引用本文： 殷建, 王斌, 朱超, 孫超, 劉新暉. 局部注射促血管生成素 2 調控自噬促進體內組織工程人工骨早期血管化和骨缺損修復的研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(9): 1150-1156. doi: 10.7507/1002-1892.201804105 復制
骨缺損的治療一直以來都是骨科、口腔科及神經外科等領域的棘手問題。近年來，組織工程人工骨的成功構建為臨床上治療骨缺損提供了新的手段。骨為高度血管化組織，血管的生長速度和范圍決定了新骨形成和骨缺損修復的效率。所以植入體內的組織工程人工骨快速血管化，是其成活并發揮功能的前提和基礎[1]。但是目前仍然沒有找到理想的促進組織工程人工骨血管化的方式[2]。在腫瘤細胞增殖和遷移的過程中，血管生成極度活躍，此過程中促血管生成素 2（angiopoietin 2，Ang-2）在血管生成早期具有重要的促進作用；而自噬對血管生成同樣具有調控作用。因此，我們借鑒腫瘤血管生成旺盛以及細胞自噬調控血管生成的機制，擬通過建立動物實驗模型，對 Ang-2 調控細胞自噬促進組織工程人工骨血管化的機制進行探討。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康清潔級新西蘭成年大白兔 48 只，雌雄不限，體質量（3.00±0.26）kg，無骨骼發育畸形，由南京醫科大學動物實驗中心提供。
羥基磷灰石/膠原支架（支架孔徑 20～200 μm，孔隙率 80%～88%；北京航空航天大學材料系）。異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma 公司，美國）；青霉素（山東魯抗醫藥股份有限公司）；生理鹽水（四川科倫藥業股份有限公司）；Ang-2（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；RIPA 裂解液、SDS-PAGE（南京凱基生物科技發展有限公司）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、發光液（Millipore 公司，美國）；鼠抗兔微管相關蛋白 1 輕鏈 3（microtubule associated protein 1 lightchain 3，LC3；包括 LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ）抗體、鼠抗兔 SQSTMl/p62（一種泛素樣結合蛋白）抗體、鼠抗兔 Beclin-1 抗體、鼠抗兔 VEGF 抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記二抗（Abcam 公司，美國）；多聚甲醛（連云港軒源化工有限公司）；EDTA 螯合脫鈣液（北京索萊寶科技有限公司）。Image J 軟件（National Institutes of Health 公司，美國）。WHALE DigiArc-100 G 臂 X 線機（惠爾公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 兔橈骨骨缺損模型建立及實驗分組
將 48 只兔以異氟烷誘導麻醉后，腹腔注射（40 mg/kg）戊巴比妥鈉麻醉，采用隨機數字表法選擇一側前臂建立骨缺損模型。取橈側縱直切口，逐層切開皮膚、深筋膜，鈍性分離肌間隙，顯露橈骨，剝離骨膜；在距橈骨小頭 2 cm 處使用微型電鉆向遠端切除 1.5 cm 的骨段，植入羥基磷灰石/膠原支架，沖洗后逐層縫合切口。術后連續 3 d 肌肉注射青霉素（40 萬 U/d），前臂石膏制動 4 周。將 48 只兔隨機分為兩組，每組 24 只。對照組（A 組）術后 2 周內每日于骨缺損兩斷端局部注射 1 mL 生理鹽水；Ang-2 組（B 組）術后 2 周內每日于骨缺損兩斷端局部注射 1 mL 溶于生理鹽水的 400 ng/mL Ang-2。常規條件飼養、觀察。
1.3 觀測指標
1.3.1 動物大體觀察
術后觀察實驗動物飲食、切口及活動情況，觀察有無術后相關并發癥發生。
1.3.2 Western blot 檢測
術后 4 周每組各取 4 只兔，過量麻醉處死后取出新生骨，清洗稱重后轉移至液氮研磨瓶中，采用擊打研磨法將骨組織磨成粉末狀，將粉末狀骨組織轉移至 EP 管中，加入 RIPA 裂解液，分別提取組織全蛋白。蛋白定量后，經 10%SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉移至 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶封閉后，分別加入一抗 LC3、SQSTMl/p62、Beclin-1 和 VEGF 抗體，4℃ 孵育過夜；加入 HRP 標記二抗，4℃ 孵育 2 h，加發光液曝光顯影，Image J 軟件計算條帶灰度值，并與內參灰度值進行比較得到相對表達量（其中 LC3 相對表達量以 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 表示）。
1.3.3 影像學檢查
術后 4、8、12 周每組各取 4 只兔，使用 G 臂 X 線機（8 mA，40 mV）攝術側前肢 X 線片，觀察各組兔橈骨缺損處骨痂生長、骨連接支架降解情況，根據 Lane-Sandhu X 線評分法[3]對骨缺損修復情況進行評分。
1.3.4 標本大體觀察
術后 12 周每組各取 4 只兔過量麻醉處死，立即取出骨缺損處（包括骨缺損端上下各 5 mm 正常骨組織），去除骨表面附著肌肉，大體觀察骨組織形態、骨膜血管網，從骨的中央橫斷后觀察髓腔再通情況。
1.3.5 HE 染色觀察
取術后 12 周大體觀察后的標本，放入 4% 多聚甲醛中固定 12 h，經 10%EDTA 螯合脫鈣液脫鈣、石蠟包埋后，沿標本冠狀面作連續 5 μm 厚切片，常規行 HE 染色，倒置顯微鏡觀察。由 2 位有經驗的病理科醫生（統計者盲法）對每張切片血管數量進行計數并計算平均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 動物大體觀察
所有兔飲食活動正常；實驗過程中 3 只兔因腹瀉死亡，予以重新造模補足。切口愈合良好，未發生感染等并發癥。
2.2 Western blot 檢測
B 組新生骨痂區自噬相關蛋白 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達及血管生成相關蛋白 VEGF 相對表達量均顯著高于 A 組，自噬降解底物蛋白 SQSTMl/p62 相對表達量顯著低于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
2.3 影像學觀察
術后 4 周，A 組未見明顯骨痂生成，B 組骨缺損區有較多新生骨痂，兩組骨缺損兩端均尚未連接。8 周，A 組未見明顯骨痂形成，骨折線清晰；B 組新生骨痂進一步增多、增粗，骨缺損連續性恢復，但新生骨痂相對較細，骨密度影相對周圍正常骨組織較低。12 周，A 組骨缺損處有少量骨痂生成，但骨痂稀疏且不連續，骨缺損兩端趨向硬化，骨缺損未修復；B 組新生骨痂進一步增多、增粗，骨缺損處完全修復，新骨痂密度影與周圍正常骨組織接近。見圖 2。術后各時間點 B 組 Lane-Sandhu 評分均顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
兩組術后各時間點 Lane-Sandhu 評分比較（n=4，
）
Table1.
Lane-Sandhu scores of 2 groups at different time points after operation (n=4,
)
2.4 標本大體觀察
術后 12 周 A 組僅可見少量骨痂生長，骨缺損端硬化，髓腔封閉，骨缺損未修復；B 組骨缺損連續性恢復，新骨呈管狀外形，和周圍骨組織相似，髓腔再通。見圖 3。
2.5 HE 染色觀察
術后 12 周 HE 染色示，A 組見少量成骨細胞，骨小梁細小，部分斷裂，哈佛管排列不規則，血管數量少，以編織骨為主；B 組成骨細胞較多，骨小梁密集，哈佛管排列整齊，新生骨內及周圍新生血管較多，以板層骨為主。見圖 4。A、B 組每張切片血管數量分別為（4.67±1.53）個和（32.67±3.79）個，差異有統計學意義（t=–11.879，P=0.000）。
圖1
術后 4 周 Western blot 檢測兩組相關蛋白表達情況
Mr：相對分子質量 a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組；b. 蛋白相對表達量
Figure1. The expressions of proteins in 2 groups detected by Western blot assayMr: Related molecular mass a. Electrophoretic diagram 1: Group A 2: Group B; b. Protein relative expressions
圖2
術后各時間點兩組 X 線片觀察
從左至右依次為術后 4、8、12 周 a. A 組；b. B 組
Figure2. X-ray films observation of 2 groups at different time points after operationFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks after operation, respectively a. Group A; b. Group B
圖3
術后 12 周兩組標本大體觀察
a. A 組；b. B 組
Figure3. General observation of specimens of 2 groups at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B
圖4
術后 12 周兩組 HE 染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組
Figure4. HE staining observation of 2 groups at 12 weeks after operation (×200)a. Group A; b. Group B
3 討論
骨缺損的治療一直比較棘手，目前臨床上治療骨缺損的方法以自體骨或同種異體骨移植較為廣泛[4-5]，但是這兩種方法都有一定局限性[6]，如自體骨來源少、取骨時術中出血及術后取骨區疼痛等。同種異體骨的供應相對充足，但可能引起疾病傳播和免疫排斥反應，限制了其臨床應用。組織工程人工骨由于取材廣泛，具有良好的骨傳導性和骨誘導能力，在骨缺損尤其是大段骨缺損修復領域具有良好的應用前景[7]。由于單一的組織工程人工骨只能為骨組織提供生長的支架[8-9]，而骨的生成需要多種細胞因子的共同作用。為了提高骨細胞分化效率，減少骨不連的發生，很多學者提出了支架聯合細胞因子共同移植理念，目前研究較多的有 VEGF[10]、BMP-2[11]、bFGF[12]、PDGF-BB[13]、低氧誘導因子 1[14]或合并干細胞移植等[11, 14]，分別從不同方面促進骨缺損的修復，但尚未發現可以穩定地促進骨缺損修復的方法。
組織工程人工骨在植入體內后快速成活的關鍵之一是新生血管長入，良好的血供是諸多細胞（因子）發揮作用的前提。我們在既往研究中發現，碳納米支架和成骨細胞、血管內皮細胞（endothelial cells，ECs）混合培養可促進骨組織血管化[15]。目前國內外學者尚未找到理想的促進組織工程人工骨血管化的方法[2]。研究發現，惡性腫瘤細胞存活及增殖轉移的關鍵是極度活躍的血管生成，Ang-Tie2 軸是調控血管生成重要的信號通路之一[16]。研究表明[17]，Ang-1 可以影響肌動蛋白細胞骨架結構，使血管平滑肌細胞、周皮細胞等包裹 ECs 形成完整的血管壁。而在血管新生的初始階段，ECs 及支持細胞之間的分離是十分必要的。Ang-2 可競爭性阻斷 Ang-1 穩定血管效應，破壞血管壁的完整性，血管基底膜降解，使血管通透性增高，ECs 進入不穩定狀態，并對生長因子如 VEGF、TNF 等的敏感性增強，促進新血管形成。故在新血管形成的起始階段，Ang-2 與 Tie2 結合影響原血管 ECs 之間及其與支持細胞之間的連接，為新生血管形成創造條件[18]。
自噬是普遍存在的、真核細胞特有的生命現象。自噬具有兩面性，既可以促進細胞存活，又可導致細胞死亡[19]。自噬和血管生成具有重要聯系[20]。Goyal 等[21]和 Li 等[22]研究發現激活自噬可促進血管生成。然而 Kumar 等[23]發現自噬抑制人臍靜脈內皮細胞和前列腺癌細胞血管生成并引起細胞死亡。所以自噬對血管生成可能具有雙重作用。所以我們將腫瘤血管生成的機制創新性地應用于組織工程人工骨血管化中。通過構建兔橈骨骨缺損模型，并在骨缺損處定期注射 Ang-2，檢測自噬相關指標水平及骨缺損修復情況，探討 Ang-2 調節自噬促進組織工程人工骨早期血管化的機制及治療骨缺損的轉化應用前景。
目前已知的 Ang 蛋白家族成員包括 Ang-1、Ang-2、Ang-3 和 Ang-4（小鼠 Ang-3 人類同源基因），它們均能與 Tie2 結合，其中 Ang-1 和 Ang-2 與血管新生密切相關。Tie2 是一種特異性酪氨酸激酶型受體，主要表達于 ECs。Ang-1 主要由血管周細胞表達，在成熟的血管中維持 ECs 的生存和靜止狀態。Ang-1 通過穩定 ECs 間的 ECs 鈣黏蛋白，抑制 ECs 在 VEGF 或炎性因子作用下 ECs 鈣黏蛋白丟失，從而維持血管的完整性。Ang-2 是一種分泌型糖蛋白，與 Ang-1 具有同源性，由 ECs 合成并存貯于 Weibel Palade 小體中[24]，參與血管形成的早期啟動和激發階段，其與 Ang-1 競爭性結合 Tie2 受體，雖然不引起 Tie2 受體的磷酸化，但可以競爭性地阻斷 Ang-1 的生物學效應。和 Ang-1 作用不同，Ang-2 通過促進肌動蛋白纖維形成破壞 ECs 的完整性。所以 Ang-2 與內皮細胞間的相互作用可能是新生血管形成的始動環節[25]。
對腫瘤的研究發現，在腫瘤細胞增殖和轉移的過程中，血管生成極度活躍，此時伴隨著 Ang-2 表達的增加，包括黑色素瘤、腎癌、膠質母細胞瘤、乳腺癌和結直腸癌等[26-30]。臨床前期研究中發現一些單克隆抗體可以減弱 Ang-2 和 Tie2 的相互作用，從而抑制腫瘤血管生成，促進血管消退[31-33]。所以本研究創新性地將腫瘤血管生成的機制應用于組織工程人工骨血管化中。在骨折愈合的最初階段，新生血管由骨折斷端長入。和腫瘤細胞的增殖、轉移類似，此時 ECs 及支持細胞之間的分離是血管延長的前提。He 等[34]證實，YAP（Yes-associated protein）蛋白通過與轉錄因子 STAT3 的相互作用，延長了 STAT3 在細胞核中的積聚，并且增強了對下游靶基因 Ang-2 的轉錄調控，進而導致 ECs 增殖、遷移及成血管功能增強，最終促進了組織中血管新生過程。
在多種疾病，如腫瘤、心血管病、動脈粥樣硬化以及細胞衰老的病理生理中都存在自噬的發生。Beclin-1 是自噬的標志性蛋白，其表達和自噬水平成正相關。LC3 前體形成后被蛋白酶加工成胞漿可溶性 LC3-Ⅰ，其可與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結合成膜結合形式 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬體和自噬體，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和自噬水平成正相關[19]。SQSTMl/p62 是一種可被自噬選擇性降解的蛋白質[35]，其表達量和自噬水平成負相關。我們既往研究發現，雷帕霉素可以誘導細胞自噬促進骨折區血管形成及骨折愈合[36]。所以，我們認為在骨缺損修復初期，局部使用適宜濃度 Ang-2 可以促進組織工程人工骨血管化和骨缺損的修復。VEGF 主要調節血管 ECs 的增殖、存活、遷移和通透性的改變。Western blot 結果顯示局部注射 Ang-2 后，和對照組相比，自噬相關蛋白 Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達增多，SQSTMl/p62 降低，自噬增強，VEGF 表達增加。通過 HE 染色觀察發現，術后 12 周 A 組血管數量及成骨細胞數量均較少，骨小梁稀疏；而 B 組成骨細胞較多，新生骨內及周圍新生血管較多，骨小梁密集，成骨細胞分化較好。X 線片觀察和 Lane-Sandhu 評分顯示，B 組骨缺損修復良好，而 A 組骨缺損未修復，差異有統計學意義。所以我們認為局部注射適宜濃度的 Ang-2 可能通過增強自噬促進骨缺損區組織工程人工骨早期血管生成，進而促進骨缺損的修復。
Ang-2/PI3K-Akt 信號通路是血管生成的經典通路之一，而 PI3K-Akt 也是調節自噬的重要信號通路。所以我們推測 Ang-2 是通過 PI3K-Akt 通路調節 ECs 自噬進而促進血管生成。這有待后續細胞實驗進一步證實。
目前尚無研究證明局部應用 Ang-2 促進組織工程人工骨血管化和修復骨缺損的最佳效應濃度，這是我們后期的研究目標。我們正在研制組織工程人工骨支架，包括 Ang-2 顆粒緩釋系統，使 Ang-2 局部作用濃度更加穩定，同時也避免局部注射帶來的損傷和疼痛。本實驗中采用了 X 線作為影像學檢查來評估骨折愈合情況，后期實驗我們計劃使用 Micro-CT 進行更加準確的影像學評價。隨著材料學研究的進一步深入，目前碳納米生物材料以其獨特的理化性質逐漸用于骨缺損修復的研究中[37-38]，具有廣闊的應用前景，這也是我們后期重點的研究方向。本研究為后續聯合應用多種促血管化因子及調控自噬促進血管生成奠定了基礎，為促進骨缺損修復、減少骨不連的發生探索新的思路和方法。
骨缺損的治療一直以來都是骨科、口腔科及神經外科等領域的棘手問題。近年來，組織工程人工骨的成功構建為臨床上治療骨缺損提供了新的手段。骨為高度血管化組織，血管的生長速度和范圍決定了新骨形成和骨缺損修復的效率。所以植入體內的組織工程人工骨快速血管化，是其成活并發揮功能的前提和基礎[1]。但是目前仍然沒有找到理想的促進組織工程人工骨血管化的方式[2]。在腫瘤細胞增殖和遷移的過程中，血管生成極度活躍，此過程中促血管生成素 2（angiopoietin 2，Ang-2）在血管生成早期具有重要的促進作用；而自噬對血管生成同樣具有調控作用。因此，我們借鑒腫瘤血管生成旺盛以及細胞自噬調控血管生成的機制，擬通過建立動物實驗模型，對 Ang-2 調控細胞自噬促進組織工程人工骨血管化的機制進行探討。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康清潔級新西蘭成年大白兔 48 只，雌雄不限，體質量（3.00±0.26）kg，無骨骼發育畸形，由南京醫科大學動物實驗中心提供。
羥基磷灰石/膠原支架（支架孔徑 20～200 μm，孔隙率 80%～88%；北京航空航天大學材料系）。異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma 公司，美國）；青霉素（山東魯抗醫藥股份有限公司）；生理鹽水（四川科倫藥業股份有限公司）；Ang-2（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；RIPA 裂解液、SDS-PAGE（南京凱基生物科技發展有限公司）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、發光液（Millipore 公司，美國）；鼠抗兔微管相關蛋白 1 輕鏈 3（microtubule associated protein 1 lightchain 3，LC3；包括 LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ）抗體、鼠抗兔 SQSTMl/p62（一種泛素樣結合蛋白）抗體、鼠抗兔 Beclin-1 抗體、鼠抗兔 VEGF 抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記二抗（Abcam 公司，美國）；多聚甲醛（連云港軒源化工有限公司）；EDTA 螯合脫鈣液（北京索萊寶科技有限公司）。Image J 軟件（National Institutes of Health 公司，美國）。WHALE DigiArc-100 G 臂 X 線機（惠爾公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 兔橈骨骨缺損模型建立及實驗分組
將 48 只兔以異氟烷誘導麻醉后，腹腔注射（40 mg/kg）戊巴比妥鈉麻醉，采用隨機數字表法選擇一側前臂建立骨缺損模型。取橈側縱直切口，逐層切開皮膚、深筋膜，鈍性分離肌間隙，顯露橈骨，剝離骨膜；在距橈骨小頭 2 cm 處使用微型電鉆向遠端切除 1.5 cm 的骨段，植入羥基磷灰石/膠原支架，沖洗后逐層縫合切口。術后連續 3 d 肌肉注射青霉素（40 萬 U/d），前臂石膏制動 4 周。將 48 只兔隨機分為兩組，每組 24 只。對照組（A 組）術后 2 周內每日于骨缺損兩斷端局部注射 1 mL 生理鹽水；Ang-2 組（B 組）術后 2 周內每日于骨缺損兩斷端局部注射 1 mL 溶于生理鹽水的 400 ng/mL Ang-2。常規條件飼養、觀察。
1.3 觀測指標
1.3.1 動物大體觀察
術后觀察實驗動物飲食、切口及活動情況，觀察有無術后相關并發癥發生。
1.3.2 Western blot 檢測
術后 4 周每組各取 4 只兔，過量麻醉處死后取出新生骨，清洗稱重后轉移至液氮研磨瓶中，采用擊打研磨法將骨組織磨成粉末狀，將粉末狀骨組織轉移至 EP 管中，加入 RIPA 裂解液，分別提取組織全蛋白。蛋白定量后，經 10%SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉移至 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶封閉后，分別加入一抗 LC3、SQSTMl/p62、Beclin-1 和 VEGF 抗體，4℃ 孵育過夜；加入 HRP 標記二抗，4℃ 孵育 2 h，加發光液曝光顯影，Image J 軟件計算條帶灰度值，并與內參灰度值進行比較得到相對表達量（其中 LC3 相對表達量以 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 表示）。
1.3.3 影像學檢查
術后 4、8、12 周每組各取 4 只兔，使用 G 臂 X 線機（8 mA，40 mV）攝術側前肢 X 線片，觀察各組兔橈骨缺損處骨痂生長、骨連接支架降解情況，根據 Lane-Sandhu X 線評分法[3]對骨缺損修復情況進行評分。
1.3.4 標本大體觀察
術后 12 周每組各取 4 只兔過量麻醉處死，立即取出骨缺損處（包括骨缺損端上下各 5 mm 正常骨組織），去除骨表面附著肌肉，大體觀察骨組織形態、骨膜血管網，從骨的中央橫斷后觀察髓腔再通情況。
1.3.5 HE 染色觀察
取術后 12 周大體觀察后的標本，放入 4% 多聚甲醛中固定 12 h，經 10%EDTA 螯合脫鈣液脫鈣、石蠟包埋后，沿標本冠狀面作連續 5 μm 厚切片，常規行 HE 染色，倒置顯微鏡觀察。由 2 位有經驗的病理科醫生（統計者盲法）對每張切片血管數量進行計數并計算平均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 動物大體觀察
所有兔飲食活動正常；實驗過程中 3 只兔因腹瀉死亡，予以重新造模補足。切口愈合良好，未發生感染等并發癥。
2.2 Western blot 檢測
B 組新生骨痂區自噬相關蛋白 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達及血管生成相關蛋白 VEGF 相對表達量均顯著高于 A 組，自噬降解底物蛋白 SQSTMl/p62 相對表達量顯著低于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
2.3 影像學觀察
術后 4 周，A 組未見明顯骨痂生成，B 組骨缺損區有較多新生骨痂，兩組骨缺損兩端均尚未連接。8 周，A 組未見明顯骨痂形成，骨折線清晰；B 組新生骨痂進一步增多、增粗，骨缺損連續性恢復，但新生骨痂相對較細，骨密度影相對周圍正常骨組織較低。12 周，A 組骨缺損處有少量骨痂生成，但骨痂稀疏且不連續，骨缺損兩端趨向硬化，骨缺損未修復；B 組新生骨痂進一步增多、增粗，骨缺損處完全修復，新骨痂密度影與周圍正常骨組織接近。見圖 2。術后各時間點 B 組 Lane-Sandhu 評分均顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
兩組術后各時間點 Lane-Sandhu 評分比較（n=4，
）
Table1.
Lane-Sandhu scores of 2 groups at different time points after operation (n=4,
)
2.4 標本大體觀察
術后 12 周 A 組僅可見少量骨痂生長，骨缺損端硬化，髓腔封閉，骨缺損未修復；B 組骨缺損連續性恢復，新骨呈管狀外形，和周圍骨組織相似，髓腔再通。見圖 3。
2.5 HE 染色觀察
術后 12 周 HE 染色示，A 組見少量成骨細胞，骨小梁細小，部分斷裂，哈佛管排列不規則，血管數量少，以編織骨為主；B 組成骨細胞較多，骨小梁密集，哈佛管排列整齊，新生骨內及周圍新生血管較多，以板層骨為主。見圖 4。A、B 組每張切片血管數量分別為（4.67±1.53）個和（32.67±3.79）個，差異有統計學意義（t=–11.879，P=0.000）。
圖1
術后 4 周 Western blot 檢測兩組相關蛋白表達情況
Mr：相對分子質量 a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組；b. 蛋白相對表達量
Figure1. The expressions of proteins in 2 groups detected by Western blot assayMr: Related molecular mass a. Electrophoretic diagram 1: Group A 2: Group B; b. Protein relative expressions
圖2
術后各時間點兩組 X 線片觀察
從左至右依次為術后 4、8、12 周 a. A 組；b. B 組
Figure2. X-ray films observation of 2 groups at different time points after operationFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks after operation, respectively a. Group A; b. Group B
圖3
術后 12 周兩組標本大體觀察
a. A 組；b. B 組
Figure3. General observation of specimens of 2 groups at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B
圖4
術后 12 周兩組 HE 染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組
Figure4. HE staining observation of 2 groups at 12 weeks after operation (×200)a. Group A; b. Group B
3 討論
骨缺損的治療一直比較棘手，目前臨床上治療骨缺損的方法以自體骨或同種異體骨移植較為廣泛[4-5]，但是這兩種方法都有一定局限性[6]，如自體骨來源少、取骨時術中出血及術后取骨區疼痛等。同種異體骨的供應相對充足，但可能引起疾病傳播和免疫排斥反應，限制了其臨床應用。組織工程人工骨由于取材廣泛，具有良好的骨傳導性和骨誘導能力，在骨缺損尤其是大段骨缺損修復領域具有良好的應用前景[7]。由于單一的組織工程人工骨只能為骨組織提供生長的支架[8-9]，而骨的生成需要多種細胞因子的共同作用。為了提高骨細胞分化效率，減少骨不連的發生，很多學者提出了支架聯合細胞因子共同移植理念，目前研究較多的有 VEGF[10]、BMP-2[11]、bFGF[12]、PDGF-BB[13]、低氧誘導因子 1[14]或合并干細胞移植等[11, 14]，分別從不同方面促進骨缺損的修復，但尚未發現可以穩定地促進骨缺損修復的方法。
組織工程人工骨在植入體內后快速成活的關鍵之一是新生血管長入，良好的血供是諸多細胞（因子）發揮作用的前提。我們在既往研究中發現，碳納米支架和成骨細胞、血管內皮細胞（endothelial cells，ECs）混合培養可促進骨組織血管化[15]。目前國內外學者尚未找到理想的促進組織工程人工骨血管化的方法[2]。研究發現，惡性腫瘤細胞存活及增殖轉移的關鍵是極度活躍的血管生成，Ang-Tie2 軸是調控血管生成重要的信號通路之一[16]。研究表明[17]，Ang-1 可以影響肌動蛋白細胞骨架結構，使血管平滑肌細胞、周皮細胞等包裹 ECs 形成完整的血管壁。而在血管新生的初始階段，ECs 及支持細胞之間的分離是十分必要的。Ang-2 可競爭性阻斷 Ang-1 穩定血管效應，破壞血管壁的完整性，血管基底膜降解，使血管通透性增高，ECs 進入不穩定狀態，并對生長因子如 VEGF、TNF 等的敏感性增強，促進新血管形成。故在新血管形成的起始階段，Ang-2 與 Tie2 結合影響原血管 ECs 之間及其與支持細胞之間的連接，為新生血管形成創造條件[18]。
自噬是普遍存在的、真核細胞特有的生命現象。自噬具有兩面性，既可以促進細胞存活，又可導致細胞死亡[19]。自噬和血管生成具有重要聯系[20]。Goyal 等[21]和 Li 等[22]研究發現激活自噬可促進血管生成。然而 Kumar 等[23]發現自噬抑制人臍靜脈內皮細胞和前列腺癌細胞血管生成并引起細胞死亡。所以自噬對血管生成可能具有雙重作用。所以我們將腫瘤血管生成的機制創新性地應用于組織工程人工骨血管化中。通過構建兔橈骨骨缺損模型，并在骨缺損處定期注射 Ang-2，檢測自噬相關指標水平及骨缺損修復情況，探討 Ang-2 調節自噬促進組織工程人工骨早期血管化的機制及治療骨缺損的轉化應用前景。
目前已知的 Ang 蛋白家族成員包括 Ang-1、Ang-2、Ang-3 和 Ang-4（小鼠 Ang-3 人類同源基因），它們均能與 Tie2 結合，其中 Ang-1 和 Ang-2 與血管新生密切相關。Tie2 是一種特異性酪氨酸激酶型受體，主要表達于 ECs。Ang-1 主要由血管周細胞表達，在成熟的血管中維持 ECs 的生存和靜止狀態。Ang-1 通過穩定 ECs 間的 ECs 鈣黏蛋白，抑制 ECs 在 VEGF 或炎性因子作用下 ECs 鈣黏蛋白丟失，從而維持血管的完整性。Ang-2 是一種分泌型糖蛋白，與 Ang-1 具有同源性，由 ECs 合成并存貯于 Weibel Palade 小體中[24]，參與血管形成的早期啟動和激發階段，其與 Ang-1 競爭性結合 Tie2 受體，雖然不引起 Tie2 受體的磷酸化，但可以競爭性地阻斷 Ang-1 的生物學效應。和 Ang-1 作用不同，Ang-2 通過促進肌動蛋白纖維形成破壞 ECs 的完整性。所以 Ang-2 與內皮細胞間的相互作用可能是新生血管形成的始動環節[25]。
對腫瘤的研究發現，在腫瘤細胞增殖和轉移的過程中，血管生成極度活躍，此時伴隨著 Ang-2 表達的增加，包括黑色素瘤、腎癌、膠質母細胞瘤、乳腺癌和結直腸癌等[26-30]。臨床前期研究中發現一些單克隆抗體可以減弱 Ang-2 和 Tie2 的相互作用，從而抑制腫瘤血管生成，促進血管消退[31-33]。所以本研究創新性地將腫瘤血管生成的機制應用于組織工程人工骨血管化中。在骨折愈合的最初階段，新生血管由骨折斷端長入。和腫瘤細胞的增殖、轉移類似，此時 ECs 及支持細胞之間的分離是血管延長的前提。He 等[34]證實，YAP（Yes-associated protein）蛋白通過與轉錄因子 STAT3 的相互作用，延長了 STAT3 在細胞核中的積聚，并且增強了對下游靶基因 Ang-2 的轉錄調控，進而導致 ECs 增殖、遷移及成血管功能增強，最終促進了組織中血管新生過程。
在多種疾病，如腫瘤、心血管病、動脈粥樣硬化以及細胞衰老的病理生理中都存在自噬的發生。Beclin-1 是自噬的標志性蛋白，其表達和自噬水平成正相關。LC3 前體形成后被蛋白酶加工成胞漿可溶性 LC3-Ⅰ，其可與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結合成膜結合形式 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬體和自噬體，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和自噬水平成正相關[19]。SQSTMl/p62 是一種可被自噬選擇性降解的蛋白質[35]，其表達量和自噬水平成負相關。我們既往研究發現，雷帕霉素可以誘導細胞自噬促進骨折區血管形成及骨折愈合[36]。所以，我們認為在骨缺損修復初期，局部使用適宜濃度 Ang-2 可以促進組織工程人工骨血管化和骨缺損的修復。VEGF 主要調節血管 ECs 的增殖、存活、遷移和通透性的改變。Western blot 結果顯示局部注射 Ang-2 后，和對照組相比，自噬相關蛋白 Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達增多，SQSTMl/p62 降低，自噬增強，VEGF 表達增加。通過 HE 染色觀察發現，術后 12 周 A 組血管數量及成骨細胞數量均較少，骨小梁稀疏；而 B 組成骨細胞較多，新生骨內及周圍新生血管較多，骨小梁密集，成骨細胞分化較好。X 線片觀察和 Lane-Sandhu 評分顯示，B 組骨缺損修復良好，而 A 組骨缺損未修復，差異有統計學意義。所以我們認為局部注射適宜濃度的 Ang-2 可能通過增強自噬促進骨缺損區組織工程人工骨早期血管生成，進而促進骨缺損的修復。
Ang-2/PI3K-Akt 信號通路是血管生成的經典通路之一，而 PI3K-Akt 也是調節自噬的重要信號通路。所以我們推測 Ang-2 是通過 PI3K-Akt 通路調節 ECs 自噬進而促進血管生成。這有待后續細胞實驗進一步證實。
目前尚無研究證明局部應用 Ang-2 促進組織工程人工骨血管化和修復骨缺損的最佳效應濃度，這是我們后期的研究目標。我們正在研制組織工程人工骨支架，包括 Ang-2 顆粒緩釋系統，使 Ang-2 局部作用濃度更加穩定，同時也避免局部注射帶來的損傷和疼痛。本實驗中采用了 X 線作為影像學檢查來評估骨折愈合情況，后期實驗我們計劃使用 Micro-CT 進行更加準確的影像學評價。隨著材料學研究的進一步深入，目前碳納米生物材料以其獨特的理化性質逐漸用于骨缺損修復的研究中[37-38]，具有廣闊的應用前景，這也是我們后期重點的研究方向。本研究為后續聯合應用多種促血管化因子及調控自噬促進血管生成奠定了基礎，為促進骨缺損修復、減少骨不連的發生探索新的思路和方法。
