膜炎莫拉菌 OMVs 的黏附素，幽門螺桿菌 OMVs 的外膜蛋白血型抗原結合黏附素和空泡細胞毒素，以及銅綠假單胞菌 OMVs 的氨肽酶[12]。OMVs 可能被神經節苷脂、脂筏或微囊蛋白介導的內吞作用所整合[12]。
② 促炎性反應：有研究報道了不可分型流感嗜血桿菌 OMVs 含有多種毒力相關蛋白，OMVs 除了能傳遞 DNA 之外，還能侵入上皮細胞誘導炎性因子表達和抗菌肽釋放[39]。Bauman 等[40] 提取了銅綠假單胞菌標準株和臨床株的 OMVs，證實了兩者 OMVs 均能引起細胞炎性反應。
OMVs 內含的脂多糖可介導模式識別受體表達的巨噬細胞和內皮細胞中的強炎性反應[36, 38]。能激活 Caspase-11 的大多數 G– 菌并不進入細胞質，有研究發現 OMVs 可作為載體遞送脂多糖，通過內吞作用進入宿主細胞質，脂多糖從 OMVs 釋放進入細胞質，在體外和體內實驗中觸發 Caspase-11 依賴性免疫反應，對宿主防御 G– 菌感染和敗血癥的發病極為重要[41]。
通過小鼠腹腔給藥或大鼠連續灌注大腸桿菌 OMVs 可誘發敗血癥樣癥狀[42-43]，來自黏膜炎莫拉菌和肺炎克雷伯菌的 OMVs 通過誘導肺中的嗜中性粒細胞淋巴細胞浸潤誘發肺部炎癥[44-45]。腹膜內注射大腸桿菌 OMVs 較之等量純化的脂多糖能更有效地通過 Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）和細胞間黏附分子 1 依賴性方式誘導免疫球蛋白濾過[38]。此外，不使用任何活細菌，可以經鼻內給予銅綠假單胞菌 OMVs，即可通過 TLR2 和 TLR4 誘發肺部炎癥[46]。
③ 細胞毒性反應：幾種 OMVs 已顯示出它們的毒力因子，如白細胞毒素、腺苷酸環化酶-溶血素和溶細胞素 A 的細胞毒性作用[47-49]；來源于嗜肺軍團菌和銅綠假單胞菌的 OMVs 具有蛋白水解酶和脂解酶活性[35, 50]，銅綠假單胞菌 OMVs 傳遞多種毒素誘發人支氣管上皮細胞的細胞毒性[35]；來自大腸桿菌的 OMVs，是導致旅客腹瀉和第三世界國家嬰兒高死亡率的普遍原因，這些 OMVs 將熱不穩定腸毒素轉移到腎上腺和腎上腺受體腸上皮細胞，通過膜抗性結構域的胞吞作用和觸發器激活 NF-kB 通路發揮作用[51-52]。
純化的 OMVs[53] 作為一種分泌系統，傳遞細菌的毒力因子作用于原核和真核細胞，OMVs 中含有病原相關分子和其他組分，因此 OMVs 能影響細菌的感染和激活宿主體內免疫應答[54]。由于 OMVs 可以強烈誘發先天性和適應性免疫反應，它們作為抗感染疫苗的潛在用途已被廣泛關注[34, 55]。近年，基于 OMVs 針對腦膜炎奈瑟菌的疫苗在歐洲臨床批準使用[56]。Norheim 等[57] 研究證實，腦膜炎奈瑟菌 OMVs 可幫助機體有效預防腦膜炎，為開發安全可靠的腦膜炎奈瑟菌疫苗提供了依據。
3.2.2 生物膜形成
生物膜是包裹在胞外聚合物質中有組織的多細胞群落，能駐留細菌以破壞免疫力和抗菌劑。金黃色葡萄球菌可能通過 EVs 阻止其他細菌的表面黏附而促進自身傳播，經金黃色葡萄球菌 EVs 處理過的表面親水性明顯增加，不但可以使鮑曼不動桿菌黏附到材料表面產生的生物膜減少達 93%，也可以使其他幾種細菌病原體的生物膜減少 40%～70%[58]，EVs 在生物膜的形成和感染中發揮重要作用[59]。Yonezawa 等[60] 發現，幽門螺桿菌 OMVs 促進生物膜形成，從而增強細菌致病性。有 OMVs 通過提供利于血紅素作用的蛋白或者作為成核位點與細胞外 DNA 作用，促成生物膜的形成[12, 34, 60]。銅綠假單胞菌 OMVs 是生物膜基質的組分，銅綠假單胞菌菌株 PA01 的生物膜基質成分與 OMVs 相關，OMVs 可能通過與不同生物膜相互作用而參與生物膜形成[61]。OMVs 在生物膜形成中可能是沉積在表面上，借以調節后面的細菌黏附；也可能與生物膜基質包括蛋白質、胞外多糖和 DNA 等相互作用，借此加強生物膜的結構完整性。
3.2.3 遞送生物分子
G– 菌利用 OMVs 進行信號傳遞，調控微生物環境和細菌本身行為，通過遺傳轉移增加細菌的遺傳多樣性[12, 36]。
銅綠假單胞菌毒力因子主要集中在早期 T 淋巴細胞活化（early T lymphocyte activation，ETA）蛋白酶等，ETA 可裂解酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）中的尼克酰胺部分，催化核糖與延伸因子共價結合，阻斷核糖體密碼移動過程，從而阻止細胞蛋白合成，致使組織壞死，形成局部或全身疾病[62]。有研究證實銅綠假單胞菌 OMVs 中同樣存在 ETA，可以通過 OMVs 將 ETA 運輸到靶細胞，還利用 OMVs 運輸假單胞菌喹諾酮信號分子[63]。此外，OMVs 的脂多糖和蛋白質組分等通過協同作用誘導巨噬細胞中的細胞因子表達[36]，白細胞毒素和脂多糖經 OMVs 傳遞較之其他形式更有效[24, 38, 47]。
有研究通過分析大腸桿菌 OMVs 對小鼠全身性和肺部炎癥給藥的動力學，發現 OMVs 可以作為體內長距離通訊的有效載體[64]。Kahn 等[65] 研究發現，流感嗜血桿菌 OMVs 能幫助細菌間的 DNA 傳遞，但是在不同種類細菌間或者不同環境下宿主間的遺傳交換尚未得到證實[66]。
3.2.4 影響細菌的存活和相應環境變化
一方面，OMVs 可以通過部分削減機體補體反應支持細菌存活，如來自黏膜炎莫拉菌野生型臨床菌株 OMVs 可以結合補體 C3 蛋白，與泛表面蛋白 A1/A2 缺陷型菌株的 OMVs 相比，能更大程度上抵消補體級聯，抑制補體依賴性殺傷流感嗜血桿菌作用，維持流感嗜血桿菌存活[67]。OMVs 的釋放數量與細胞膜中蛋白質積累的水平直接相關，應激物質攻擊或有毒錯誤折疊蛋白質積累增強時，機體通過將錯誤折疊的蛋白質優先包裝到囊泡中進行選擇性消除，增強細菌在環境突變中的存活能力[68]。OMVs 還以其他方式影響細菌存活，如攜帶 β-內酰胺酶的銅綠假單胞菌 OMVs 可以瞬時增強對 β-內酰胺敏感的鄰近細菌的耐藥性[69]。
另一方面，OMVs 可以殺死競爭細菌，如銅綠假單胞菌 OMVs 通過遞送細胞壁蛋白水解酶降解肽聚糖來殺死競爭性細菌[12, 70]；溶菌纖維素菌通過分泌含細菌內肽酶 OMVs，殺死其他競爭性 G– 菌[71]。
南極假交替單胞菌 NF3 積累大量高蛋白質含量的胞外聚合物質，其 OMVs 的蛋白質組學分析發現，這些蛋白與 G– 菌中營養物加工和運輸有關的外膜蛋白等相作用，可作為營養物傳感器和轉運蛋白來促進營養素的利用[72]，而 OMVs 相關的多藥外排泵也可能導致抗生素耐藥[20]。韓瑟勒巴通菌 OMVs 的結合蛋白有助于減少有毒血紅素的細胞濃度[73]。
4 細菌 EVs 在臨床應用中的潛能
EVs 促使細菌間生物分子的交換，對這種信息交流方式的認知增加了對感染性疾病發生發展的理解。
4.1 疫苗研制
細菌感染仍然是導致人類患病和死亡的主要原因之一[74-75]。由于耐藥菌的增加和快速傳播，疫苗被認為是后抗生素時代應對細菌性疾病最直接有效的策略[76]。由于 OMVs 不能復制且含有大量細菌抗原，并能有效激活免疫系統，含有的脂多糖可作為自身佐劑，而且作為非復制性疫苗具有一定安全性，這些因素促使 OMVs 成為開發非復制性高效疫苗的熱門選擇[36]。
Petersen 等[77] 用類鼻疽伯克菌 OMVs 免疫獼猴，結果表明該 OMVs 能夠激活體內免疫反應，提供針對相關蛋白和脂多糖的體液免疫保護，且臨床檢測數據顯示獼猴的肝、腎功能指標并未受影響，免疫后注射部位也未出現紅斑、腫脹和壞死等現象，這使類鼻疽伯克菌 OMVs 具有進一步研發為人類疫苗的可能。
Roier 等[78] 發現用流感嗜血桿菌 OMVs 滴鼻免疫小鼠，不僅可以誘導其產生強大的黏膜免疫和體液免疫反應，還可以保護小鼠免受異源流感嗜血桿菌的感染。他們還嘗試用多殺性巴氏桿菌 OMVs 和溶血性曼氏桿菌 OMVs 共同滴鼻免疫小鼠，結果表明混合 OMVs 可以同時誘導產生強大的特異性黏膜免疫及體液免疫反應[79]，提示可以開發多聯 OMVs 疫苗來抵御混合性細菌感染引發的疾病。
4.2 細菌生物膜的形成抑制
近年大量研究證實，許多難愈性疾病，如肺囊性纖維化、慢性呼吸道感染、慢性泌尿系統感染、骨髓炎、心內膜炎、中耳炎、前列腺炎、牙周炎以及某些腎結石的形成等，大都與細菌生物膜有關[80]。在形成細菌生物膜的這些細菌之間存在相互傳遞細胞信號的 EVs[58]，目前還沒有一種真正徹底有效的治療細菌生物膜類疾病的方法，如果能夠合成出干擾這些信號傳遞 EVs 的藥物，破壞細菌生物膜的形成，將有利于治療那些例如植入物感染等頑固性的感染。
4.3 疾病的早期診斷和檢測
天然 OMVs 是細菌在正常生長狀態下自然釋放到周圍環境中，包含完整的外膜抗原及天然構象。細菌經培養可以很容易獲得大量 OMVs，而且通過基因工程手段改造細菌可進一步修飾 OMVs。有研究報道[81]，將一種天然脂蛋白用作融合伴侶以將納米熒光素酶包裝在 OMVs 內，用于凝血酶檢測，檢測限為 0.5 nm，基于 OMVs 設計的用于抗原結合和信號生成的多功能傳感器，與其他檢測方法相當。利用熒光蛋白標記這些生物工程化生成的 OMVs 對癌細胞顯像，有望達到早期診斷目的。
4.4 藥物治療
OMVs 包含殺死其他細菌的死亡信息，如胞壁質水解酶，在 OMVs 中富集，結合目標細菌，然后降解其細菌壁的肽聚糖和輸送囊泡內容物，引發目標細菌死亡[70, 82]。慶大霉素是一種抑制細菌蛋白質合成的抗生素，常用于治療銅綠假單胞菌感染，如果志賀菌載有慶大霉素，不僅載有慶大霉素的 OMVs 產率增加，且療效得到了增強[16, 82]。
來自食源性大腸桿菌的 OMVs 促進沙門菌的基因轉移，并由其表達沙門菌或大腸桿菌毒性引發腸道炎。OMVs 轉化細菌并非只是增強了細胞毒性，還可以增強細菌對氨芐青霉素的抗性[83]。
因此，OMVs 可能成為臨床上預后和生物標志物的有效工具，且有望成為一種能夠通過藥理學屏障的自身來源藥物載體。
5 小結與展望
細菌性疾病是導致每年數百萬人感染死亡的全球性和主要公共衛生問題，隨著許多病原體耐藥性的增加，非常需要開發新的治療藥劑和方法。
通過開發有效的無佐劑疫苗可以最好地管理傳染病，但疫苗在遞送時具有侵入性，需要優化當前的疫苗遞送系統。研究者們發現 OMVs 在免疫應答中有著特殊作用[84]，可激發宿主的免疫應答，為菌體獲得營養物質和優勢生存條件[76]，并且因帶有細菌特異的外膜蛋白能有效刺激巨噬細胞因子分泌，可以作為一種新型疫苗的潛在載體。由于 OMVs 可以由眾多 G– 菌產生，基于 OMVs 的納米載體在免疫治療中具有廣泛應用前景。
生物膜基質通過介導細菌的表面附著、細胞聚集成簇和聚集體穩定，在其形成中發揮各種重要的作用，而 EVs 是生物膜基質的重要組分，通過控制生物膜基質中 EVs，充分利用各 EVs 數據庫，或將突破生物膜特異性適應性抵抗，尋找到抵抗高度耐藥生物膜的方法。
源于自體的 EVs 應用可能是朝向個性化藥物的第一步，其副作用非常小并且療效和特異性高。盡管 OMVs 已被用作多功能且安全的疫苗以及耐受性良好的輸送系統，但將其 EVs 用于臨床仍然存在許多問題，例如來源的安全性和 EVs 衍生抗原的正確構象，未來需要解決的另一個重要問題是其可靠和可重復的分離和純化以及穩健的分析。正在快速發展的生物技術與臨床試驗相結合，有望促成 EVs 在未來感染治療中作為診斷工具，且因為 EVs 具有對人體屏障的滲透作用和增加抗生素療效的作用，可應用于植入物感染的防治。OMVs 也被設計用于其他治療，例如具有良好耐受低內毒性的藥物載體。
生物和仿生療法是一類相對較新的系統，它們或具有生物來源，或可利用、模仿生理途徑以增強靶向作用。盡管大量研究表明 OMVs 具有良好的臨床應用前景，但對 OMVs 的產生機制及其與宿主相互作用的機制還不十分了解，未經任何改造的 OMVs 仍會存在一定毒性。所以未來對于破譯病原體本身與宿主之間的復雜交流，針對 OMVs 各種模塊進行靶向功能設計，發展抗傳染因子的治療策略，應用于臨床的早期診斷、藥物治療和細菌感染預防，還有許多工作需要完成。
地球上所有生物的細胞，無論是包含人類細胞在內的真核細胞，還是沒有核膜或其他膜組分的原核細胞（例如細菌細胞），均可產生納米尺度的脂雙層囊泡[1]。這些進化上保守的囊泡由球形的磷脂雙層膜構成，內含生物活性物質，例如蛋白、脂質、核酸和代謝產物[2]。用來形容這些囊泡的術語有很多，例如用于古細菌和革蘭陽性菌（G+ 菌）來源的膜泡，革蘭陰性菌（G– 菌）來源的外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs），哺乳動物細胞的外泌體和微泡等[3]。近年來為了便于學術交流，學術界將這些位于細胞外的囊泡統稱為胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）[1-3]。
革蘭染色把細菌分為 G+ 菌和 G– 菌兩大類，G+ 菌主要包括葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、白喉桿菌和破傷風桿菌等，G– 菌主要包括痢疾桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、百日咳桿菌、霍亂弧菌及腦膜炎雙球菌等。據此，將細菌 EVs 根據來源分為 G+ 菌 EVs（G+-EVs）和 G–-EVs 兩類，其中因 G--EVs 起源于外膜更常被稱作 OMVs，故采用 OMVs 來指代 G–-EVs[3]。細菌間通過 EVs 相互交流，這種通過 EVs 的內容物進行細胞間信息交流的方式，在進化進程中高度保守，無論是細菌還是高等生物的細胞中均存在，可能是一種高效而經濟的細胞間協同工作方式[1]。細菌 EVs 可以通過介導細菌-細菌和細菌-宿主間相互作用，在生理和病理功能中發揮重要作用[4]。
抗生素的大量使用導致耐藥菌群持續增加和快速傳播，抗生素治療細菌性疾病的有效性受到了挑戰。細菌來源 EVs 在細菌感染類疾病的臨床診斷、藥物治療和疫苗預防方面的研究日新月異。本文就細菌 EVs 的生物學特點及其在細菌致病過程中的作用和臨床應用前景進行總結和展望。
1 G+-EVs
1.1 G+-EVs 的生成
2009 年，Lee 等[5] 首次從金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的培養上清液中分離出 G+-EVs。這些 EVs 直徑為 20～100 nm，具有球形脂雙層膜結構。之后，對其他 G+-EVs 的研究越來越多，炭疽芽孢桿菌[4]、天藍色鏈霉菌[6]、李斯特菌[7]、產氣莢膜梭菌[8]、枯草芽孢桿菌[9]、變形鏈球菌[10] 和肺炎鏈球菌[11] 等均可產生 EVs，其形成過程在進化上高度保守。
1.2 G+-EVs 的組分
對于真核生物 EVs 組分和作用機制的研究日漸深入[2, 12-13]，對 G+-EVs 特異性脂質、核酸和蛋白質等組分的分析和分子作用機制的解析迫在眉睫。脂質組學分析顯示 G+-EVs 由多種脂肪酸組成：特異性桿菌和肺炎鏈球菌 EVs 富含飽和脂肪酸，如肉豆蔻酸和棕櫚酸[4, 11]；產氣莢膜梭菌 EVs 含有 α-毒素和核酸[8]。變形鏈球菌在生物膜形成中主動釋放含 DNA 的 EVs，這些 EVs 有助于生物膜形成并影響其結構完整性和穩定性，是齲齒的主要致病因子[10]。蛋白質組學分析表明，金黃色葡萄球菌 EVs 含有 90 個囊泡蛋白，富含膜表面相關或胞外毒力蛋白，包括 β-內酰胺酶、凝固酶溶血素、IgG 結合蛋白和 N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶。這些 G+-EVs 因含有核酸、毒素脂蛋白和酶等組分，在細菌感染的發病機制中發揮重要作用[12, 14]。
2 OMVs
2.1 OMVs 的生成
早在 20 世紀 60 年代，OMVs 就被發現存在于大腸桿菌的培養基中，細菌通過釋放囊泡適應環境，通過 OMVs 傳遞細胞外膜蛋白、毒力因子和抗原等作用于宿主細胞[1]。Chatterjee 等[15] 在研究對數生長期霍亂弧菌的超微結構時，發現在液體培養基無菌濾液中有 G– 菌細胞壁出芽形成的囊泡。OMVs 是細菌外膜在一定機制下出芽于細菌表面形成的一種囊泡狀結構[16]，普遍存在于 G– 菌中[8, 17]，產生于細菌任何生長階段，但是它們的產量或組分會受環境影響[18]。
2.2 OMVs 的組分
有研究證實，OMVs 包含有外膜蛋白、脂蛋白、磷脂和脂多糖、核酸和其他毒力因子[3, 19]。早期通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和 Western blot 等進行蛋白分析發現，OMVs 中存在豐富的外膜蛋白、周質蛋白以及毒力因子[20-21]，經蛋白質組學檢測發現其含有的蛋白超過 3 500 種[3]。
Horstman 等[22] 首先報道了產腸毒素大腸桿菌 OMVs 的主要脂質成分為甘油磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和心磷脂。而 Chowdhury 等[23] 對丁香假單胞菌 OMVs 進行脂質組學分析，發現偶數碳鏈磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺是其囊泡雙層膜的主要組分。
OMVs 攜帶有囊泡內和囊泡膜表面 DNA[24]，由于囊泡內 DNA 對 DNase 處理有抗性，因此 DNase 處理是區分這兩種 DNA 的有效方法[20]。通過這種方法，已經在來自淋病奈瑟球菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌 OMVs 中鑒定了幾種 DNA[20, 25-27]，且有研究報道淋球菌 OMVs 內存在 RNA 酶抗性 RNA[25]。但細菌如何將特定 DNA 和 RNA 整合并分選到囊泡中，其詳細機制有待進一步闡明。
3 細菌 EVs 在其致病機制中的可能作用
細菌的毒力分為侵襲力和細菌毒素。構成侵襲力的主要物質有細菌的酶、莢膜及其他表面結構物質；細菌毒素分為外毒素和內毒素兩大類。
3.1 G+-EVs 在細菌感染中的作用
現有證據表明具有厚壁細胞壁的 G+ 菌生產 EVs，這些囊泡含有重要毒力因子，可以導致宿主細胞死亡；但在某些情況下，可以引發免疫反應保護機體，但 G+-EVs 經過厚壁細胞壁分泌到細胞外的生成機制和內容物的調控問題仍未闡明[2]。關于隱球菌的研究發現，其細胞壁的孔徑從 50 nm 到 500 nm 不等[28]，與 G+-EVs 直徑相當，可能是 G+-EVs 通過細胞壁的潛在渠道。在新型隱球菌中，誘導黑化導致細胞壁孔徑減小，可能與質膜和細胞壁間的囊泡累積有關，這可以解釋 EVs 釋放所需的孔徑偏小[28-29]。通過細胞壁重塑來促進 EVs 分泌，結果取決于分泌信號的響應；或者說，EVs 釋放可能發生在細胞壁的自然“折點”，如子代細胞出芽的薄弱區[30]。EVs 可能會通過細胞壁重塑酶對細胞壁進行重塑，其內含物中搭載有細胞壁重塑酶，如 β-葡糖苷酶和內切酶，其活性的增加利于 EVs 通過細胞壁[31-33]。這種機制可能是普遍的，如金黃色葡萄球菌 EVs 攜帶肽聚糖降解酶，可以促使其穿透富含肽聚糖的 G+ 菌細胞壁[5]。
3.2 OMVs 在細菌感染中的作用
幾乎所有 G– 菌均能分泌 OMVs[34]，通過囊泡介導激活靶細胞或通過將功能性分子轉移到受體細胞，在細菌-細菌和細菌-宿主相互作用中發揮重要作用[26-27]，有助于生物膜形成、在細菌間遞送生物分子、殺滅競爭性微生物細胞、對環境中的物理化學壓力做出反應、為細菌細胞提供營養、具有防御和抵抗等功能[21]，以各種方式影響宿主細胞[20, 35-37]。
3.2.1 OMVs 介導的細菌-宿主相互作用
由于靶細胞類型、細菌種類和 OMVs 數量不同，OMVs 介導的細菌-宿主相互作用有非免疫原性反應、促炎性反應和細胞毒性反應等[34]。
① 非免疫原性反應：體外研究報道了 OMVs 主要刺激上皮細胞、內皮細胞和各種免疫細胞活性[35-36, 38]。囊泡的不同黏附素靶向黏附不同宿主細胞，例如黏膜炎莫拉菌 OMVs 的黏附素，幽門螺桿菌 OMVs 的外膜蛋白血型抗原結合黏附素和空泡細胞毒素，以及銅綠假單胞菌 OMVs 的氨肽酶[12]。OMVs 可能被神經節苷脂、脂筏或微囊蛋白介導的內吞作用所整合[12]。
② 促炎性反應：有研究報道了不可分型流感嗜血桿菌 OMVs 含有多種毒力相關蛋白，OMVs 除了能傳遞 DNA 之外，還能侵入上皮細胞誘導炎性因子表達和抗菌肽釋放[39]。Bauman 等[40] 提取了銅綠假單胞菌標準株和臨床株的 OMVs，證實了兩者 OMVs 均能引起細胞炎性反應。
OMVs 內含的脂多糖可介導模式識別受體表達的巨噬細胞和內皮細胞中的強炎性反應[36, 38]。能激活 Caspase-11 的大多數 G– 菌并不進入細胞質，有研究發現 OMVs 可作為載體遞送脂多糖，通過內吞作用進入宿主細胞質，脂多糖從 OMVs 釋放進入細胞質，在體外和體內實驗中觸發 Caspase-11 依賴性免疫反應，對宿主防御 G– 菌感染和敗血癥的發病極為重要[41]。
通過小鼠腹腔給藥或大鼠連續灌注大腸桿菌 OMVs 可誘發敗血癥樣癥狀[42-43]，來自黏膜炎莫拉菌和肺炎克雷伯菌的 OMVs 通過誘導肺中的嗜中性粒細胞淋巴細胞浸潤誘發肺部炎癥[44-45]。腹膜內注射大腸桿菌 OMVs 較之等量純化的脂多糖能更有效地通過 Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）和細胞間黏附分子 1 依賴性方式誘導免疫球蛋白濾過[38]。此外，不使用任何活細菌，可以經鼻內給予銅綠假單胞菌 OMVs，即可通過 TLR2 和 TLR4 誘發肺部炎癥[46]。
③ 細胞毒性反應：幾種 OMVs 已顯示出它們的毒力因子，如白細胞毒素、腺苷酸環化酶-溶血素和溶細胞素 A 的細胞毒性作用[47-49]；來源于嗜肺軍團菌和銅綠假單胞菌的 OMVs 具有蛋白水解酶和脂解酶活性[35, 50]，銅綠假單胞菌 OMVs 傳遞多種毒素誘發人支氣管上皮細胞的細胞毒性[35]；來自大腸桿菌的 OMVs，是導致旅客腹瀉和第三世界國家嬰兒高死亡率的普遍原因，這些 OMVs 將熱不穩定腸毒素轉移到腎上腺和腎上腺受體腸上皮細胞，通過膜抗性結構域的胞吞作用和觸發器激活 NF-kB 通路發揮作用[51-52]。
純化的 OMVs[53] 作為一種分泌系統，傳遞細菌的毒力因子作用于原核和真核細胞，OMVs 中含有病原相關分子和其他組分，因此 OMVs 能影響細菌的感染和激活宿主體內免疫應答[54]。由于 OMVs 可以強烈誘發先天性和適應性免疫反應，它們作為抗感染疫苗的潛在用途已被廣泛關注[34, 55]。近年，基于 OMVs 針對腦膜炎奈瑟菌的疫苗在歐洲臨床批準使用[56]。Norheim 等[57] 研究證實，腦膜炎奈瑟菌 OMVs 可幫助機體有效預防腦膜炎，為開發安全可靠的腦膜炎奈瑟菌疫苗提供了依據。
3.2.2 生物膜形成
生物膜是包裹在胞外聚合物質中有組織的多細胞群落，能駐留細菌以破壞免疫力和抗菌劑。金黃色葡萄球菌可能通過 EVs 阻止其他細菌的表面黏附而促進自身傳播，經金黃色葡萄球菌 EVs 處理過的表面親水性明顯增加，不但可以使鮑曼不動桿菌黏附到材料表面產生的生物膜減少達 93%，也可以使其他幾種細菌病原體的生物膜減少 40%～70%[58]，EVs 在生物膜的形成和感染中發揮重要作用[59]。Yonezawa 等[60] 發現，幽門螺桿菌 OMVs 促進生物膜形成，從而增強細菌致病性。有 OMVs 通過提供利于血紅素作用的蛋白或者作為成核位點與細胞外 DNA 作用，促成生物膜的形成[12, 34, 60]。銅綠假單胞菌 OMVs 是生物膜基質的組分，銅綠假單胞菌菌株 PA01 的生物膜基質成分與 OMVs 相關，OMVs 可能通過與不同生物膜相互作用而參與生物膜形成[61]。OMVs 在生物膜形成中可能是沉積在表面上，借以調節后面的細菌黏附；也可能與生物膜基質包括蛋白質、胞外多糖和 DNA 等相互作用，借此加強生物膜的結構完整性。
3.2.3 遞送生物分子
G– 菌利用 OMVs 進行信號傳遞，調控微生物環境和細菌本身行為，通過遺傳轉移增加細菌的遺傳多樣性[12, 36]。
銅綠假單胞菌毒力因子主要集中在早期 T 淋巴細胞活化（early T lymphocyte activation，ETA）蛋白酶等，ETA 可裂解酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）中的尼克酰胺部分，催化核糖與延伸因子共價結合，阻斷核糖體密碼移動過程，從而阻止細胞蛋白合成，致使組織壞死，形成局部或全身疾病[62]。有研究證實銅綠假單胞菌 OMVs 中同樣存在 ETA，可以通過 OMVs 將 ETA 運輸到靶細胞，還利用 OMVs 運輸假單胞菌喹諾酮信號分子[63]。此外，OMVs 的脂多糖和蛋白質組分等通過協同作用誘導巨噬細胞中的細胞因子表達[36]，白細胞毒素和脂多糖經 OMVs 傳遞較之其他形式更有效[24, 38, 47]。
有研究通過分析大腸桿菌 OMVs 對小鼠全身性和肺部炎癥給藥的動力學，發現 OMVs 可以作為體內長距離通訊的有效載體[64]。Kahn 等[65] 研究發現，流感嗜血桿菌 OMVs 能幫助細菌間的 DNA 傳遞，但是在不同種類細菌間或者不同環境下宿主間的遺傳交換尚未得到證實[66]。
3.2.4 影響細菌的存活和相應環境變化
一方面，OMVs 可以通過部分削減機體補體反應支持細菌存活，如來自黏膜炎莫拉菌野生型臨床菌株 OMVs 可以結合補體 C3 蛋白，與泛表面蛋白 A1/A2 缺陷型菌株的 OMVs 相比，能更大程度上抵消補體級聯，抑制補體依賴性殺傷流感嗜血桿菌作用，維持流感嗜血桿菌存活[67]。OMVs 的釋放數量與細胞膜中蛋白質積累的水平直接相關，應激物質攻擊或有毒錯誤折疊蛋白質積累增強時，機體通過將錯誤折疊的蛋白質優先包裝到囊泡中進行選擇性消除，增強細菌在環境突變中的存活能力[68]。OMVs 還以其他方式影響細菌存活，如攜帶 β-內酰胺酶的銅綠假單胞菌 OMVs 可以瞬時增強對 β-內酰胺敏感的鄰近細菌的耐藥性[69]。
另一方面，OMVs 可以殺死競爭細菌，如銅綠假單胞菌 OMVs 通過遞送細胞壁蛋白水解酶降解肽聚糖來殺死競爭性細菌[12, 70]；溶菌纖維素菌通過分泌含細菌內肽酶 OMVs，殺死其他競爭性 G– 菌[71]。
南極假交替單胞菌 NF3 積累大量高蛋白質含量的胞外聚合物質，其 OMVs 的蛋白質組學分析發現，這些蛋白與 G– 菌中營養物加工和運輸有關的外膜蛋白等相作用，可作為營養物傳感器和轉運蛋白來促進營養素的利用[72]，而 OMVs 相關的多藥外排泵也可能導致抗生素耐藥[20]。韓瑟勒巴通菌 OMVs 的結合蛋白有助于減少有毒血紅素的細胞濃度[73]。
4 細菌 EVs 在臨床應用中的潛能
EVs 促使細菌間生物分子的交換，對這種信息交流方式的認知增加了對感染性疾病發生發展的理解。
4.1 疫苗研制
細菌感染仍然是導致人類患病和死亡的主要原因之一[74-75]。由于耐藥菌的增加和快速傳播，疫苗被認為是后抗生素時代應對細菌性疾病最直接有效的策略[76]。由于 OMVs 不能復制且含有大量細菌抗原，并能有效激活免疫系統，含有的脂多糖可作為自身佐劑，而且作為非復制性疫苗具有一定安全性，這些因素促使 OMVs 成為開發非復制性高效疫苗的熱門選擇[36]。
Petersen 等[77] 用類鼻疽伯克菌 OMVs 免疫獼猴，結果表明該 OMVs 能夠激活體內免疫反應，提供針對相關蛋白和脂多糖的體液免疫保護，且臨床檢測數據顯示獼猴的肝、腎功能指標并未受影響，免疫后注射部位也未出現紅斑、腫脹和壞死等現象，這使類鼻疽伯克菌 OMVs 具有進一步研發為人類疫苗的可能。
Roier 等[78] 發現用流感嗜血桿菌 OMVs 滴鼻免疫小鼠，不僅可以誘導其產生強大的黏膜免疫和體液免疫反應，還可以保護小鼠免受異源流感嗜血桿菌的感染。他們還嘗試用多殺性巴氏桿菌 OMVs 和溶血性曼氏桿菌 OMVs 共同滴鼻免疫小鼠，結果表明混合 OMVs 可以同時誘導產生強大的特異性黏膜免疫及體液免疫反應[79]，提示可以開發多聯 OMVs 疫苗來抵御混合性細菌感染引發的疾病。
4.2 細菌生物膜的形成抑制
近年大量研究證實，許多難愈性疾病，如肺囊性纖維化、慢性呼吸道感染、慢性泌尿系統感染、骨髓炎、心內膜炎、中耳炎、前列腺炎、牙周炎以及某些腎結石的形成等，大都與細菌生物膜有關[80]。在形成細菌生物膜的這些細菌之間存在相互傳遞細胞信號的 EVs[58]，目前還沒有一種真正徹底有效的治療細菌生物膜類疾病的方法，如果能夠合成出干擾這些信號傳遞 EVs 的藥物，破壞細菌生物膜的形成，將有利于治療那些例如植入物感染等頑固性的感染。
4.3 疾病的早期診斷和檢測
天然 OMVs 是細菌在正常生長狀態下自然釋放到周圍環境中，包含完整的外膜抗原及天然構象。細菌經培養可以很容易獲得大量 OMVs，而且通過基因工程手段改造細菌可進一步修飾 OMVs。有研究報道[81]，將一種天然脂蛋白用作融合伴侶以將納米熒光素酶包裝在 OMVs 內，用于凝血酶檢測，檢測限為 0.5 nm，基于 OMVs 設計的用于抗原結合和信號生成的多功能傳感器，與其他檢測方法相當。利用熒光蛋白標記這些生物工程化生成的 OMVs 對癌細胞顯像，有望達到早期診斷目的。
4.4 藥物治療
OMVs 包含殺死其他細菌的死亡信息，如胞壁質水解酶，在 OMVs 中富集，結合目標細菌，然后降解其細菌壁的肽聚糖和輸送囊泡內容物，引發目標細菌死亡[70, 82]。慶大霉素是一種抑制細菌蛋白質合成的抗生素，常用于治療銅綠假單胞菌感染，如果志賀菌載有慶大霉素，不僅載有慶大霉素的 OMVs 產率增加，且療效得到了增強[16, 82]。
來自食源性大腸桿菌的 OMVs 促進沙門菌的基因轉移，并由其表達沙門菌或大腸桿菌毒性引發腸道炎。OMVs 轉化細菌并非只是增強了細胞毒性，還可以增強細菌對氨芐青霉素的抗性[83]。
因此，OMVs 可能成為臨床上預后和生物標志物的有效工具，且有望成為一種能夠通過藥理學屏障的自身來源藥物載體。
5 小結與展望
細菌性疾病是導致每年數百萬人感染死亡的全球性和主要公共衛生問題，隨著許多病原體耐藥性的增加，非常需要開發新的治療藥劑和方法。
通過開發有效的無佐劑疫苗可以最好地管理傳染病，但疫苗在遞送時具有侵入性，需要優化當前的疫苗遞送系統。研究者們發現 OMVs 在免疫應答中有著特殊作用[84]，可激發宿主的免疫應答，為菌體獲得營養物質和優勢生存條件[76]，并且因帶有細菌特異的外膜蛋白能有效刺激巨噬細胞因子分泌，可以作為一種新型疫苗的潛在載體。由于 OMVs 可以由眾多 G– 菌產生，基于 OMVs 的納米載體在免疫治療中具有廣泛應用前景。
生物膜基質通過介導細菌的表面附著、細胞聚集成簇和聚集體穩定，在其形成中發揮各種重要的作用，而 EVs 是生物膜基質的重要組分，通過控制生物膜基質中 EVs，充分利用各 EVs 數據庫，或將突破生物膜特異性適應性抵抗，尋找到抵抗高度耐藥生物膜的方法。
源于自體的 EVs 應用可能是朝向個性化藥物的第一步，其副作用非常小并且療效和特異性高。盡管 OMVs 已被用作多功能且安全的疫苗以及耐受性良好的輸送系統，但將其 EVs 用于臨床仍然存在許多問題，例如來源的安全性和 EVs 衍生抗原的正確構象，未來需要解決的另一個重要問題是其可靠和可重復的分離和純化以及穩健的分析。正在快速發展的生物技術與臨床試驗相結合，有望促成 EVs 在未來感染治療中作為診斷工具，且因為 EVs 具有對人體屏障的滲透作用和增加抗生素療效的作用，可應用于植入物感染的防治。OMVs 也被設計用于其他治療，例如具有良好耐受低內毒性的藥物載體。
生物和仿生療法是一類相對較新的系統，它們或具有生物來源，或可利用、模仿生理途徑以增強靶向作用。盡管大量研究表明 OMVs 具有良好的臨床應用前景，但對 OMVs 的產生機制及其與宿主相互作用的機制還不十分了解，未經任何改造的 OMVs 仍會存在一定毒性。所以未來對于破譯病原體本身與宿主之間的復雜交流，針對 OMVs 各種模塊進行靶向功能設計，發展抗傳染因子的治療策略，應用于臨床的早期診斷、藥物治療和細菌感染預防，還有許多工作需要完成。