引用本文： 黎牧帆, 張二洋, 呂雷鋒, 班文瑞, 黨曉謙, 張晨. 維生素 E 對大鼠早期激素性股骨頭缺血性壞死的作用及機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(11): 1421-1428. doi: 10.7507/1002-1892.201801046 復制
激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）是指長期使用糖皮質激素后，以骨小梁和骨髓破壞為特征性表現的疾病。股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femoral head，ANFH）是骨科常見疾病，近年來發病率呈逐年上升趨勢，尤其是在激素治療大量應用于臨床之后，SANFH 發病率逐年增高，約占非創傷性骨壞死的 40%[1]。若未經有效治療，約 80% SANFH 會快速進展至股骨頭塌陷，并出現不同程度的疼痛及關節功能障礙，最終需行人工全髖關節置換術[2-3]。目前，ANFH 發病機制尚未闡明，前期研究表明細胞凋亡在 SANFH 中起重要作用。體外細胞實驗和動物實驗均發現激素可誘發骨細胞和成骨細胞凋亡[4-5]。在器官移植術后患者的骨髓中也發現了相同現象[6]。另有研究表明，激素可通過線粒體依賴性細胞凋亡途徑誘發骨細胞和成骨細胞凋亡[7-9]。在線粒體依賴性細胞凋亡中，細胞毒素通過 Bax/Bak 依賴機制破壞線粒體膜的完整性，導致大量活性氧釋放，氧化應激的發生進一步損傷線粒體，導致促凋亡蛋白質細胞色素-c 的釋放，并與凋亡酶激活因子（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）、胱天蛋白酶原 9（procaspase-9）結合形成活性胱天蛋白酶 9（Caspase-9），從而激活 Caspase-3，最終導致細胞凋亡的發生。維生素 E 作為天然抗氧化劑，可對氧離子進行高效清除，從而大幅度減輕氧化應激的損害[10-11]，其應用領域廣泛，但在 SANFH 中的相關研究很少。本實驗選擇維生素 E 作為大鼠早期 SANFH 的干預劑，探討其通過影響線粒體依賴性骨細胞凋亡通路延緩骨壞死的作用及發生機制，以期為早期 SANFH 防治策略提供思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12 月齡清潔級雄性 SD 大鼠 72 只，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。動物均在同一條件下飼養，給予普通飼料、自由飲水；環境滿足 12 h/12 h 的光暗循環，溫度 18～25℃，濕度 40%～60%。實驗前適應性喂養 1 周。
脂多糖、EDTA 脫鈣劑、DAB 顯色試劑盒、免疫組織化學檢測試劑盒（Sigma 公司，美國）；甲潑尼龍（Pfizer 公司，美國）； RIPA 蛋白裂解液（北京普利萊生物試劑公司）；氨芐青霉素（Genview 公司，美國）；TUNEL 凋亡試劑盒（Promega 公司，美國）；Caspase-3 抗鼠抗體、Caspase-9 抗鼠抗體、細胞色素-c（cytochrome-c，Cyt-c）抗鼠抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；辣根過氧化酶標記羊抗鼠二抗（Santa Cruz 公司，美國）；ECL 化學發光顯色液、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore 公司，美國）；脫脂乳溶液（伊利實業集團股份有限公司）；SDS-PAGE 凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。
Olympus BX-40 光學顯微鏡（OLYMPUS 公司，日本）；Leica-RM2128 型切片機（Leica 公司，德國）；臺式低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；Image-J 圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；Quantity One 凝膠圖像軟件（上海培清科技有限公司）。
1.2 大鼠 SANFH 模型制備及分組
將 72 只大鼠以隨機數字表法分為對照組、模型組和干預組，每組 24 只。對照組大鼠不作任何處理，作為正常對照。模型組及干預組大鼠采用脂多糖聯合激素法制備 SANFH 模型，具體步驟如下：大鼠每天經尾靜脈注射脂多糖 10 μg/kg，連續 3 d；于注射脂多糖的第 3 天開始，每天肌肉注射甲潑尼龍 20 mg/kg，連續 7 d。干預組大鼠在注射甲潑尼龍的同時每天肌肉注射維生素 E 40 mg/kg，連續 7 d。兩組大鼠每天均肌肉注射 10 萬 U 青霉素，預防感染。末次甲潑尼龍注射后 2、4、8周，各組分別選取 8 只大鼠，脊椎脫臼法處死，切取雙側股骨頭標本進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
記錄各組大鼠存活情況，以及造模期間模型組和干預組大鼠活動、飲食、體質量等一般情況。
1.3.2 組織學觀察
各時間點，取各組大鼠左側股骨頭置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，10%EDTA 脫鈣液脫鈣，常規石蠟包埋后沿冠狀面切片，片厚 5 μm。取部分切片行 HE 染色，光鏡下觀察骨和骨髓組織病理改變，有無骨壞死發生。依據國際骨循環研究會和 Ficat 提出的骨壞死組織病理特征[12]，將骨壞死鏡下診斷標準概括為：骨髓內造血細胞發生壞死、髓腔被大量變性脂肪細胞或融合的脂肪泡填充，骨小梁內骨細胞死亡、大量空骨陷窩形成，壞死區周圍出現修復反應，如新的骨小梁形成和肉芽組織纖維化。于 200 倍鏡下選取 10～15 個視野，每個視野計數 20～30 個骨細胞，計算空骨陷窩率。
1.3.3 細胞凋亡觀察
參照試劑盒說明書，取各時間點各組部分石蠟組織切片進行 TUNEL 染色。光鏡下觀察細胞凋亡情況，TUNEL 染色陽性細胞胞核呈棕色，少數細胞質中會出現陽性顆粒。于 200 倍鏡下，每張切片隨機選取 10 個視野，每個視野計數骨細胞總數及陽性細胞數，按以下公式計算細胞凋亡指數。細胞凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
各時間點各組取部分石蠟切片，采用 HRP-DAB 法檢測 Caspase-3、Caspase-9、Cyt-c 的表達情況。石蠟切片二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，采用檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）進行抗原修復；滴加 3% 過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，室溫孵育 10 min；滴加 5% BSA 37℃ 封閉 30 min 進行非特異性抗原封閉；孵育對應的一抗 Caspase-3 兔抗鼠抗體、Caspase-9 兔抗鼠抗體、Cyt-c 兔抗鼠抗體，濕盒內 4℃ 過夜，TBS（pH7.5）溶液 5 次 5 min 浸洗，滴加辣根過氧化酶標記二抗，37℃ 孵育 30 min，TBS 浸洗，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，光鏡下觀察。陽性染色呈棕黃色。采用 Image-J 軟件進行定量分析，計算陽性細胞百分比。
1.3.5 Western blot 檢測
各時間點，取各組右側股骨頭以冷 PBS 反復洗滌，浸入 RIPA 緩沖液，置于液氮中研磨 20 min，萃取上清液，4℃ 以離心半徑7cm、12 000 r/min 離心 10 min。在 12% 分離膠及 5% 濃縮膠的 SDS- PAGE 凝膠上電泳，轉印到 PVDF 膜，用含 5% 脫脂乳溶液的 Tris 緩沖鹽（TBS）封閉，Caspase-3、Caspase-9、Cyt-c 一抗孵育，4℃ 過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育 2 h，ECL 發光。采用 Quantity One 凝膠圖像軟件分析目標條帶吸光度（A）值，以目標條帶與 β-actin 條帶 A 值比值來分析蛋白表達水平。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
模型組和干預組在造模過程中共死亡 6 只大鼠，死于機體急性反應 3 只、感染 3 只，均對應補充。模型組及干預組大鼠注射脂多糖第 1、2 天出現寒顫、蜷縮，飲食、活動均減少，精神較差；注射甲潑尼龍后第 1 天，活動、飲食、精神狀態逐漸恢復；1 周后，精神、活動、飲食均逐步恢復正常，體質量逐漸增加，四肢負重未見明顯異常；直至 8 周后，大鼠均出現跛行，其余情況正常。
2.2 組織學觀察
對照組：各時間點少見髓質細胞及骨細胞壞死，骨小梁形態正常、結構完整。模型組：2 周時，骨小梁出現輕微扭曲、毛糙以及少量空骨陷窩，髓腔內脂肪細胞水腫增大；4 周時，骨組織破壞加重，骨小梁出現斷裂及結構紊亂，空骨陷窩較 2 周時增多，骨髓腔內出現大量脂肪細胞空泡；8 周時，出現嚴重壞死骨，骨小梁結構嚴重破壞并伴大量斷裂，空骨陷窩進一步增多，髓腔內遍布脂肪空泡，髓質細胞大量壞死。干預組：2 周時，與模型組相比，骨小梁破壞程度稍輕，尚未見骨小梁斷裂，偶有空骨陷窩，髓腔內脂肪細胞體積增大；4 周時，骨小梁部分出現斷裂，可見較多空骨陷窩，髓腔內造血細胞減少、脂肪細胞增大且增多，病理結構整體較模型組更完整，但仍未達對照組水平；8 周時，骨壞死形成，骨髓腔內出現大量脂肪細胞空泡化現象，骨小梁變薄、扭曲、中斷，空骨陷窩進一步增多，但程度較模型組輕。見圖 1。
圖1
各時間點各組 HE 染色觀察（×200）
從左至右分別為對照組、模型組、干預組 a. 2 周；b. 4 周；c. 8 周
Figure1. HE staining of each group at different time points (×200)From left to right for control group, model group, and intervention group, respectively a. At 2 weeks; b. At 4 weeks; c. At 8 weeks
干預組空骨陷窩率與模型組相比，2 周時差異無統計學意義（P>0.05），4、8 周差異均有統計學意義（P<0.05）；與對照組相比，2、4 周時差異無統計學意義（P>0.05），8 周時差異有統計學意義（P<0.05）。模型組空骨陷窩率各時間點均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
各時間點各組股骨頭空骨陷窩率
Figure2.
The rate of empty lacunae of each group at different time points
2.3 細胞凋亡觀察
對照組骨小梁和骨髓中僅有少量散在分布的凋亡細胞，且隨時間延長無明顯變化；模型組及干預組骨小梁和髓腔內均可見凋亡細胞，并且隨時間延長凋亡細胞逐漸增多，但各時間點干預組凋亡細胞均明顯少于模型組。見圖 3。
圖3
各時間點各組 TUNEL 染色觀察（×200）
從左至右分別為對照組、模型組、干預組 a. 2 周；b. 4 周；c. 8 周
Figure3. TUNEL staining of each group at different time points (×200)From left to right for control group, model group, and intervention group, respectively a. At 2 weeks; b. At 4 weeks; c. At 8 weeks
各時間點干預組細胞凋亡指數均低于模型組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；與對照組相比，2、4 周時差異無統計學意義（P>0.05），8 周時差異有統計學意義（P<0.05）。各時間點模型組細胞凋亡指數均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
各時間點各組細胞凋亡指數
Figure4.
Apoptotic index of each group at different time points
2.4 免疫組織化學染色觀察
Cyt-c 染色顯示：陽性細胞主要出現在骨小梁以及髓腔邊緣的區域中。對照組陽性細胞少見；模型組陽性細胞明顯增多，主要分布于骨小梁的骨細胞及成骨細胞中；干預組陽性細胞相比模型組明顯減少，但仍高于對照組。各時間點，模型組 Cyt-c 陽性細胞百分比與對照組和干預組相比，差異均有統計學意義（P<0.05）；干預組與對照組相比，2 周時差異無統計學意義（P>0.05），4、8 周時差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
Caspase-9 染色顯示：模型組出現大量強染色陽性細胞，而對照組和干預組染色強度及陽性細胞數均低于模型組，干預組陽性細胞多于對照組，但染色強度基本相當。Caspase-3 染色顯示：與模型組相比，干預組陽性細胞明顯減少，但仍高于對照組。干預組 Caspase-9、Caspase-3 陽性細胞百分比與對照組相比，2、4 周時差異無統計學意義（P>0.05），8 周時差異有統計學意義（P<0.05）；與模型組相比，各時間點差異均有統計學意義（P<0.05）。模型組Caspase-9、Caspase-3陽性細胞百分比與對照組相比，各時間點差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
圖6
各時間點各組 Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9 陽性細胞百分比
a. Cyt-c；b. Caspase-9；c. Caspase-3
Figure6. The percent of positive cells of Cyt-c, Caspase-3, and Caspase-9 in each group at different time pointsa. Cyt-c; b. Caspase-9; c. Caspase-3
圖5
8 周各組 Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3 免疫組織化學染色觀察（×200）
從左至右分別為對照組、模型組、干預組 a. Cyt-c；b. Caspase-9；c. Caspase-3
Figure5. Immunohistochemical staining of Cyt-c, Caspase-9, and Caspase-3 in each group at 8 weeks (×200)From left to right for control group, model group, and intervention group a. Cyt-c; b. Caspase-9; c. Caspase-3
2.5 Western blot 檢測
各時間點，模型組 Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3 蛋白相對表達量最高，與對照組及干預組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。干預組以上蛋白相對表達量與對照組相比，2、4 周時差異均無統計學意義（P>0.05），8 周時差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 7、8。
圖7
Western blot 檢測各時間點各組蛋白表達
1：2 周；2：4 周；3：8 周 a. 對照組；b. 模型組；c.干預組
Figure7. Protein expressions of each group at different time points by Western blot1: At 2 weeks; 2: At 4 weeks; 3: At 8 weeks a. Control group; b. Model group; c. Intervention group
圖8
各時間點各組蛋白相對表達量
a. Cyt-c；b. Caspase-9；c. Caspase-3
Figure8. Relative expressions of Cyt-c, Caspase-9, and Caspase-3 in each group at different time pointsa. Cyt-c; b. Caspase-9; c. Caspase-3
3 討論
根據前期研究及文獻報道，線粒體依賴性細胞凋亡和氧化應激被認為與 SANFN 的發生有密切關系，而維生素 E 對骨壞死具有較強抑制作用。Tsuji 等[13]發現處于氧化應激狀態的細胞更容易出現凋亡現象。Zalavras 等[14]研究發現 SANFH 中細胞凋亡是激素和氧化應激共同作用的結果。Liu 等[8]發現糖皮質激素可以通過內源性凋亡通路激活 Caspase-3，進而導致 MC3T3-E1 成骨細胞的凋亡。Xu 等[9]報道內源性 Caspase-3 上調導致細胞凋亡是 SANFH 主要致病因素。
在維生素 E 抑制骨壞死的機制研究中，Kuribayashi 等[15]發現在兔骨壞死模型中，維生素 E 可通過減少血液和血管中的氧化應激來抑制血管損傷，從而維持抗血小板和抗凝作用。Mikami 等[16]發現在兔骨壞死模型中，維生素 E 可阻止過氧化物的過度產生，并可增強體內抗氧化劑谷胱甘肽的作用。本實驗通過構建鼠 SANFH 模型，造模的同時給予維生素 E 進行干預，探討線粒體依賴性凋亡信號通路在 SANFH 中的作用，以及在應用維生素 E 抗氧化之后骨壞死的改變，以期為 SANFH 發病機制提供新的理論依據，為早期SANFH防治提供理論基礎。
本研究結果表明，在 SANFH 早期確實存在骨細胞和成骨細胞凋亡現象。糖皮質激素的使用導致線粒體依賴性凋亡信號通路中的關鍵蛋白 Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3 表達升高，而在使用維生素 E 后上述關鍵蛋白表達下降；而且干預組組織病理學表現以及 TUNEL 凋亡檢測結果均提示其骨壞死程度較模型組輕，表明維生素 E 可以干預細胞凋亡的發生，從而預防或延緩 SANFH 的發生。文獻報道，細胞毒素通過 Bax/Bak 依賴機制導致線粒體外膜形成孔，使得線粒體膜完整性受到干擾，導致線粒體跨膜電位（DWm）的減少及促凋亡蛋白質組的釋放[17-18]。而線粒體作為活性氧主要來源部位，在各種外來因素刺激下，內部呼吸鏈受到干擾，電子傳遞過程受損，會導致大量活性氧的釋放[19-20]。維生素 E 作為天然抗氧化劑，可直接清除氧離子，參與體內抗氧化系統，保護細胞免受自由基攻擊[10-11]。因此，維生素 E 干預骨細胞凋亡可能的作用機制是：糖皮質激素的使用導致線粒體損傷，線粒體損傷后釋放大量活性氧自由基，活性氧自由基介導氧化應激發生后進一步損傷線粒體，從而導致促凋亡蛋白 Cyt-c 的釋放，Cyt-c 復合體最終形成活性 Caspase-9，從而激活 Caspase-3，最終導致細胞凋亡發生；而維生素 E 清除了細胞內的大量活性氧自由基，避免了氧化應激對線粒體的進一步損傷，從而大幅降低了 Caspase 級聯反應介導的細胞凋亡強度，延緩了 SANFH 進展。因此，我們認為激素引起的氧化應激介導的線粒體依賴性凋亡信號通路是大鼠 SANFH 早期病變的重要病理過程，而維生素 E 可延緩該病理進程的發展。
綜上述，本研究結果提示線粒體依賴性細胞凋亡可作為大鼠早期 SANFH 的重要機制之一，維生素 E 干預可作為一種早期防治策略。但維生素 E 干預的最佳劑量、療程以及藥物作用的靶點，仍需要進一步探討。
激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）是指長期使用糖皮質激素后，以骨小梁和骨髓破壞為特征性表現的疾病。股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of femoral head，ANFH）是骨科常見疾病，近年來發病率呈逐年上升趨勢，尤其是在激素治療大量應用于臨床之后，SANFH 發病率逐年增高，約占非創傷性骨壞死的 40%[1]。若未經有效治療，約 80% SANFH 會快速進展至股骨頭塌陷，并出現不同程度的疼痛及關節功能障礙，最終需行人工全髖關節置換術[2-3]。目前，ANFH 發病機制尚未闡明，前期研究表明細胞凋亡在 SANFH 中起重要作用。體外細胞實驗和動物實驗均發現激素可誘發骨細胞和成骨細胞凋亡[4-5]。在器官移植術后患者的骨髓中也發現了相同現象[6]。另有研究表明，激素可通過線粒體依賴性細胞凋亡途徑誘發骨細胞和成骨細胞凋亡[7-9]。在線粒體依賴性細胞凋亡中，細胞毒素通過 Bax/Bak 依賴機制破壞線粒體膜的完整性，導致大量活性氧釋放，氧化應激的發生進一步損傷線粒體，導致促凋亡蛋白質細胞色素-c 的釋放，并與凋亡酶激活因子（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）、胱天蛋白酶原 9（procaspase-9）結合形成活性胱天蛋白酶 9（Caspase-9），從而激活 Caspase-3，最終導致細胞凋亡的發生。維生素 E 作為天然抗氧化劑，可對氧離子進行高效清除，從而大幅度減輕氧化應激的損害[10-11]，其應用領域廣泛，但在 SANFH 中的相關研究很少。本實驗選擇維生素 E 作為大鼠早期 SANFH 的干預劑，探討其通過影響線粒體依賴性骨細胞凋亡通路延緩骨壞死的作用及發生機制，以期為早期 SANFH 防治策略提供思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12 月齡清潔級雄性 SD 大鼠 72 只，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。動物均在同一條件下飼養，給予普通飼料、自由飲水；環境滿足 12 h/12 h 的光暗循環，溫度 18～25℃，濕度 40%～60%。實驗前適應性喂養 1 周。
脂多糖、EDTA 脫鈣劑、DAB 顯色試劑盒、免疫組織化學檢測試劑盒（Sigma 公司，美國）；甲潑尼龍（Pfizer 公司，美國）； RIPA 蛋白裂解液（北京普利萊生物試劑公司）；氨芐青霉素（Genview 公司，美國）；TUNEL 凋亡試劑盒（Promega 公司，美國）；Caspase-3 抗鼠抗體、Caspase-9 抗鼠抗體、細胞色素-c（cytochrome-c，Cyt-c）抗鼠抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；辣根過氧化酶標記羊抗鼠二抗（Santa Cruz 公司，美國）；ECL 化學發光顯色液、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore 公司，美國）；脫脂乳溶液（伊利實業集團股份有限公司）；SDS-PAGE 凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。
Olympus BX-40 光學顯微鏡（OLYMPUS 公司，日本）；Leica-RM2128 型切片機（Leica 公司，德國）；臺式低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；Image-J 圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；Quantity One 凝膠圖像軟件（上海培清科技有限公司）。
1.2 大鼠 SANFH 模型制備及分組
將 72 只大鼠以隨機數字表法分為對照組、模型組和干預組，每組 24 只。對照組大鼠不作任何處理，作為正常對照。模型組及干預組大鼠采用脂多糖聯合激素法制備 SANFH 模型，具體步驟如下：大鼠每天經尾靜脈注射脂多糖 10 μg/kg，連續 3 d；于注射脂多糖的第 3 天開始，每天肌肉注射甲潑尼龍 20 mg/kg，連續 7 d。干預組大鼠在注射甲潑尼龍的同時每天肌肉注射維生素 E 40 mg/kg，連續 7 d。兩組大鼠每天均肌肉注射 10 萬 U 青霉素，預防感染。末次甲潑尼龍注射后 2、4、8周，各組分別選取 8 只大鼠，脊椎脫臼法處死，切取雙側股骨頭標本進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
記錄各組大鼠存活情況，以及造模期間模型組和干預組大鼠活動、飲食、體質量等一般情況。
1.3.2 組織學觀察
各時間點，取各組大鼠左側股骨頭置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，10%EDTA 脫鈣液脫鈣，常規石蠟包埋后沿冠狀面切片，片厚 5 μm。取部分切片行 HE 染色，光鏡下觀察骨和骨髓組織病理改變，有無骨壞死發生。依據國際骨循環研究會和 Ficat 提出的骨壞死組織病理特征[12]，將骨壞死鏡下診斷標準概括為：骨髓內造血細胞發生壞死、髓腔被大量變性脂肪細胞或融合的脂肪泡填充，骨小梁內骨細胞死亡、大量空骨陷窩形成，壞死區周圍出現修復反應，如新的骨小梁形成和肉芽組織纖維化。于 200 倍鏡下選取 10～15 個視野，每個視野計數 20～30 個骨細胞，計算空骨陷窩率。
1.3.3 細胞凋亡觀察
參照試劑盒說明書，取各時間點各組部分石蠟組織切片進行 TUNEL 染色。光鏡下觀察細胞凋亡情況，TUNEL 染色陽性細胞胞核呈棕色，少數細胞質中會出現陽性顆粒。于 200 倍鏡下，每張切片隨機選取 10 個視野，每個視野計數骨細胞總數及陽性細胞數，按以下公式計算細胞凋亡指數。細胞凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
各時間點各組取部分石蠟切片，采用 HRP-DAB 法檢測 Caspase-3、Caspase-9、Cyt-c 的表達情況。石蠟切片二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，采用檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）進行抗原修復；滴加 3% 過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，室溫孵育 10 min；滴加 5% BSA 37℃ 封閉 30 min 進行非特異性抗原封閉；孵育對應的一抗 Caspase-3 兔抗鼠抗體、Caspase-9 兔抗鼠抗體、Cyt-c 兔抗鼠抗體，濕盒內 4℃ 過夜，TBS（pH7.5）溶液 5 次 5 min 浸洗，滴加辣根過氧化酶標記二抗，37℃ 孵育 30 min，TBS 浸洗，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，光鏡下觀察。陽性染色呈棕黃色。采用 Image-J 軟件進行定量分析，計算陽性細胞百分比。
1.3.5 Western blot 檢測
各時間點，取各組右側股骨頭以冷 PBS 反復洗滌，浸入 RIPA 緩沖液，置于液氮中研磨 20 min，萃取上清液，4℃ 以離心半徑7cm、12 000 r/min 離心 10 min。在 12% 分離膠及 5% 濃縮膠的 SDS- PAGE 凝膠上電泳，轉印到 PVDF 膜，用含 5% 脫脂乳溶液的 Tris 緩沖鹽（TBS）封閉，Caspase-3、Caspase-9、Cyt-c 一抗孵育，4℃ 過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育 2 h，ECL 發光。采用 Quantity One 凝膠圖像軟件分析目標條帶吸光度（A）值，以目標條帶與 β-actin 條帶 A 值比值來分析蛋白表達水平。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
模型組和干預組在造模過程中共死亡 6 只大鼠，死于機體急性反應 3 只、感染 3 只，均對應補充。模型組及干預組大鼠注射脂多糖第 1、2 天出現寒顫、蜷縮，飲食、活動均減少，精神較差；注射甲潑尼龍后第 1 天，活動、飲食、精神狀態逐漸恢復；1 周后，精神、活動、飲食均逐步恢復正常，體質量逐漸增加，四肢負重未見明顯異常；直至 8 周后，大鼠均出現跛行，其余情況正常。
2.2 組織學觀察
對照組：各時間點少見髓質細胞及骨細胞壞死，骨小梁形態正常、結構完整。模型組：2 周時，骨小梁出現輕微扭曲、毛糙以及少量空骨陷窩，髓腔內脂肪細胞水腫增大；4 周時，骨組織破壞加重，骨小梁出現斷裂及結構紊亂，空骨陷窩較 2 周時增多，骨髓腔內出現大量脂肪細胞空泡；8 周時，出現嚴重壞死骨，骨小梁結構嚴重破壞并伴大量斷裂，空骨陷窩進一步增多，髓腔內遍布脂肪空泡，髓質細胞大量壞死。干預組：2 周時，與模型組相比，骨小梁破壞程度稍輕，尚未見骨小梁斷裂，偶有空骨陷窩，髓腔內脂肪細胞體積增大；4 周時，骨小梁部分出現斷裂，可見較多空骨陷窩，髓腔內造血細胞減少、脂肪細胞增大且增多，病理結構整體較模型組更完整，但仍未達對照組水平；8 周時，骨壞死形成，骨髓腔內出現大量脂肪細胞空泡化現象，骨小梁變薄、扭曲、中斷，空骨陷窩進一步增多，但程度較模型組輕。見圖 1。
圖1
各時間點各組 HE 染色觀察（×200）
從左至右分別為對照組、模型組、干預組 a. 2 周；b. 4 周；c. 8 周
Figure1. HE staining of each group at different time points (×200)From left to right for control group, model group, and intervention group, respectively a. At 2 weeks; b. At 4 weeks; c. At 8 weeks
干預組空骨陷窩率與模型組相比，2 周時差異無統計學意義（P>0.05），4、8 周差異均有統計學意義（P<0.05）；與對照組相比，2、4 周時差異無統計學意義（P>0.05），8 周時差異有統計學意義（P<0.05）。模型組空骨陷窩率各時間點均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
各時間點各組股骨頭空骨陷窩率
Figure2.
The rate of empty lacunae of each group at different time points
2.3 細胞凋亡觀察
對照組骨小梁和骨髓中僅有少量散在分布的凋亡細胞，且隨時間延長無明顯變化；模型組及干預組骨小梁和髓腔內均可見凋亡細胞，并且隨時間延長凋亡細胞逐漸增多，但各時間點干預組凋亡細胞均明顯少于模型組。見圖 3。
圖3
各時間點各組 TUNEL 染色觀察（×200）
從左至右分別為對照組、模型組、干預組 a. 2 周；b. 4 周；c. 8 周
Figure3. TUNEL staining of each group at different time points (×200)From left to right for control group, model group, and intervention group, respectively a. At 2 weeks; b. At 4 weeks; c. At 8 weeks
各時間點干預組細胞凋亡指數均低于模型組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；與對照組相比，2、4 周時差異無統計學意義（P>0.05），8 周時差異有統計學意義（P<0.05）。各時間點模型組細胞凋亡指數均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
各時間點各組細胞凋亡指數
Figure4.
Apoptotic index of each group at different time points
2.4 免疫組織化學染色觀察
Cyt-c 染色顯示：陽性細胞主要出現在骨小梁以及髓腔邊緣的區域中。對照組陽性細胞少見；模型組陽性細胞明顯增多，主要分布于骨小梁的骨細胞及成骨細胞中；干預組陽性細胞相比模型組明顯減少，但仍高于對照組。各時間點，模型組 Cyt-c 陽性細胞百分比與對照組和干預組相比，差異均有統計學意義（P<0.05）；干預組與對照組相比，2 周時差異無統計學意義（P>0.05），4、8 周時差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
Caspase-9 染色顯示：模型組出現大量強染色陽性細胞，而對照組和干預組染色強度及陽性細胞數均低于模型組，干預組陽性細胞多于對照組，但染色強度基本相當。Caspase-3 染色顯示：與模型組相比，干預組陽性細胞明顯減少，但仍高于對照組。干預組 Caspase-9、Caspase-3 陽性細胞百分比與對照組相比，2、4 周時差異無統計學意義（P>0.05），8 周時差異有統計學意義（P<0.05）；與模型組相比，各時間點差異均有統計學意義（P<0.05）。模型組Caspase-9、Caspase-3陽性細胞百分比與對照組相比，各時間點差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
圖6
各時間點各組 Cyt-c、Caspase-3、Caspase-9 陽性細胞百分比
a. Cyt-c；b. Caspase-9；c. Caspase-3
Figure6. The percent of positive cells of Cyt-c, Caspase-3, and Caspase-9 in each group at different time pointsa. Cyt-c; b. Caspase-9; c. Caspase-3
圖5
8 周各組 Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3 免疫組織化學染色觀察（×200）
從左至右分別為對照組、模型組、干預組 a. Cyt-c；b. Caspase-9；c. Caspase-3
Figure5. Immunohistochemical staining of Cyt-c, Caspase-9, and Caspase-3 in each group at 8 weeks (×200)From left to right for control group, model group, and intervention group a. Cyt-c; b. Caspase-9; c. Caspase-3
2.5 Western blot 檢測
各時間點，模型組 Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3 蛋白相對表達量最高，與對照組及干預組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。干預組以上蛋白相對表達量與對照組相比，2、4 周時差異均無統計學意義（P>0.05），8 周時差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 7、8。
圖7
Western blot 檢測各時間點各組蛋白表達
1：2 周；2：4 周；3：8 周 a. 對照組；b. 模型組；c.干預組
Figure7. Protein expressions of each group at different time points by Western blot1: At 2 weeks; 2: At 4 weeks; 3: At 8 weeks a. Control group; b. Model group; c. Intervention group
圖8
各時間點各組蛋白相對表達量
a. Cyt-c；b. Caspase-9；c. Caspase-3
Figure8. Relative expressions of Cyt-c, Caspase-9, and Caspase-3 in each group at different time pointsa. Cyt-c; b. Caspase-9; c. Caspase-3
3 討論
根據前期研究及文獻報道，線粒體依賴性細胞凋亡和氧化應激被認為與 SANFN 的發生有密切關系，而維生素 E 對骨壞死具有較強抑制作用。Tsuji 等[13]發現處于氧化應激狀態的細胞更容易出現凋亡現象。Zalavras 等[14]研究發現 SANFH 中細胞凋亡是激素和氧化應激共同作用的結果。Liu 等[8]發現糖皮質激素可以通過內源性凋亡通路激活 Caspase-3，進而導致 MC3T3-E1 成骨細胞的凋亡。Xu 等[9]報道內源性 Caspase-3 上調導致細胞凋亡是 SANFH 主要致病因素。
在維生素 E 抑制骨壞死的機制研究中，Kuribayashi 等[15]發現在兔骨壞死模型中，維生素 E 可通過減少血液和血管中的氧化應激來抑制血管損傷，從而維持抗血小板和抗凝作用。Mikami 等[16]發現在兔骨壞死模型中，維生素 E 可阻止過氧化物的過度產生，并可增強體內抗氧化劑谷胱甘肽的作用。本實驗通過構建鼠 SANFH 模型，造模的同時給予維生素 E 進行干預，探討線粒體依賴性凋亡信號通路在 SANFH 中的作用，以及在應用維生素 E 抗氧化之后骨壞死的改變，以期為 SANFH 發病機制提供新的理論依據，為早期SANFH防治提供理論基礎。
本研究結果表明，在 SANFH 早期確實存在骨細胞和成骨細胞凋亡現象。糖皮質激素的使用導致線粒體依賴性凋亡信號通路中的關鍵蛋白 Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3 表達升高，而在使用維生素 E 后上述關鍵蛋白表達下降；而且干預組組織病理學表現以及 TUNEL 凋亡檢測結果均提示其骨壞死程度較模型組輕，表明維生素 E 可以干預細胞凋亡的發生，從而預防或延緩 SANFH 的發生。文獻報道，細胞毒素通過 Bax/Bak 依賴機制導致線粒體外膜形成孔，使得線粒體膜完整性受到干擾，導致線粒體跨膜電位（DWm）的減少及促凋亡蛋白質組的釋放[17-18]。而線粒體作為活性氧主要來源部位，在各種外來因素刺激下，內部呼吸鏈受到干擾，電子傳遞過程受損，會導致大量活性氧的釋放[19-20]。維生素 E 作為天然抗氧化劑，可直接清除氧離子，參與體內抗氧化系統，保護細胞免受自由基攻擊[10-11]。因此，維生素 E 干預骨細胞凋亡可能的作用機制是：糖皮質激素的使用導致線粒體損傷，線粒體損傷后釋放大量活性氧自由基，活性氧自由基介導氧化應激發生后進一步損傷線粒體，從而導致促凋亡蛋白 Cyt-c 的釋放，Cyt-c 復合體最終形成活性 Caspase-9，從而激活 Caspase-3，最終導致細胞凋亡發生；而維生素 E 清除了細胞內的大量活性氧自由基，避免了氧化應激對線粒體的進一步損傷，從而大幅降低了 Caspase 級聯反應介導的細胞凋亡強度，延緩了 SANFH 進展。因此，我們認為激素引起的氧化應激介導的線粒體依賴性凋亡信號通路是大鼠 SANFH 早期病變的重要病理過程，而維生素 E 可延緩該病理進程的發展。
綜上述，本研究結果提示線粒體依賴性細胞凋亡可作為大鼠早期 SANFH 的重要機制之一，維生素 E 干預可作為一種早期防治策略。但維生素 E 干預的最佳劑量、療程以及藥物作用的靶點，仍需要進一步探討。
