引用本文： 朱立帆, 周建新, 曾金才, 張曉劍, 沈鵬程, 翁峰標. S100 鈣結合蛋白 B 在骨性關節炎軟骨損傷修復中的作用及機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(11): 1429-1434. doi: 10.7507/1002-1892.201804060 復制
骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是一種由于關節軟骨變性、骨質增生而引起的慢性進行性骨關節疾病，其發病機制尚不明確[1]。流行病學研究顯示[2]，55 歲以上人群發病率為 44%～70%，65 歲以上人群發病率高達 60%～70%。我國目前約有 1.5 億 OA 患者，其中 50%～70% 患者急需治療。所以有關 OA 發病機制的研究對于疾病的臨床防治具有十分重要的意義。有研究認為滑膜炎性反應是 OA 發病的早期階段，滑膜炎性反應時關節液中的炎性因子，如 IL-1β、TNF-α 等，能夠引起軟骨細胞肥大和細胞外基質降解，最終導致軟骨破壞[3-4]；同時，滑膜成纖維細胞（synovial fibroblasts，SF）也被激活，其能夠通過釋放 FGF-2 與 FGF 受體 1（FGF receptor 1，FGFR1）相互作用，來激活多種信號通路，調節滑膜炎性反應，從而影響軟骨損傷修復[5-6]。S100 鈣結合蛋白 B（S100B）是 S100 鈣結合蛋白家族成員之一，研究認為其與細胞的增殖、分化、凋亡密切相關[7]。近年來有關 S100 家族分子與滑膜炎和 OA 之間的關系越來越多地被關注，但有關 S100B 在 OA 發生發展中作用的研究尚不多見。本研究擬通過在家兔軟骨損傷誘發 OA 模型中檢測 S100B、FGF-2 和 FGFR1 通路分子的蛋白和基因表達水平變化，明確是否 S100B、FGF-2 和 FGFR1 參與到軟骨損傷的病理過程中，并在人 SF 中過表達和干擾 S100B 表達并拮抗 FGFR1，觀察 S100B 對 IL-1β 和 TNF-α 表達水平及 FGFR1 分子表達水平的影響，以探討 S100B 在 OA 軟骨損傷修復中的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康 4 月齡雌性新西蘭兔 20 只，體質量 3.2～3.8 kg，購自上海中科院實驗動物中心。
慢病毒細胞株（上海漢恒生物科技有限公司）；ELISA 檢測試劑盒（R&D 公司，美國）；PrimeScript RT 試劑盒（Promega 公司，美國）；SYBR Premix Ex Taq（Takara 公司，日本）；蛋白裂解液（南通碧云天生物技術研究所）；anti-S100、anti-FGF-2 及 anti-FGFR1 單克隆抗體（Abcam 公司，美國）。ABI 7500 擴增儀（ABI 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 體內實驗評價兔OA炎癥狀態及FGF-2/FGFR1信號通路變化
1.2.1 兔軟骨損傷模型制備及分組
取 20 只新西蘭兔隨機分為對照組和模型組，每組 10 只。模型組兔右膝關節管型石膏制動 4 周，對照組不作任何處理。4 周后分別取兩組膝關節軟骨組織及關節液用于后續檢測。
1.2.2 ELISA法檢測關節液IL-1β、TNF-α水平
通過在膝關節中注射 0.5 mL 生理鹽水后抽吸獲得兩組關節液，共重復 3 次抽吸過程，隨后將關節液以 2 200×g 離心 10 min 去除殘留細胞。將獲得的關節液參照 ELISA 試劑盒說明書方法檢測 IL-1β 和 TNF-α 表達水平。
1.2.3 實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測軟骨組織中S100B、FGF-2、FGFR1基因表達
從內側股骨髁中間區域取兩組軟骨組織，經液氮研磨后，采用 Trizol 試劑抽提總 RNA，用 PrimeScript RT 試劑盒進行逆轉錄。PCR 反應條件：94℃、4 min，94℃、40 s，52℃、40 s，72℃、40 s，40 個循環。采用 SYBR Premix Ex Taq 在 ABI 7500 擴增儀上進行定量 PCR，PCR 結果采用 2-ΔΔCt法進行分析。引物序列見表 1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes in qRT-PCR test
1.2.4 Western blot檢測軟骨組織S100B、FGF-2、FGFR1蛋白表達
同上法取軟骨組織經液氮研磨后，采用蛋白裂解液進行蛋白裂解，用 SDS-PAGE 電泳進行分析并轉移至聚偏氟乙烯膜上，5% 脫脂牛奶封閉后，采用 anti-S100、anti-FGF-2 及 anti-FGFR1 單克隆抗體進行孵育，以 GAPDH 單克隆抗體作為內參。蛋白采用化學發光法進行檢測，將獲得的蛋白條帶采用 Image J 軟件進行定量分析。
1.3 體外實驗評價細胞炎癥狀態及FGF-2/FGFR1信號通路的變化
1.3.1 人SF的分離培養
關節鏡下取正常人外傷后膝關節滑膜組織，無菌條件下剪碎，0.25% 胰蛋白酶消化 5 min；FBS 終止消化，以 2 220×g 離心 5 min，棄上層液體，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養液，100 目篩網過濾；調整細胞密度至 4×108個/L，轉移至細胞培養瓶，37℃、5%CO2 培養箱中培養。隔 3 d 換液1 次，倒置相差顯微鏡下觀察可見細胞呈均一貼壁樣生長。當細胞生長至 85% 融合時，采用 0.25% 胰蛋白酶消化、傳代。根據文獻[8]方法，采用 Western blot 法檢測細胞中 CD55 分子的表達，鑒定培養細胞為人 SF。將細胞進行傳代實現 SF 的純化，收集第 3～5 代細胞用于后續實驗。
1.3.2 過表達或干擾S100B對人SF炎性因子表達及FGF-2/FGFR1信號通路的影響
將實驗分為 4 組：A 組，人 SF 不作任何處理；B 組，采用對照病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L 脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激；C 組，采用 S100 過表達病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；D 組，采用 S100 干擾病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激。
操作步驟：取第 3～5 代人 SF，以每孔 1×105個細胞接種至 6 孔板，并在轉染前 1 d 生長至融合度達 30%。將上述培養細胞按分組采用慢病毒轉染實現 S100B 的過表達和干擾，具體轉染方法參照上海漢恒生物科技有限公司說明書方法進行。各組培養 48 h 后，同上法采用 ELISA 檢測細胞上清中 IL-1β、TNF-α 表達水平，采用 qRT-PCR 和 Western blot 分別檢測人 SF 中 FGF-2、FGFR1 基因和蛋白表達。實驗均重復 5 次，取均值。
1.3.3 拮抗FGFR1對人SF炎性因子表達及FGF-2/FGFR1信號通路的影響
將實驗分為 4 組：A1 組，人 SF 不作任何處理；B1 組，采用對照病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；C1 組，采用 S100 過表達病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；D1 組：采用 S100 過表達及 FGFR1 干擾病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激。
操作步驟：取第 3～5 代人 SF，以每孔 1×105個細胞接種至 6 孔板，并在轉染前 1 d 生長至融合度達 30%。將上述培養細胞按分組采用慢病毒轉染實現 S100B 的過表達和 FGFR1 干擾，具體轉染方法參照上海漢恒生物科技有限公司說明書方法進行。各組培養 48 h 后，同上法采用 ELISA 檢測細胞上清中 IL-1β、TNF-α 表達水平，采用 qRT-PCR 和 Western blot 分別檢測人 SF 中 FGFR1 基因和蛋白表達。實驗均重復 5 次，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 體內實驗評價兔OA炎癥狀態及FGF-2/FGFR1信號通路變化
ELISA 檢測示對照組和模型組兔關節液中 IL-1β 表達水平分別為（18.3±2.4）、（55.7±6.1）pg/mL，TNF-α 表達水平分別為（105.6±23.1）、（385.4±56.9）pg/mL，兩組比較差異均有統計學意義（t=18.042，P=0.000；t=14.408，P=0.000）。
qRT-PCR 和 Western blot 檢測示，模型組兔軟骨組織 S100B、FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
qRT-PCR和Western blot檢測兩組兔軟骨組織各基因和蛋白表達
a. qRT-PCR 檢測；b. Western blot 檢測 1：對照組 2：模型組
Figure1. The expressions of genes and proteins in cartilage tissues of two groups of rabbits detected by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Control group 2: Model group
2.2 體外實驗評價細胞炎癥狀態及FGF-2/FGFR1信號通路的變化
2.2.1 過表達或干擾S100B對人SF炎性因子分泌及FGF-2/FGFR1信號通路的影響
ELISA 檢測示，B、C 組 IL-1β、TNF-α 表達水平顯著高于 A、D 組，C 組高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
ELISA檢測各組IL-1β、TNF-α表達（n=5，pg/mL，
）
Table2.
Expressions of IL-1β and TNF-α tested by ELISA (n=5, pg/mL,
)
qRT-PCR 和 Western blot 檢測示，B、C 組 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表達量均顯著高于 A、D 組，C 組高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而 A、D 組FGF-2、 FGFR1 mRNA 和蛋白表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
qRT-PCR和Western blot檢測過表達或干擾S100B對人SF各基因和蛋白表達的影響
a. qRT-PCR 檢測；b. Western blot 檢測 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組
Figure2. The effects of S100B overexpression or knockdown on human SF gene and protein expressions detectd by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
2.2.2 拮抗FGFR1對人SF炎性因子分泌及FGF-2/FGFR1信號通路的影響
ELISA 檢測示，B1、C1 組 IL-1β、TNF-α 表達水平顯著高于 A1、D1 組，C1 組高于 B1 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A1、D1 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
ELISA檢測各組IL-1β、TNF-α表達（n=5，pg/mL，
）
Table3.
Expressions of IL-1β and TNF-α detected by ELISA (n=5, pg/mL,
)
qRT-PCR 和 Western blot 檢測示，B1、C1 組 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表達量均顯著高于 A1、D1 組，C1 組高于 B1 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D1 組 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表達量均顯著低于 A1 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
qRT-PCR和Western blot檢測拮抗FGFR1對人SF各基因和蛋白表達的影響
a. qRT-PCR 檢測；b. Western blot 檢測 1：A1 組 2：B1 組 3：C1 組 4：D1 組
Figure3. The effects of FGFR1 knockdown on human SF gene and protein expressions detected by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Group A1 2: Group B1 3: Group C1 4: Group D1
3 討論
OA 臨床上主要表現為關節疼痛、活動受限和畸形，致殘率較高，嚴重影響患者生活質量。鎮痛、抗炎藥物是目前臨床治療 OA 的主要手段，然而這些藥物僅能減輕患者痛苦，在延緩疾病進展上作用不大。晚期 OA 患者需行關節置換術。因此，探索 OA 的發病機制，尋找延緩或阻止其發生、發展的治療靶點，對于疾病的早期防治至關重要。從解剖學特點來看，關節軟骨內無血管、淋巴管和神經支配，主要靠關節腔內的滑膜液維持營養，所以損傷后較難修復。關節軟骨機械磨損后啟動了炎性介質介導的關節組織異常重建過程是導致 OA 的主要原因，該過程主要包括關節軟骨細胞肥大和細胞外基質降解兩方面[9]。S100B 是 S100 鈣結合蛋白家族成員之一，在細胞的增殖、分化、凋亡中發揮重要作用。目前已有研究[10]表明 S100 家族的 S100A4、S100A8 和 S100A11 等參與了關節軟骨損傷修復過程。
FGFs 家族包含 23 種，在胚胎發育和維持體內穩態平衡中起重要作用。其中 FGF-2 在多個組織中表達，既往研究認為 FGF-2 具有促進軟骨細胞增殖和促進軟骨修復的作用[11-12]。然而也有研究認為，FGF-2 的促細胞分裂作用并未致力于軟骨細胞的再生，反而是參加了軟骨基質的降解。Wang 等[13]發現 FGF-2 可通過 MEK/ERK 信號通路激活 RUNX2，從而上調 OA 患者關節軟骨細胞金屬基質蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）的表達，促進細胞外基質降解。Schmal 等[14]發現 FGF-2 可降低關節軟骨細胞中Ⅱ型膠原含量，導致軟骨細胞纖維化。此外，FGF-2 還能通過 ERK1/2、p38、JNK 或 NF-κb/Elk-1 途徑刺激關節軟骨細胞 MMP-13 高表達[15-16]。FGFRs 屬于酪氨酸蛋白激酶家族，是 FGFs 的受體。一般認為，FGFR1 和 FGFR3 是調節關節軟骨代謝的關鍵受體。FGFR1 和 FGFR3 均能被 FGF-2 激活，Yan 等[17]認為 FGFR3 信號主要是促進關節軟骨合成，而 FGFR1 信號主要是促進其降解。
鑒于以上結果，我們推測 S100B 可能在 OA 的發病過程中發揮重要作用，其可能作用機制是誘導 SF 分泌 FGF、IL-1β、TNF-α 等細胞因子，調節炎性反應而影響軟骨損傷修復。因此，我們設想通過調節 SF 中 S100B 的表達，觀察其對 FGF、FGFR1、IL-1β、TNF-α 等的影響，探討其在關節軟骨損傷修復中的作用。本研究結果發現，軟骨損傷模型兔關節組織中 S100B、FGF-2、FGFR1 表達明顯增加，關節液中 IL-1β、TNF-α 水平明顯增加。提示 S100B、FGF-2、FGFR1、IL-1β、TNF-α 可能參與了 OA 軟骨損傷修復的過程。推測其可能的作用機制是 S100B 誘導 SF 分泌 FGF 等細胞因子，與 FGFR1 受體結合并激活多種信號通路，調節 IL-1β、TNF-α 等炎性細胞因子的表達，調節滑膜炎性反應，從而參與 OA 軟骨損傷修復。為進一步證實我們的推測，本研究體外培養人 SF，通過過表達、干擾 S100B 表達和拮抗 FGFR1 表達，觀察其對關節軟骨損傷修復的影響。結果顯示，過表達 S100B 會使 FGFR1 表達增加，IL-1β、TNF-α 水平增加；干擾 S100B 表達，則 FGFR1 表達以及 IL-1β、TNF-α 水平均降低。過表達 S100B，同時拮抗 FGFR1 表達時，IL-1β、TNF-α 表達均降低。說明 S100B 是通過激活 FGF-2/FGFR1 信號通路而上調 IL-1β、TNF-α，從而加劇軟骨損傷。所以，干擾 S100B 或拮抗 FGFR1 表達能夠促進關節軟骨損傷修復。
綜上述，S100B 能夠調節人 SF 炎性反應，進而影響 OA 軟骨損傷修復，其機制可能與激活 FGF-2/FGFR1 信號通路有關。但本研究還存在一些局限性，實驗樣本局限于動物模型及細胞，未從軟骨損傷患者中收集相關樣本驗證 S100B 的表達水平以及對 FGF-2/FGFR1 信號通路的影響。因此，需要進一步收集臨床樣本對本研究結果進行進一步確認。
骨性關節炎（osteoarthritis，OA）是一種由于關節軟骨變性、骨質增生而引起的慢性進行性骨關節疾病，其發病機制尚不明確[1]。流行病學研究顯示[2]，55 歲以上人群發病率為 44%～70%，65 歲以上人群發病率高達 60%～70%。我國目前約有 1.5 億 OA 患者，其中 50%～70% 患者急需治療。所以有關 OA 發病機制的研究對于疾病的臨床防治具有十分重要的意義。有研究認為滑膜炎性反應是 OA 發病的早期階段，滑膜炎性反應時關節液中的炎性因子，如 IL-1β、TNF-α 等，能夠引起軟骨細胞肥大和細胞外基質降解，最終導致軟骨破壞[3-4]；同時，滑膜成纖維細胞（synovial fibroblasts，SF）也被激活，其能夠通過釋放 FGF-2 與 FGF 受體 1（FGF receptor 1，FGFR1）相互作用，來激活多種信號通路，調節滑膜炎性反應，從而影響軟骨損傷修復[5-6]。S100 鈣結合蛋白 B（S100B）是 S100 鈣結合蛋白家族成員之一，研究認為其與細胞的增殖、分化、凋亡密切相關[7]。近年來有關 S100 家族分子與滑膜炎和 OA 之間的關系越來越多地被關注，但有關 S100B 在 OA 發生發展中作用的研究尚不多見。本研究擬通過在家兔軟骨損傷誘發 OA 模型中檢測 S100B、FGF-2 和 FGFR1 通路分子的蛋白和基因表達水平變化，明確是否 S100B、FGF-2 和 FGFR1 參與到軟骨損傷的病理過程中，并在人 SF 中過表達和干擾 S100B 表達并拮抗 FGFR1，觀察 S100B 對 IL-1β 和 TNF-α 表達水平及 FGFR1 分子表達水平的影響，以探討 S100B 在 OA 軟骨損傷修復中的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康 4 月齡雌性新西蘭兔 20 只，體質量 3.2～3.8 kg，購自上海中科院實驗動物中心。
慢病毒細胞株（上海漢恒生物科技有限公司）；ELISA 檢測試劑盒（R&D 公司，美國）；PrimeScript RT 試劑盒（Promega 公司，美國）；SYBR Premix Ex Taq（Takara 公司，日本）；蛋白裂解液（南通碧云天生物技術研究所）；anti-S100、anti-FGF-2 及 anti-FGFR1 單克隆抗體（Abcam 公司，美國）。ABI 7500 擴增儀（ABI 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 體內實驗評價兔OA炎癥狀態及FGF-2/FGFR1信號通路變化
1.2.1 兔軟骨損傷模型制備及分組
取 20 只新西蘭兔隨機分為對照組和模型組，每組 10 只。模型組兔右膝關節管型石膏制動 4 周，對照組不作任何處理。4 周后分別取兩組膝關節軟骨組織及關節液用于后續檢測。
1.2.2 ELISA法檢測關節液IL-1β、TNF-α水平
通過在膝關節中注射 0.5 mL 生理鹽水后抽吸獲得兩組關節液，共重復 3 次抽吸過程，隨后將關節液以 2 200×g 離心 10 min 去除殘留細胞。將獲得的關節液參照 ELISA 試劑盒說明書方法檢測 IL-1β 和 TNF-α 表達水平。
1.2.3 實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測軟骨組織中S100B、FGF-2、FGFR1基因表達
從內側股骨髁中間區域取兩組軟骨組織，經液氮研磨后，采用 Trizol 試劑抽提總 RNA，用 PrimeScript RT 試劑盒進行逆轉錄。PCR 反應條件：94℃、4 min，94℃、40 s，52℃、40 s，72℃、40 s，40 個循環。采用 SYBR Premix Ex Taq 在 ABI 7500 擴增儀上進行定量 PCR，PCR 結果采用 2-ΔΔCt法進行分析。引物序列見表 1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes in qRT-PCR test
1.2.4 Western blot檢測軟骨組織S100B、FGF-2、FGFR1蛋白表達
同上法取軟骨組織經液氮研磨后，采用蛋白裂解液進行蛋白裂解，用 SDS-PAGE 電泳進行分析并轉移至聚偏氟乙烯膜上，5% 脫脂牛奶封閉后，采用 anti-S100、anti-FGF-2 及 anti-FGFR1 單克隆抗體進行孵育，以 GAPDH 單克隆抗體作為內參。蛋白采用化學發光法進行檢測，將獲得的蛋白條帶采用 Image J 軟件進行定量分析。
1.3 體外實驗評價細胞炎癥狀態及FGF-2/FGFR1信號通路的變化
1.3.1 人SF的分離培養
關節鏡下取正常人外傷后膝關節滑膜組織，無菌條件下剪碎，0.25% 胰蛋白酶消化 5 min；FBS 終止消化，以 2 220×g 離心 5 min，棄上層液體，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養液，100 目篩網過濾；調整細胞密度至 4×108個/L，轉移至細胞培養瓶，37℃、5%CO2 培養箱中培養。隔 3 d 換液1 次，倒置相差顯微鏡下觀察可見細胞呈均一貼壁樣生長。當細胞生長至 85% 融合時，采用 0.25% 胰蛋白酶消化、傳代。根據文獻[8]方法，采用 Western blot 法檢測細胞中 CD55 分子的表達，鑒定培養細胞為人 SF。將細胞進行傳代實現 SF 的純化，收集第 3～5 代細胞用于后續實驗。
1.3.2 過表達或干擾S100B對人SF炎性因子表達及FGF-2/FGFR1信號通路的影響
將實驗分為 4 組：A 組，人 SF 不作任何處理；B 組，采用對照病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L 脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激；C 組，采用 S100 過表達病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；D 組，采用 S100 干擾病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激。
操作步驟：取第 3～5 代人 SF，以每孔 1×105個細胞接種至 6 孔板，并在轉染前 1 d 生長至融合度達 30%。將上述培養細胞按分組采用慢病毒轉染實現 S100B 的過表達和干擾，具體轉染方法參照上海漢恒生物科技有限公司說明書方法進行。各組培養 48 h 后，同上法采用 ELISA 檢測細胞上清中 IL-1β、TNF-α 表達水平，采用 qRT-PCR 和 Western blot 分別檢測人 SF 中 FGF-2、FGFR1 基因和蛋白表達。實驗均重復 5 次，取均值。
1.3.3 拮抗FGFR1對人SF炎性因子表達及FGF-2/FGFR1信號通路的影響
將實驗分為 4 組：A1 組，人 SF 不作任何處理；B1 組，采用對照病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；C1 組，采用 S100 過表達病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；D1 組：采用 S100 過表達及 FGFR1 干擾病毒處理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激。
操作步驟：取第 3～5 代人 SF，以每孔 1×105個細胞接種至 6 孔板，并在轉染前 1 d 生長至融合度達 30%。將上述培養細胞按分組采用慢病毒轉染實現 S100B 的過表達和 FGFR1 干擾，具體轉染方法參照上海漢恒生物科技有限公司說明書方法進行。各組培養 48 h 后，同上法采用 ELISA 檢測細胞上清中 IL-1β、TNF-α 表達水平，采用 qRT-PCR 和 Western blot 分別檢測人 SF 中 FGFR1 基因和蛋白表達。實驗均重復 5 次，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 體內實驗評價兔OA炎癥狀態及FGF-2/FGFR1信號通路變化
ELISA 檢測示對照組和模型組兔關節液中 IL-1β 表達水平分別為（18.3±2.4）、（55.7±6.1）pg/mL，TNF-α 表達水平分別為（105.6±23.1）、（385.4±56.9）pg/mL，兩組比較差異均有統計學意義（t=18.042，P=0.000；t=14.408，P=0.000）。
qRT-PCR 和 Western blot 檢測示，模型組兔軟骨組織 S100B、FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
qRT-PCR和Western blot檢測兩組兔軟骨組織各基因和蛋白表達
a. qRT-PCR 檢測；b. Western blot 檢測 1：對照組 2：模型組
Figure1. The expressions of genes and proteins in cartilage tissues of two groups of rabbits detected by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Control group 2: Model group
2.2 體外實驗評價細胞炎癥狀態及FGF-2/FGFR1信號通路的變化
2.2.1 過表達或干擾S100B對人SF炎性因子分泌及FGF-2/FGFR1信號通路的影響
ELISA 檢測示，B、C 組 IL-1β、TNF-α 表達水平顯著高于 A、D 組，C 組高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
ELISA檢測各組IL-1β、TNF-α表達（n=5，pg/mL，
）
Table2.
Expressions of IL-1β and TNF-α tested by ELISA (n=5, pg/mL,
)
qRT-PCR 和 Western blot 檢測示，B、C 組 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表達量均顯著高于 A、D 組，C 組高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；而 A、D 組FGF-2、 FGFR1 mRNA 和蛋白表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
qRT-PCR和Western blot檢測過表達或干擾S100B對人SF各基因和蛋白表達的影響
a. qRT-PCR 檢測；b. Western blot 檢測 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組
Figure2. The effects of S100B overexpression or knockdown on human SF gene and protein expressions detectd by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
2.2.2 拮抗FGFR1對人SF炎性因子分泌及FGF-2/FGFR1信號通路的影響
ELISA 檢測示，B1、C1 組 IL-1β、TNF-α 表達水平顯著高于 A1、D1 組，C1 組高于 B1 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A1、D1 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
ELISA檢測各組IL-1β、TNF-α表達（n=5，pg/mL，
）
Table3.
Expressions of IL-1β and TNF-α detected by ELISA (n=5, pg/mL,
)
qRT-PCR 和 Western blot 檢測示，B1、C1 組 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表達量均顯著高于 A1、D1 組，C1 組高于 B1 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D1 組 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表達量均顯著低于 A1 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
qRT-PCR和Western blot檢測拮抗FGFR1對人SF各基因和蛋白表達的影響
a. qRT-PCR 檢測；b. Western blot 檢測 1：A1 組 2：B1 組 3：C1 組 4：D1 組
Figure3. The effects of FGFR1 knockdown on human SF gene and protein expressions detected by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Group A1 2: Group B1 3: Group C1 4: Group D1
3 討論
OA 臨床上主要表現為關節疼痛、活動受限和畸形，致殘率較高，嚴重影響患者生活質量。鎮痛、抗炎藥物是目前臨床治療 OA 的主要手段，然而這些藥物僅能減輕患者痛苦，在延緩疾病進展上作用不大。晚期 OA 患者需行關節置換術。因此，探索 OA 的發病機制，尋找延緩或阻止其發生、發展的治療靶點，對于疾病的早期防治至關重要。從解剖學特點來看，關節軟骨內無血管、淋巴管和神經支配，主要靠關節腔內的滑膜液維持營養，所以損傷后較難修復。關節軟骨機械磨損后啟動了炎性介質介導的關節組織異常重建過程是導致 OA 的主要原因，該過程主要包括關節軟骨細胞肥大和細胞外基質降解兩方面[9]。S100B 是 S100 鈣結合蛋白家族成員之一，在細胞的增殖、分化、凋亡中發揮重要作用。目前已有研究[10]表明 S100 家族的 S100A4、S100A8 和 S100A11 等參與了關節軟骨損傷修復過程。
FGFs 家族包含 23 種，在胚胎發育和維持體內穩態平衡中起重要作用。其中 FGF-2 在多個組織中表達，既往研究認為 FGF-2 具有促進軟骨細胞增殖和促進軟骨修復的作用[11-12]。然而也有研究認為，FGF-2 的促細胞分裂作用并未致力于軟骨細胞的再生，反而是參加了軟骨基質的降解。Wang 等[13]發現 FGF-2 可通過 MEK/ERK 信號通路激活 RUNX2，從而上調 OA 患者關節軟骨細胞金屬基質蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）的表達，促進細胞外基質降解。Schmal 等[14]發現 FGF-2 可降低關節軟骨細胞中Ⅱ型膠原含量，導致軟骨細胞纖維化。此外，FGF-2 還能通過 ERK1/2、p38、JNK 或 NF-κb/Elk-1 途徑刺激關節軟骨細胞 MMP-13 高表達[15-16]。FGFRs 屬于酪氨酸蛋白激酶家族，是 FGFs 的受體。一般認為，FGFR1 和 FGFR3 是調節關節軟骨代謝的關鍵受體。FGFR1 和 FGFR3 均能被 FGF-2 激活，Yan 等[17]認為 FGFR3 信號主要是促進關節軟骨合成，而 FGFR1 信號主要是促進其降解。
鑒于以上結果，我們推測 S100B 可能在 OA 的發病過程中發揮重要作用，其可能作用機制是誘導 SF 分泌 FGF、IL-1β、TNF-α 等細胞因子，調節炎性反應而影響軟骨損傷修復。因此，我們設想通過調節 SF 中 S100B 的表達，觀察其對 FGF、FGFR1、IL-1β、TNF-α 等的影響，探討其在關節軟骨損傷修復中的作用。本研究結果發現，軟骨損傷模型兔關節組織中 S100B、FGF-2、FGFR1 表達明顯增加，關節液中 IL-1β、TNF-α 水平明顯增加。提示 S100B、FGF-2、FGFR1、IL-1β、TNF-α 可能參與了 OA 軟骨損傷修復的過程。推測其可能的作用機制是 S100B 誘導 SF 分泌 FGF 等細胞因子，與 FGFR1 受體結合并激活多種信號通路，調節 IL-1β、TNF-α 等炎性細胞因子的表達，調節滑膜炎性反應，從而參與 OA 軟骨損傷修復。為進一步證實我們的推測，本研究體外培養人 SF，通過過表達、干擾 S100B 表達和拮抗 FGFR1 表達，觀察其對關節軟骨損傷修復的影響。結果顯示，過表達 S100B 會使 FGFR1 表達增加，IL-1β、TNF-α 水平增加；干擾 S100B 表達，則 FGFR1 表達以及 IL-1β、TNF-α 水平均降低。過表達 S100B，同時拮抗 FGFR1 表達時，IL-1β、TNF-α 表達均降低。說明 S100B 是通過激活 FGF-2/FGFR1 信號通路而上調 IL-1β、TNF-α，從而加劇軟骨損傷。所以，干擾 S100B 或拮抗 FGFR1 表達能夠促進關節軟骨損傷修復。
綜上述，S100B 能夠調節人 SF 炎性反應，進而影響 OA 軟骨損傷修復，其機制可能與激活 FGF-2/FGFR1 信號通路有關。但本研究還存在一些局限性，實驗樣本局限于動物模型及細胞，未從軟骨損傷患者中收集相關樣本驗證 S100B 的表達水平以及對 FGF-2/FGFR1 信號通路的影響。因此，需要進一步收集臨床樣本對本研究結果進行進一步確認。
