引用本文： 詹健峰, 劉徐妹, 于博. 載 BMP-2 多肽 P24 的巰基化殼聚糖水凝膠誘導異位成骨的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(9): 1144-1149. doi: 10.7507/1002-1892.201806086 復制
近來，越來越多的研究開始探討運用殼聚糖制備水凝膠來進行骨組織修復的可行性[1]。殼聚糖是天然聚陽離子多糖，具有生物降解性、生物相容性、非抗原性等功能，且來源廣泛、價格低廉[2]。通過加入含羥基聚合物對殼聚糖進行接枝反應，可得到溫敏殼聚糖凝膠[3-4]，該巰基化殼聚糖（chitosan-4-thio-butylamidine，CS-TBA）水凝膠在室溫下能夠保持溶液狀態，而在 37℃ 時成膠[5]。研究表明，在 BMP 家族中，BMP-2 誘導 BMSCs 分化為成骨細胞的能力最強[6]，它是唯一可誘導異位成骨并促進骨缺損愈合的生長因子[7]。P24 多肽來源于 BMP-2 的“指節簇”，含有 3 個主要功能域，分別為：① BMP-2 成骨核心結構域：BMP-2“指節簇”的關鍵氨基酸序列，可激活 BMP-2 受體相應成骨信號通路；② 磷酸化絲氨酸位點：具有促進和指導礦化的作用；③ 聚天冬氨酸結構域：具有一定親骨性并可控制羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）成核和礦化。其中“指節簇”氨基酸序列是 BMP-2 的成骨核心結構域，可激活 BMP-2 受體的相應成骨信號傳導途徑[8]。目前，許多研究報道 P24 具有與 BMP-2 相似的骨誘導活性，并且可以在體內誘導成骨[9]。因此，本研究通過制備載 BMP-2 多肽 P24 的 CS-TBA 水凝膠并植入大鼠皮下，觀察其異位成骨效果，為骨組織工程可注射成骨材料的研發提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級雌性 SD 大鼠 18 只，體質量約 200 g，由南方醫科大學動物實驗中心提供。殼聚糖（粘度 50～800 mPa·s、脫乙酰度 85%）、2-亞氨基硫烷鹽酸鹽、β-甘油磷酸二鈉（β-glycerophosphate disodium，β-GP）、透析袋、蘇木精、伊紅（Sigma 公司，美國）；P24 多肽（上海紫域生物科技有限公司）；冰醋酸、納米級 HA、4% 多聚甲醛（廣州化學試劑廠）。PHS-25 型酸度計（上海醫用恒溫設備廠）；H01-1B 恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；Coolsafe 55-9 冷凍凍干機（Labogene 公司，丹麥）；Medical AG micro-CT（SCANCO 公司，瑞士）。
1.2 CS-TBA 的制備
稱取 800 mg 殼聚糖溶于 396 mL 去離子水中，量取 4 mL 冰醋酸加入至 400 mL，攪拌 5 h 后，加入 80 mg 2-亞氨基硫烷鹽酸鹽，用 5 mol/L NaOH 調節 pH 值至 6，攪拌 24 h。將混合溶液注入透析袋中，用 5 mmol/L HCl（5 L 去離子水加 2.25 mL HCl）、含 1%NaCl 的 5 mmol/L HCl 透析 2 次，5 mmol/L HCl 透析 1 次，1 mmol/L HCl（5 L 去離子水加 0.45 mL HCl）透析 1 次，每次透析 12 h。冷凍干燥后獲得 CS-TBA。由于巰基在空氣中不穩定，易被氧化，CS-TBA 均于實驗前制備[10]。
1.3 載 BMP 多肽 P24 的 CS-TBA 水凝膠制備
① 稱取 200 mg CS-TBA 置于 9 mL 去離子水中，攪拌至完全溶解，靜置待氣泡消除后，加入 200 mg HA 粉末，繼續攪拌，超聲至分散均勻，制備 CS-TBA/HA 混合液。
② 稱取 40 mg P24 多肽溶于 800 μL 去離子水中，震蕩至完全溶解，制成濃度為 50 mg/mL 的多肽溶液。于 CS-TBA/HA 混合液中分別加入 200、400 μL 多肽溶液（含多肽 10、20 mg），攪拌至均勻，使獲得的混合液中 CS-TBA 與多肽比例分別為 20∶1 和 10∶1，制備 CS-TBA/5%P24/HA、CS-TBA/10%P24/HA 混合液。
③ 將 560 mg β-GP 溶于 1 mL 去離子水中，振蕩至完全溶解，再用注射器將其逐滴加入步驟①、② 中制備的 3 種混合液，注意邊攪拌邊加入[10]，37℃ 水浴 10 min，獲得 CS-TBA/HA/β-GP、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝膠。
1.4 動物模型制備及分組
將 18 只 SD 大鼠隨機分成 A、B、C 3 組，每組 6 只。各組大鼠按照 50 mg/kg 劑量腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉麻醉后，背部剃毛、消毒并鋪巾。于背部正中作切口，切開淺筋膜，鈍性分離兩側豎脊肌，制造豎脊肌肌袋。于各組大鼠豎脊肌肌袋內分別植入 CS-TBA/HA/β-GP 水凝膠（A 組）、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP 水凝膠（B 組）、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝膠（C 組）。切口拉攏縫合，肌肉注射 40 萬 U 青霉素預防感染。
1.5 觀測指標
1.5.1 一般情況
術后每日觀察各組大鼠存活以及活動、進食、精神狀態、切口是否發生感染等情況。
1.5.2 micro-CT 檢查
術后 4、8 周各組取 3 只大鼠斷頸處死，按照原切口入路，取出植入材料，分離材料周圍肌肉及軟組織，采用 Medical AG micro-CT 進行 CT 掃描及三維重建，掃描參數為 10 μm、120 kV、150 mA，成像時間 0.5 s。觀察各組新生骨形成情況，并采用 Philips Brilliance Workspace 軟件測量骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、皮質骨骨密度（bone mineral density，BMD）。
1.5.3 組織學觀察
micro-CT 檢查后，將標本置于 4% 多聚甲醛溶液固定，脫鈣 1 個月后脫水、透明并包埋于石蠟塊中，行組織塊切片（片厚 8 μm）。常規行 HE 及 Masson 染色，光鏡下觀察標本局部炎性反應及成骨情況。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 檢驗；組內比較采用 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后各組大鼠均存活至取材時間點，期間活動、進食及精神狀態均正常。切口均愈合良好，未出現紅腫、滲出等感染情況。
2.2 micro-CT 檢查
術后 4 周，A 組異位成骨效應較弱，未見明顯新生骨及骨小梁形成；B、C 組相較 A 組有較多新生骨形成。術后 8 周，A 組僅可見邊緣少許新生骨形成；B、C 組在植入材料和周圍組織的結合部位可見部分骨小梁及新生骨形成，且 C 組新生骨形成及中心成骨較 B 組明顯。見圖 1。
術后各組 Tb.Th、Tb.N、BMD 逐漸增加，除 A 組 Tb.Th 外，其余各指標組內 4 周與 8 周間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。各時間點，B、C 組 Tb.Th、Tb.N、BMD 明顯高于 A 組，C 組高于 B 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
各組 Tb.Th、Tb.N 及 BMD 比較（n=3，
）
Table1.
Comparison of Tb.Th, Tb.N, and BMD between groups (n=3,
)
2.3 組織學觀察
2.3.1 HE 染色
術后 4 周，A 組水凝膠材料未見明顯分解，周圍少量成骨樣細胞黏附；B、C 組可見水凝膠材料逐漸分解，內部大量成骨樣細胞黏附，且 C 組細胞多于 B 組。術后 8 周，A 組成骨樣細胞較 4 周增多，未見明顯礦化組織；B、C 組可見大量礦化組織長入，逐漸填滿水凝膠材料，且 C 組成骨效果較 B 組更明顯。見圖 2。
2.3.2 Masson 染色
術后 4 周，A 組未見纖維連接；B、C 組纖維連接逐漸形成，且 C 組多于 B 組，纖維形成邊緣逐漸有新骨生成，但是中央區域僅有纖維組織填充連接，可見大量藍色細胞核，無明顯骨組織。術后 8 周，A 組纖維連接逐漸形成，纖維形成邊緣有少量新骨形成；B、C 組纖維間隙和材料內部均有新骨長入，C 組更顯著，骨形成進一步增強，新骨進一步長入；B、C 組水凝膠材料開始出現分解，逐漸分成多個小部分，各部分出現新生骨小島的形成。見圖 3。
3 討論
本研究旨在通過異位成骨實驗來驗證 CS-TBA 水凝膠的成骨誘導效應。水凝膠材料，包括天然生物材料（淀粉、藻酸鹽、幾丁質/殼聚糖、透明質酸、膠原蛋白、絲綢等）及合成衍生生物材料（聚羥基酯、聚碳酸酯、聚磷腈等），已經被廣泛研究并應用于骨組織工程[11-16]。對比眾多的水凝膠材料，CS-TBA 水凝膠具有以下優點：① 自身具有滅菌性，能夠減少手術污染的風險；② 原材料便宜，能夠大規模合成；③ 可注射性能，常溫條件下為液態，在體內溫度、體內 pH 值條件下可短時間成膠[17]；④ 水溶性特性能夠搭載多種生物因子及復合材料，應用范圍廣泛[18]。
同時，本研究使用的 P24 多肽用于骨組織工程也比 BMP-2 更具有優勢，主要體現在以下方面：① 序列簡單，便于大規模合成，成本較低；② 線性結構，活性基團易于暴露，生物反應性好；③ 保留了 BMP-2 活性部分，成骨效果有保證[19]；④ 含有二硫鍵，易于修飾，形成穩定的共價結合[20]。
結合 CS-TBA 水凝膠及 P24 多肽的優點，我們成功制備了載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠。本課題組前期研究發現 CS-TBA 具有液態-凝膠態的生物性能，巰基化接枝 P24 多肽后能夠緩釋達 24 d，掃描電鏡下觀察包含的 HA 能夠均勻分布于水凝膠內[21]。因此，為了探究載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠材料作為骨修復材料的可行性，我們進行了大鼠皮下異位成骨實驗。本次研究中，micro-CT 三維重建圖像顯示 B、C 組成骨作用明顯高于 A 組，8 周成骨均比 4 周時明顯。此外，根據 micro-CT 數據分析，B、C 組 BMD 和 Tb.Th、Tb.N 均高于 A 組，表明載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠具有明顯的骨修復作用，并且隨著 P24 濃度的升高，C 組表現出更好的成骨效果。HE 染色及 Masson 染色結果顯示載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠材料具有良好的生物降解性，術后隨著 P24 濃度的提高，C 組礦化組織及新生骨的形成較 B 組增多，提示材料具有良好的骨誘導及成骨作用。
綜上述，載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠是一種具有應用前景的骨組織工程可注射材料。
圖1
術后 3 組 CT 三維重建觀察
從左至右為 A、B、C 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure1. Three-dimensional CT reconstruction images of 3 groups at each time point after operationFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
圖2
術后 3 組 HE 染色觀察（×200）
從左至右分別為 A、B、C 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure2. HE staining observation of 3 groups at each time point after operation (×200)From left to right for groups A, B, and C, respectivelya. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
圖3
術后 3 組 Masson 染色觀察（×400）
從左至右分別為 A、B、C 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure3. Masson staining observation of 3 groups at each time point after operation (×400)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
近來，越來越多的研究開始探討運用殼聚糖制備水凝膠來進行骨組織修復的可行性[1]。殼聚糖是天然聚陽離子多糖，具有生物降解性、生物相容性、非抗原性等功能，且來源廣泛、價格低廉[2]。通過加入含羥基聚合物對殼聚糖進行接枝反應，可得到溫敏殼聚糖凝膠[3-4]，該巰基化殼聚糖（chitosan-4-thio-butylamidine，CS-TBA）水凝膠在室溫下能夠保持溶液狀態，而在 37℃ 時成膠[5]。研究表明，在 BMP 家族中，BMP-2 誘導 BMSCs 分化為成骨細胞的能力最強[6]，它是唯一可誘導異位成骨并促進骨缺損愈合的生長因子[7]。P24 多肽來源于 BMP-2 的“指節簇”，含有 3 個主要功能域，分別為：① BMP-2 成骨核心結構域：BMP-2“指節簇”的關鍵氨基酸序列，可激活 BMP-2 受體相應成骨信號通路；② 磷酸化絲氨酸位點：具有促進和指導礦化的作用；③ 聚天冬氨酸結構域：具有一定親骨性并可控制羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）成核和礦化。其中“指節簇”氨基酸序列是 BMP-2 的成骨核心結構域，可激活 BMP-2 受體的相應成骨信號傳導途徑[8]。目前，許多研究報道 P24 具有與 BMP-2 相似的骨誘導活性，并且可以在體內誘導成骨[9]。因此，本研究通過制備載 BMP-2 多肽 P24 的 CS-TBA 水凝膠并植入大鼠皮下，觀察其異位成骨效果，為骨組織工程可注射成骨材料的研發提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級雌性 SD 大鼠 18 只，體質量約 200 g，由南方醫科大學動物實驗中心提供。殼聚糖（粘度 50～800 mPa·s、脫乙酰度 85%）、2-亞氨基硫烷鹽酸鹽、β-甘油磷酸二鈉（β-glycerophosphate disodium，β-GP）、透析袋、蘇木精、伊紅（Sigma 公司，美國）；P24 多肽（上海紫域生物科技有限公司）；冰醋酸、納米級 HA、4% 多聚甲醛（廣州化學試劑廠）。PHS-25 型酸度計（上海醫用恒溫設備廠）；H01-1B 恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；Coolsafe 55-9 冷凍凍干機（Labogene 公司，丹麥）；Medical AG micro-CT（SCANCO 公司，瑞士）。
1.2 CS-TBA 的制備
稱取 800 mg 殼聚糖溶于 396 mL 去離子水中，量取 4 mL 冰醋酸加入至 400 mL，攪拌 5 h 后，加入 80 mg 2-亞氨基硫烷鹽酸鹽，用 5 mol/L NaOH 調節 pH 值至 6，攪拌 24 h。將混合溶液注入透析袋中，用 5 mmol/L HCl（5 L 去離子水加 2.25 mL HCl）、含 1%NaCl 的 5 mmol/L HCl 透析 2 次，5 mmol/L HCl 透析 1 次，1 mmol/L HCl（5 L 去離子水加 0.45 mL HCl）透析 1 次，每次透析 12 h。冷凍干燥后獲得 CS-TBA。由于巰基在空氣中不穩定，易被氧化，CS-TBA 均于實驗前制備[10]。
1.3 載 BMP 多肽 P24 的 CS-TBA 水凝膠制備
① 稱取 200 mg CS-TBA 置于 9 mL 去離子水中，攪拌至完全溶解，靜置待氣泡消除后，加入 200 mg HA 粉末，繼續攪拌，超聲至分散均勻，制備 CS-TBA/HA 混合液。
② 稱取 40 mg P24 多肽溶于 800 μL 去離子水中，震蕩至完全溶解，制成濃度為 50 mg/mL 的多肽溶液。于 CS-TBA/HA 混合液中分別加入 200、400 μL 多肽溶液（含多肽 10、20 mg），攪拌至均勻，使獲得的混合液中 CS-TBA 與多肽比例分別為 20∶1 和 10∶1，制備 CS-TBA/5%P24/HA、CS-TBA/10%P24/HA 混合液。
③ 將 560 mg β-GP 溶于 1 mL 去離子水中，振蕩至完全溶解，再用注射器將其逐滴加入步驟①、② 中制備的 3 種混合液，注意邊攪拌邊加入[10]，37℃ 水浴 10 min，獲得 CS-TBA/HA/β-GP、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝膠。
1.4 動物模型制備及分組
將 18 只 SD 大鼠隨機分成 A、B、C 3 組，每組 6 只。各組大鼠按照 50 mg/kg 劑量腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉麻醉后，背部剃毛、消毒并鋪巾。于背部正中作切口，切開淺筋膜，鈍性分離兩側豎脊肌，制造豎脊肌肌袋。于各組大鼠豎脊肌肌袋內分別植入 CS-TBA/HA/β-GP 水凝膠（A 組）、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP 水凝膠（B 組）、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP 水凝膠（C 組）。切口拉攏縫合，肌肉注射 40 萬 U 青霉素預防感染。
1.5 觀測指標
1.5.1 一般情況
術后每日觀察各組大鼠存活以及活動、進食、精神狀態、切口是否發生感染等情況。
1.5.2 micro-CT 檢查
術后 4、8 周各組取 3 只大鼠斷頸處死，按照原切口入路，取出植入材料，分離材料周圍肌肉及軟組織，采用 Medical AG micro-CT 進行 CT 掃描及三維重建，掃描參數為 10 μm、120 kV、150 mA，成像時間 0.5 s。觀察各組新生骨形成情況，并采用 Philips Brilliance Workspace 軟件測量骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、皮質骨骨密度（bone mineral density，BMD）。
1.5.3 組織學觀察
micro-CT 檢查后，將標本置于 4% 多聚甲醛溶液固定，脫鈣 1 個月后脫水、透明并包埋于石蠟塊中，行組織塊切片（片厚 8 μm）。常規行 HE 及 Masson 染色，光鏡下觀察標本局部炎性反應及成骨情況。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 檢驗；組內比較采用 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后各組大鼠均存活至取材時間點，期間活動、進食及精神狀態均正常。切口均愈合良好，未出現紅腫、滲出等感染情況。
2.2 micro-CT 檢查
術后 4 周，A 組異位成骨效應較弱，未見明顯新生骨及骨小梁形成；B、C 組相較 A 組有較多新生骨形成。術后 8 周，A 組僅可見邊緣少許新生骨形成；B、C 組在植入材料和周圍組織的結合部位可見部分骨小梁及新生骨形成，且 C 組新生骨形成及中心成骨較 B 組明顯。見圖 1。
術后各組 Tb.Th、Tb.N、BMD 逐漸增加，除 A 組 Tb.Th 外，其余各指標組內 4 周與 8 周間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。各時間點，B、C 組 Tb.Th、Tb.N、BMD 明顯高于 A 組，C 組高于 B 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
各組 Tb.Th、Tb.N 及 BMD 比較（n=3，
）
Table1.
Comparison of Tb.Th, Tb.N, and BMD between groups (n=3,
)
2.3 組織學觀察
2.3.1 HE 染色
術后 4 周，A 組水凝膠材料未見明顯分解，周圍少量成骨樣細胞黏附；B、C 組可見水凝膠材料逐漸分解，內部大量成骨樣細胞黏附，且 C 組細胞多于 B 組。術后 8 周，A 組成骨樣細胞較 4 周增多，未見明顯礦化組織；B、C 組可見大量礦化組織長入，逐漸填滿水凝膠材料，且 C 組成骨效果較 B 組更明顯。見圖 2。
2.3.2 Masson 染色
術后 4 周，A 組未見纖維連接；B、C 組纖維連接逐漸形成，且 C 組多于 B 組，纖維形成邊緣逐漸有新骨生成，但是中央區域僅有纖維組織填充連接，可見大量藍色細胞核，無明顯骨組織。術后 8 周，A 組纖維連接逐漸形成，纖維形成邊緣有少量新骨形成；B、C 組纖維間隙和材料內部均有新骨長入，C 組更顯著，骨形成進一步增強，新骨進一步長入；B、C 組水凝膠材料開始出現分解，逐漸分成多個小部分，各部分出現新生骨小島的形成。見圖 3。
3 討論
本研究旨在通過異位成骨實驗來驗證 CS-TBA 水凝膠的成骨誘導效應。水凝膠材料，包括天然生物材料（淀粉、藻酸鹽、幾丁質/殼聚糖、透明質酸、膠原蛋白、絲綢等）及合成衍生生物材料（聚羥基酯、聚碳酸酯、聚磷腈等），已經被廣泛研究并應用于骨組織工程[11-16]。對比眾多的水凝膠材料，CS-TBA 水凝膠具有以下優點：① 自身具有滅菌性，能夠減少手術污染的風險；② 原材料便宜，能夠大規模合成；③ 可注射性能，常溫條件下為液態，在體內溫度、體內 pH 值條件下可短時間成膠[17]；④ 水溶性特性能夠搭載多種生物因子及復合材料，應用范圍廣泛[18]。
同時，本研究使用的 P24 多肽用于骨組織工程也比 BMP-2 更具有優勢，主要體現在以下方面：① 序列簡單，便于大規模合成，成本較低；② 線性結構，活性基團易于暴露，生物反應性好；③ 保留了 BMP-2 活性部分，成骨效果有保證[19]；④ 含有二硫鍵，易于修飾，形成穩定的共價結合[20]。
結合 CS-TBA 水凝膠及 P24 多肽的優點，我們成功制備了載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠。本課題組前期研究發現 CS-TBA 具有液態-凝膠態的生物性能，巰基化接枝 P24 多肽后能夠緩釋達 24 d，掃描電鏡下觀察包含的 HA 能夠均勻分布于水凝膠內[21]。因此，為了探究載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠材料作為骨修復材料的可行性，我們進行了大鼠皮下異位成骨實驗。本次研究中，micro-CT 三維重建圖像顯示 B、C 組成骨作用明顯高于 A 組，8 周成骨均比 4 周時明顯。此外，根據 micro-CT 數據分析，B、C 組 BMD 和 Tb.Th、Tb.N 均高于 A 組，表明載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠具有明顯的骨修復作用，并且隨著 P24 濃度的升高，C 組表現出更好的成骨效果。HE 染色及 Masson 染色結果顯示載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠材料具有良好的生物降解性，術后隨著 P24 濃度的提高，C 組礦化組織及新生骨的形成較 B 組增多，提示材料具有良好的骨誘導及成骨作用。
綜上述，載 P24 多肽 CS-TBA 水凝膠是一種具有應用前景的骨組織工程可注射材料。
圖1
術后 3 組 CT 三維重建觀察
從左至右為 A、B、C 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure1. Three-dimensional CT reconstruction images of 3 groups at each time point after operationFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
圖2
術后 3 組 HE 染色觀察（×200）
從左至右分別為 A、B、C 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure2. HE staining observation of 3 groups at each time point after operation (×200)From left to right for groups A, B, and C, respectivelya. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
圖3
術后 3 組 Masson 染色觀察（×400）
從左至右分別為 A、B、C 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周
Figure3. Masson staining observation of 3 groups at each time point after operation (×400)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
