引用本文： 邢飛, 劉國明, 段鑫, 項舟. 尿源性干細胞在骨骼肌肉系統再生領域應用的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(11): 1477-1482. doi: 10.7507/1002-1892.201804024 復制
對于由創傷、退變、腫瘤、感染等原因導致的骨、神經、皮膚等骨骼肌肉系統組織缺損的治療，一直是臨床醫生面臨的巨大挑戰。隨著組織工程技術與再生醫學的快速發展，由成體干細胞、細胞因子及支架材料構建的組織工程修復材料，在多種組織缺損的修復再生方面展現了巨大潛力。目前成體干細胞主要來源于骨髓、脂肪、臍帶、胎盤等部位，這些成體干細胞的獲取均需通過骨髓穿刺、抽脂術等有創操作，為干細胞供體帶來一定痛苦[1]。
近年來，許多再生醫學研究者發現尿液中同樣存在一類具備穩定自我增殖能力及多向分化特性的成體干細胞，并將其命名為尿源性干細胞（urine derived stem cells，USCs）[2]。USCs 因具備多向分化潛能、來源不受限以及安全無創等優點，在組織再生領域具有極大應用潛力。因此，本文就目前 USCs 應用于骨骼肌肉系統修復的研究進展進行綜述。
1 USCs 的生物學特性
最早在上世紀 70 年代，Sutherland 等[3]就從新生兒尿液中分離得到了具備一定生存能力的脫落細胞。直到上世紀 90 年代，Racusen 等[4]從腎病型胱氨酸病患者尿液中，成功分離獲得了具備穩定增殖活性的腎小管樣細胞。2008 年，美國維克森大學再生醫學中心 Zhang 等[5]等比例混合無血清角質細胞培養基和胚胎成纖維細胞培養基構建復合培養基，并成功從人尿液中分離獲取了一類具備祖細胞特性以及穩定增殖能力的細胞，并將其命名為尿液祖細胞。之后陸續有研究者從尿液中同樣分離獲得了此類細胞，并證實此類尿液來源的細胞可穩定增殖，表達干細胞表面標記并具備多向分化能力[6]。隨后越來越多研究者又將此類尿液來源細胞稱為 USCs[2, 7]。
1.1 USCs 的分離培養
研究發現[5]，成人新鮮尿液每 200～300 毫升可分離獲得 4～5 個細胞克隆，經過 6 周傳代培養，單個細胞克隆可擴增至 1.0×108個細胞用于后續組織修復。此外，研究者還從泌尿系統疾病患者以及大皰表皮松解癥患者的尿液中，成功分離培養出 USCs[7-8]。Gao 等[9]通過分離不同年齡段供體（5～14 歲、30～40 歲、65～75 歲）的 USCs 并進行對比發現，5～14 歲組 USCs 相比于 30～40 歲組和 65～75 歲組具備更好的細胞增殖活性以及更低的細胞衰老率；此外，在進行成骨誘導后，5～14 組 USCs 成骨相關基因蛋白［ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）］表達明顯高于 30～40 歲組和 65～75 歲組。但該研究仍存在參與人群較少、年齡范圍較窄等不足。有關年齡對 USCs 增殖分化的影響有待進一步研究確認。Lang 等[10]從儲存了 1 d 的尿液中同樣分離出了 USCs，并發現細胞仍具備平滑肌細胞以及尿路上皮細胞的分化能力。
目前對于 USCs 培養所使用的培養基成分尚無統一標準。Zhang 等[5]最早采用等比例混合無血清角質細胞培養基和胚胎成纖維細胞培養基分離培養 USCs 。隨后汪泱等[11]和陳春媛等[12]構建了 LMM101 細胞培養基（已申請專利），同樣可用于 USCs 的分離培養。但不同成分培養基對 USCs 的增殖分化是否有差異仍需進一步研究確定。
1.2 USCs 的起源和細胞表面標記
目前大多數研究者認為 USCs 來源于泌尿系統的腎臟[13-14]。Bharadwaj 等[6]分離獲取上泌尿道來源的尿液并成功分離出了 USCs，證實 USCs 來源于上泌尿道腎臟。此外，USCs 流式細胞學結果提示，USCs 不表達造血干細胞表面標記，這一結果否定了 USCs 起源于血液經過腎小球過濾進入尿液的假說[15]。Bharadwaj 等[2]從 1 例接受男性腎臟移植的女性患者尿液中分離獲取 USCs，并行染色體表型鑒定發現了 Y 染色體的存在，這一發現充分證實了 USCs 來源于腎臟。目前有關 USCs 具體起源于腎臟哪個部位的研究仍較少。有研究發現 USCs 表達腎小球壁層上皮細胞特異性免疫表型，并推測 USCs 可能起源于腎臟的腎小球壁層上皮細胞[2]。此外，腎小球壁層上皮細胞可以發生上皮細胞-間充質轉化，即上皮細胞通過失去細胞極性以及與基底膜之間的連接，獲得遷移、抗凋亡等間質型細胞功能[16-17]。而這種多能分化細胞可以在腎小球中起干細胞的作用，分化為不同表型參與腎臟內部的修復過程[18]。但目前并無研究直接證實 USCs 起源于腎小球壁層上皮細胞，因此仍需進一步研究確定。
流式細胞學結果提示[2]，USCs 陽性表達 MSCs 表面標記 CD29、CD44、CD54、CD73、CD90、CD105、CD166 以及 STRO-1，不表達造血干細胞表面標記 CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45，同樣不表達上皮細胞表面標記 CD31。此外，研究者們還發現 USCs 表達胚胎干細胞表面標記 TRA1-60、TRA1-81、SSEA4、Sox2、Oct3/4、c-Myc、klf4[2]。
1.3 USCs 的多向分化能力
USCs 作為一類有多向分化能力的成體干細胞，通過不同條件培養基誘導，可以定向分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、尿路上皮細胞、內皮細胞、心肌細胞以及平滑肌細胞[2, 13, 19-21]。此外，Pei 等[22]發現 USCs 沉積的細胞外基質可以改善并增強因多次傳代導致軟骨分化能力下降的人 BMSCs 的軟骨分化能力，并認為 USCs 分泌的營養因子改善并促進了人 BMSCs 的軟骨分化能力。USCs 通過條件培養基進行內皮誘導后，可以在 Matrigel 基質膠上形成管腔狀結構，并特異性表達內皮細胞表面標記 CD31、血管性血友病因子、VEGF 受體 2、重組人血管內皮生長因子受體 1 及內皮型一氧化氮合酶[6]。Liu 等[19]通過負載 VEGF 微珠的誘導培養基培養 USCs 一段時間后，發現內皮細胞表面標記基因表達顯著提高。此外，USCs 經過神經細胞誘導分化后，約 40% 細胞表達神經細胞特異性基因蛋白[2, 6]。鑒于 USCs 具備的多種分化潛能，其可被應用于多種組織器官修復。
1.4 USCs 與其他來源 MSCs
目前骨骼肌肉系統再生領域應用最為廣泛的 MSCs 主要來源于骨髓、脂肪與胎盤等。但這些部位 MSCs 獲取需要通過骨髓穿刺、抽脂術等有創操作，而 USCs 分離獲取過程是完全無創的方式。此外，與其他來源原代 MSCs 細胞形態呈成纖維細胞樣不同，原代 USCs 細胞形態會因供體不同存在差異，細胞形態呈現從內皮細胞樣到成纖維細胞樣過渡，但通過連續細胞傳代，USCs 細胞形態逐漸呈現為均一的成纖維細胞樣。研究者認為 USCs 細胞形態的轉變是培養基對細胞的選擇作用，但其涉及到的生物學機制有待進一步研究[8]。
研究還發現 USCs 細胞增殖曲線與其他來源 MSCs 類似，呈典型的 S 形。USCs 細胞增殖過程大致可分為潛伏期、對數期和平臺期 3 個時期[6]。Kang 等[23]通過從同一供體分離獲取 USCs 和脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）并進行對比發現，USCs 相比于 ADSCs 具備更高的細胞增殖效率。與 BMSCs 隨細胞傳代端粒酶長度逐漸縮短不同，研究發現第 2～7 代 USCs 端粒酶長度基本保持不變，表明 USCs 具備更長的端粒酶長度以及更高的端粒酶活性[2]。Shi 等[24]發現端粒酶陽性表達的 USCs 在中年人中最高可達到 75%，在 50 歲以上表達比例仍可達到 50%～60%。單個端粒酶陽性表達的 USCs 可以穩定地經過 20 代增殖傳代達到 267個細胞；單個端粒酶陰性表達的 USCs 同樣可以穩定地經過 8～10 代增殖傳代達到 234個細胞[10, 24]。
USCs 與其他來源 MSCs 相比，同樣具備穩定的成骨、成脂以及成軟骨分化能力。此外，BMSCs 可以定向分化為平滑肌細胞和內皮細胞，但其轉化效率低，經過誘導分化只有 5%～10% 的 BMSCs 可以分化表達尿路上皮細胞特異性基因蛋白，這極大限制了 BMSCs 在尿路上皮修復重建領域的應用[25-26]。研究發現采用與 BMSCs 相同的尿路上皮細胞條件培養，60%～70%USCs 可以特異性表達尿路上皮特異性蛋白與基因（uroplakin-Ⅰa、Ⅲ），遠遠高于 BMSCs 誘導分化效率，并且 USCs 誘導分化得到的尿路上皮細胞在表達細胞間緊密連接相關基因蛋白（ZO-1、E-cadherin、Cingulin）的同時，具備與膀胱組織細胞相似的屏障功能[2, 13]。
外周血單核細胞與其他來源細胞混合時會增殖啟動免疫反應。然而研究發現[13]外周血單核細胞與 USCs 混合時，其增殖效率大大低于與 BMSCs 混合培養。此外炎癥抑制因子 IL-6、IL-8 在 USCs 組明顯低于 BMSCs 組，表明 USCs 對外周血單核細胞展現出更好的免疫調節作用[13]。
2 USCs 與骨骼肌肉系統修復
因 USCs 具備取材無創、來源廣泛以及良好的多向分化能力等優點，許多研究者開始將 USCs 應用于骨、軟骨、皮膚等骨骼肌肉系統的修復過程。
2.1 USCs 與骨修復
目前已有許多研究將 USCs 應用于骨修復重建研究中。Guan 等[27]利用硅酸鈣（calcium silicate，CS）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］構建 PLGA/CS 混合支架材料，通過刺激 Wnt/β-catenin 信號通路成功促進 USCs 體內成骨能力，并且證實混合支架材料促 USCs 成骨能力可以被 Wnt/β-catenin 信號抑制劑小豆蔻甙抑制。此外，該課題組還利用 BMP-2 慢病毒轉染促進 USCs 成骨能力，并將 BMP-2 慢病毒轉染的 USCs 搭載 β 磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）進行小鼠肌肉包埋 6 周后，組織學觀察發現有新骨形成，成骨相關基因蛋白 RUNX-2 和 OCN 表達明顯增高[28]。納米銀顆粒作為抗菌劑的一種，廣泛應用于涂層抗菌領域[29]。Qin 等[30]研究了納米銀顆粒對 USCs 細胞毒性以及成骨活性的影響，發現 4 μg/mL AgNP 濃度下開始觀察到濃度依賴性毒性；此外，還發現納米銀顆粒可以促進 USCs 成骨相關基因蛋白表達。該課題組認為納米銀顆粒可以作為獨立銀離子加入組織工程支架材料中，促進 USCs 成骨能力表達。還有研究采用 USCs 復合 β-TCP 植入小鼠股骨缺損模型中，一段時間后發現適量新骨形成[31]。目前對于 USCs 的骨組織修復雖然展現了一定修復效果，但其修復機制研究尚且不足，仍需進一步研究確認。
2.2 USCs 與軟骨修復
由創傷和骨關節炎引起的軟骨缺損一直是治療難點。目前軟骨缺損的治療主要依靠自體軟骨移植、微骨折、軟骨成形術等，但這些治療手段存在創傷大、軟骨修復效果不理想等不足[32]。許多研究發現 MSCs 可以定向分化為軟骨細胞，并表達相關特異性基因蛋白[33]。本課題組之前利用 USCs 和透明質酸鈉溶液構建了干細胞/透明質酸復合體系，并驗證了復合體系內 USCs 仍具備較好的生物學特性；體內實驗中發現，與單純應用透明質酸組相比，USCs 聯合透明質酸修復組有更多的新生軟骨，展現出了更好的軟骨缺損修復能力。此研究為細胞治療關節軟骨缺損提供了新的理論依據[34]。但目前有關 USCs 應用于關節軟骨缺損治療的研究仍較少，仍需更多的臨床研究證實 USCs 的軟骨修復能力。
2.3 USCs 與皮膚修復
許多研究發現 USCs 通過促進血管形成，進而加快皮膚組織的修復。Fu 等[35]利用 USCs 復合聚己內酯/明膠構建新型組織工程生物材料，并觀察其對兔全層皮膚缺損修復的療效發現，與單純聚己內酯/明膠相比，搭載了 USCs 組的傷口閉合速度更快，有更多血管和膠原生成。此外，該課題組還發現 USCs 可以釋放增強內皮細胞遷移、增殖和成血管能力的細胞因子（VEGF 和 TGF-β1）。在細胞治療過程中，干細胞對組織的修復再生能力主要通過旁分泌效應作用于受體細胞實現。而生物活性玻璃被證實可以增強干細胞的旁分泌作用，進而促進組織修復[36]。Zhang 等[37]研究發現，生物玻璃的離子產物可以促進 USCs 相關生長因子表達。通過生物玻璃粒子產物處理 USCs 獲得條件培養基，可以促進內皮細胞和成纖維細胞的增殖。該研究[37]體內實驗中發現經生物活性玻璃激活的 USCs，與未經處理過的 USCs 相比，有更多的血管生成以及膠原沉積，展現出更好的傷口修復能力。
外泌體是細胞分泌的的一類包含了 RNA 或細胞因子的小分子物質，被廣泛應用于疾病診斷與治療中[38]。Chen 等[39]成功分離獲取了 USCs 來源外泌體并進行相關生物學特性檢測。結果顯示，USCs 來源外泌體外觀呈杯狀或球形，直徑為（1.57±2.93）nm，陽性表達分子 CD63 和腫瘤易感基因 101 蛋白；USCs 來源外泌體富含傷口愈合相關蛋白，可以增強內皮細胞成血管能力、傷口愈合能力。該研究為 USCs 應用于糖尿病軟組織創傷修復提供了理論基礎。
2.4 USCs 與骨骼肌修復
許多研究已證實 USCs 經過誘導可以分化為骨骼肌細胞。Chen 等[40]發現 USCs 在進行肌源性誘導分化后，細胞形態由米粒樣向紡錘形改變；USCs 經過肌源性誘導分化后，體外穩定表達骨骼肌細胞譜系（skeletal muscle linage cells，Sk-MCs）轉錄物和蛋白質標記物（myf5、myoD、肌球蛋白和肌間線蛋白）；將標記過的 USCs 植入裸鼠脛骨肌 1 個月后，細胞在體內仍可穩定表達 CD117、CD133、CD146、SSEA-4 和 STRO-1，陰性表達 CD14、CD31、CD34 和 CD45。該研究表明 USCs 體內體外均可誘導分化為 SK-MCs。Kim 等[41]利用轉錄因子 MyoD 對 USCs 進行基因重編，經過誘導分化成功建立了人類肌源細胞。
2.5 USCs 與神經修復
研究證實 USCs 可以經過誘導分化為神經樣細胞，但目前將 USCs 應用于神經修復的研究仍較少。將 USCs 復合水凝膠植入小鼠動物模型中發現 USCs 可以遷移至顱內病灶部位，并表達與神經表型相關蛋白質[21]。Yang 等[42]通過海綿體注射色素上皮衍生因子基因修飾的 USCs 可以有效對海綿體神經進行修復，并且可以阻止海綿體結構的進一步破壞，改善海綿體內內皮細胞功能，增加平滑肌含量，減少細胞凋亡。
3 USCs 與骨骼肌肉系統疾病模型的構建
誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSs）是指將多能遺傳基因導入體細胞，在其他誘導因子的作用下進行基因的重新排列，進而獲取得到類似胚胎干細胞的具備多向分化潛能的細胞[43-44]。目前許多研究通過分離不同疾病患者尿液中的 USCs 進行基因重編，構建 iPSs 骨骼肌肉系統疾病的細胞模型，用于骨骼肌肉系統疾病的診斷、篩選有效藥物以及機制學研究。無創來源 USCs 構建的多能干細胞與胚胎干細胞高度相似，在罕見疾病細胞模型構建以及藥物篩選等方面具備廣闊的應用前景。
肌肉疾病涉及到的大量基因突變需要進行個體化的檢測與治療，因此構建肌肉系統疾病的細胞模型十分必要。成纖維細胞是目前廣泛應用于多能干細胞構建的一種細胞來源[45]，但成纖維細胞的獲取需要通過有創的皮膚活檢。Kim 等[41]將 MyoD 基因導入 USCs 并對其進行基因重編，成功構建出人類肌源性細胞疾病模型，并證實此構建過程高效可重復。Zhang 等[46]從患有常染色體顯性遺傳疾病陣發性運動興奮性運動障礙的患者尿液中分離獲取得到 USCs，構建疾病特異性人 iPSs 細胞模型，用于疾病細胞機制相關研究。Afzal 等[47]成功從肌營養不良患者的尿液中分離獲取 USCs，并利用仙臺病毒進行病毒轉導，成功構建出 iPSs 特異性疾病模型用于后續研究。Wang 等[48]利用 TGF-β 顯著提高了 USCs 進行基因重編構建 iPSs 的效率，該方法為 USCs 基因重編提供了一種簡化方式。M Lee 等[49]從唐氏綜合征患者尿液中分離獲取 USCs 并誘導生成 iPSs，彌補了先前產生的 T21-iPSs 的不足，并認為 USCs-iPSs 可以良好地應用于唐氏綜合征以及其他神經發育退行性疾病模型的構建。
4 USCs 的臨床應用
我們通過廣泛查閱臨床注冊研究信息，發現目前有關 USCs 的國家臨床注冊研究仍較少。王琛等分離獲取 20～79 歲正常糖耐量志愿者以及 2 型糖尿病患者的 USCs 后，用于糖尿病的治療及相關機制研究（臨床注冊號：ChiCTR1800016260）。王墨等從正常兒童清潔中段尿中分離獲取 USCs，通過體內體外實驗探討 PI3K/Akt/mTORC1 信號通路激活是否參與原發性腎病綜合征慢性化進展，以及 USCs 移植是否通過旁分泌、抗炎抗氧化損傷和調節 PI3K/Akt/mTORC1 信號通路活化狀態而保護腎臟（臨床注冊號：ChiCTR-ROC-17013715）。兩項研究均處于初級階段，尚未得出臨床隨訪結果。此外，目前尚無有關 USCs 直接應用于人體骨骼肌肉系統疾病修復的相關臨床研究報道。隨著研究者們對 USCs 相關生物學特性研究的深入，我們相信未來會有更多的 USCs 臨床研究報道出現。
5 小結與展望
許多基礎以及臨床研究結果表明，MSCs 對骨骼肌肉系統具備一定的再生修復能力，但其細胞類型、細胞劑量、治療頻率以及修復方式存在巨大差異[50-52]。不同組織來源的 MSCs 雖然均具備 MSCs 的特性，但是在細胞生物學特性以及組織修復能力方面仍存在一定差異。因此發現不同來源的 MSCs 為不同組織的修復再生提供了更多可能性。此外，如何提高干細胞體內存活率、豐富干細胞來源以及細胞相關倫理學問題，同樣是干細胞研究者亟待解決的問題。
目前組織工程與再生醫學的研究者們已經發現了多種不同來源的 MSCs，包括骨髓、脂肪、胎盤、臍帶、外周血以及尿液等組織[53-55]。USCs 作為近年來發現的一種無創來源的成體干細胞，表達 MSCs 表面分子標記，具備良好的細胞增殖能力，經過誘導可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、尿路上皮細胞、內皮細胞、心肌細胞以及平滑肌細胞。近年來 USCs 開始被廣泛應用于骨骼肌肉系統的修復重建中，并展現了一定的修復效果。但有關 USCs 的生物學特點以及組織修復的分子生物學機制尚需進一步研究確定。此外，許多研究者通過分離獲取不同罕見骨骼肌肉疾病患者尿液中的 USCs 進行基因重編構建 iPSs，應用于罕見疾病細胞模型構建以及特異性藥物篩選。總之，USCs 作為一種新發現的無創來源的干細胞，在骨骼肌肉系統修復領域有著廣闊的應用前景。
對于由創傷、退變、腫瘤、感染等原因導致的骨、神經、皮膚等骨骼肌肉系統組織缺損的治療，一直是臨床醫生面臨的巨大挑戰。隨著組織工程技術與再生醫學的快速發展，由成體干細胞、細胞因子及支架材料構建的組織工程修復材料，在多種組織缺損的修復再生方面展現了巨大潛力。目前成體干細胞主要來源于骨髓、脂肪、臍帶、胎盤等部位，這些成體干細胞的獲取均需通過骨髓穿刺、抽脂術等有創操作，為干細胞供體帶來一定痛苦[1]。
近年來，許多再生醫學研究者發現尿液中同樣存在一類具備穩定自我增殖能力及多向分化特性的成體干細胞，并將其命名為尿源性干細胞（urine derived stem cells，USCs）[2]。USCs 因具備多向分化潛能、來源不受限以及安全無創等優點，在組織再生領域具有極大應用潛力。因此，本文就目前 USCs 應用于骨骼肌肉系統修復的研究進展進行綜述。
1 USCs 的生物學特性
最早在上世紀 70 年代，Sutherland 等[3]就從新生兒尿液中分離得到了具備一定生存能力的脫落細胞。直到上世紀 90 年代，Racusen 等[4]從腎病型胱氨酸病患者尿液中，成功分離獲得了具備穩定增殖活性的腎小管樣細胞。2008 年，美國維克森大學再生醫學中心 Zhang 等[5]等比例混合無血清角質細胞培養基和胚胎成纖維細胞培養基構建復合培養基，并成功從人尿液中分離獲取了一類具備祖細胞特性以及穩定增殖能力的細胞，并將其命名為尿液祖細胞。之后陸續有研究者從尿液中同樣分離獲得了此類細胞，并證實此類尿液來源的細胞可穩定增殖，表達干細胞表面標記并具備多向分化能力[6]。隨后越來越多研究者又將此類尿液來源細胞稱為 USCs[2, 7]。
1.1 USCs 的分離培養
研究發現[5]，成人新鮮尿液每 200～300 毫升可分離獲得 4～5 個細胞克隆，經過 6 周傳代培養，單個細胞克隆可擴增至 1.0×108個細胞用于后續組織修復。此外，研究者還從泌尿系統疾病患者以及大皰表皮松解癥患者的尿液中，成功分離培養出 USCs[7-8]。Gao 等[9]通過分離不同年齡段供體（5～14 歲、30～40 歲、65～75 歲）的 USCs 并進行對比發現，5～14 歲組 USCs 相比于 30～40 歲組和 65～75 歲組具備更好的細胞增殖活性以及更低的細胞衰老率；此外，在進行成骨誘導后，5～14 組 USCs 成骨相關基因蛋白［ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）］表達明顯高于 30～40 歲組和 65～75 歲組。但該研究仍存在參與人群較少、年齡范圍較窄等不足。有關年齡對 USCs 增殖分化的影響有待進一步研究確認。Lang 等[10]從儲存了 1 d 的尿液中同樣分離出了 USCs，并發現細胞仍具備平滑肌細胞以及尿路上皮細胞的分化能力。
目前對于 USCs 培養所使用的培養基成分尚無統一標準。Zhang 等[5]最早采用等比例混合無血清角質細胞培養基和胚胎成纖維細胞培養基分離培養 USCs 。隨后汪泱等[11]和陳春媛等[12]構建了 LMM101 細胞培養基（已申請專利），同樣可用于 USCs 的分離培養。但不同成分培養基對 USCs 的增殖分化是否有差異仍需進一步研究確定。
1.2 USCs 的起源和細胞表面標記
目前大多數研究者認為 USCs 來源于泌尿系統的腎臟[13-14]。Bharadwaj 等[6]分離獲取上泌尿道來源的尿液并成功分離出了 USCs，證實 USCs 來源于上泌尿道腎臟。此外，USCs 流式細胞學結果提示，USCs 不表達造血干細胞表面標記，這一結果否定了 USCs 起源于血液經過腎小球過濾進入尿液的假說[15]。Bharadwaj 等[2]從 1 例接受男性腎臟移植的女性患者尿液中分離獲取 USCs，并行染色體表型鑒定發現了 Y 染色體的存在，這一發現充分證實了 USCs 來源于腎臟。目前有關 USCs 具體起源于腎臟哪個部位的研究仍較少。有研究發現 USCs 表達腎小球壁層上皮細胞特異性免疫表型，并推測 USCs 可能起源于腎臟的腎小球壁層上皮細胞[2]。此外，腎小球壁層上皮細胞可以發生上皮細胞-間充質轉化，即上皮細胞通過失去細胞極性以及與基底膜之間的連接，獲得遷移、抗凋亡等間質型細胞功能[16-17]。而這種多能分化細胞可以在腎小球中起干細胞的作用，分化為不同表型參與腎臟內部的修復過程[18]。但目前并無研究直接證實 USCs 起源于腎小球壁層上皮細胞，因此仍需進一步研究確定。
流式細胞學結果提示[2]，USCs 陽性表達 MSCs 表面標記 CD29、CD44、CD54、CD73、CD90、CD105、CD166 以及 STRO-1，不表達造血干細胞表面標記 CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45，同樣不表達上皮細胞表面標記 CD31。此外，研究者們還發現 USCs 表達胚胎干細胞表面標記 TRA1-60、TRA1-81、SSEA4、Sox2、Oct3/4、c-Myc、klf4[2]。
1.3 USCs 的多向分化能力
USCs 作為一類有多向分化能力的成體干細胞，通過不同條件培養基誘導，可以定向分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、尿路上皮細胞、內皮細胞、心肌細胞以及平滑肌細胞[2, 13, 19-21]。此外，Pei 等[22]發現 USCs 沉積的細胞外基質可以改善并增強因多次傳代導致軟骨分化能力下降的人 BMSCs 的軟骨分化能力，并認為 USCs 分泌的營養因子改善并促進了人 BMSCs 的軟骨分化能力。USCs 通過條件培養基進行內皮誘導后，可以在 Matrigel 基質膠上形成管腔狀結構，并特異性表達內皮細胞表面標記 CD31、血管性血友病因子、VEGF 受體 2、重組人血管內皮生長因子受體 1 及內皮型一氧化氮合酶[6]。Liu 等[19]通過負載 VEGF 微珠的誘導培養基培養 USCs 一段時間后，發現內皮細胞表面標記基因表達顯著提高。此外，USCs 經過神經細胞誘導分化后，約 40% 細胞表達神經細胞特異性基因蛋白[2, 6]。鑒于 USCs 具備的多種分化潛能，其可被應用于多種組織器官修復。
1.4 USCs 與其他來源 MSCs
目前骨骼肌肉系統再生領域應用最為廣泛的 MSCs 主要來源于骨髓、脂肪與胎盤等。但這些部位 MSCs 獲取需要通過骨髓穿刺、抽脂術等有創操作，而 USCs 分離獲取過程是完全無創的方式。此外，與其他來源原代 MSCs 細胞形態呈成纖維細胞樣不同，原代 USCs 細胞形態會因供體不同存在差異，細胞形態呈現從內皮細胞樣到成纖維細胞樣過渡，但通過連續細胞傳代，USCs 細胞形態逐漸呈現為均一的成纖維細胞樣。研究者認為 USCs 細胞形態的轉變是培養基對細胞的選擇作用，但其涉及到的生物學機制有待進一步研究[8]。
研究還發現 USCs 細胞增殖曲線與其他來源 MSCs 類似，呈典型的 S 形。USCs 細胞增殖過程大致可分為潛伏期、對數期和平臺期 3 個時期[6]。Kang 等[23]通過從同一供體分離獲取 USCs 和脂肪來源干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）并進行對比發現，USCs 相比于 ADSCs 具備更高的細胞增殖效率。與 BMSCs 隨細胞傳代端粒酶長度逐漸縮短不同，研究發現第 2～7 代 USCs 端粒酶長度基本保持不變，表明 USCs 具備更長的端粒酶長度以及更高的端粒酶活性[2]。Shi 等[24]發現端粒酶陽性表達的 USCs 在中年人中最高可達到 75%，在 50 歲以上表達比例仍可達到 50%～60%。單個端粒酶陽性表達的 USCs 可以穩定地經過 20 代增殖傳代達到 267個細胞；單個端粒酶陰性表達的 USCs 同樣可以穩定地經過 8～10 代增殖傳代達到 234個細胞[10, 24]。
USCs 與其他來源 MSCs 相比，同樣具備穩定的成骨、成脂以及成軟骨分化能力。此外，BMSCs 可以定向分化為平滑肌細胞和內皮細胞，但其轉化效率低，經過誘導分化只有 5%～10% 的 BMSCs 可以分化表達尿路上皮細胞特異性基因蛋白，這極大限制了 BMSCs 在尿路上皮修復重建領域的應用[25-26]。研究發現采用與 BMSCs 相同的尿路上皮細胞條件培養，60%～70%USCs 可以特異性表達尿路上皮特異性蛋白與基因（uroplakin-Ⅰa、Ⅲ），遠遠高于 BMSCs 誘導分化效率，并且 USCs 誘導分化得到的尿路上皮細胞在表達細胞間緊密連接相關基因蛋白（ZO-1、E-cadherin、Cingulin）的同時，具備與膀胱組織細胞相似的屏障功能[2, 13]。
外周血單核細胞與其他來源細胞混合時會增殖啟動免疫反應。然而研究發現[13]外周血單核細胞與 USCs 混合時，其增殖效率大大低于與 BMSCs 混合培養。此外炎癥抑制因子 IL-6、IL-8 在 USCs 組明顯低于 BMSCs 組，表明 USCs 對外周血單核細胞展現出更好的免疫調節作用[13]。
2 USCs 與骨骼肌肉系統修復
因 USCs 具備取材無創、來源廣泛以及良好的多向分化能力等優點，許多研究者開始將 USCs 應用于骨、軟骨、皮膚等骨骼肌肉系統的修復過程。
2.1 USCs 與骨修復
目前已有許多研究將 USCs 應用于骨修復重建研究中。Guan 等[27]利用硅酸鈣（calcium silicate，CS）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］構建 PLGA/CS 混合支架材料，通過刺激 Wnt/β-catenin 信號通路成功促進 USCs 體內成骨能力，并且證實混合支架材料促 USCs 成骨能力可以被 Wnt/β-catenin 信號抑制劑小豆蔻甙抑制。此外，該課題組還利用 BMP-2 慢病毒轉染促進 USCs 成骨能力，并將 BMP-2 慢病毒轉染的 USCs 搭載 β 磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）進行小鼠肌肉包埋 6 周后，組織學觀察發現有新骨形成，成骨相關基因蛋白 RUNX-2 和 OCN 表達明顯增高[28]。納米銀顆粒作為抗菌劑的一種，廣泛應用于涂層抗菌領域[29]。Qin 等[30]研究了納米銀顆粒對 USCs 細胞毒性以及成骨活性的影響，發現 4 μg/mL AgNP 濃度下開始觀察到濃度依賴性毒性；此外，還發現納米銀顆粒可以促進 USCs 成骨相關基因蛋白表達。該課題組認為納米銀顆粒可以作為獨立銀離子加入組織工程支架材料中，促進 USCs 成骨能力表達。還有研究采用 USCs 復合 β-TCP 植入小鼠股骨缺損模型中，一段時間后發現適量新骨形成[31]。目前對于 USCs 的骨組織修復雖然展現了一定修復效果，但其修復機制研究尚且不足，仍需進一步研究確認。
2.2 USCs 與軟骨修復
由創傷和骨關節炎引起的軟骨缺損一直是治療難點。目前軟骨缺損的治療主要依靠自體軟骨移植、微骨折、軟骨成形術等，但這些治療手段存在創傷大、軟骨修復效果不理想等不足[32]。許多研究發現 MSCs 可以定向分化為軟骨細胞，并表達相關特異性基因蛋白[33]。本課題組之前利用 USCs 和透明質酸鈉溶液構建了干細胞/透明質酸復合體系，并驗證了復合體系內 USCs 仍具備較好的生物學特性；體內實驗中發現，與單純應用透明質酸組相比，USCs 聯合透明質酸修復組有更多的新生軟骨，展現出了更好的軟骨缺損修復能力。此研究為細胞治療關節軟骨缺損提供了新的理論依據[34]。但目前有關 USCs 應用于關節軟骨缺損治療的研究仍較少，仍需更多的臨床研究證實 USCs 的軟骨修復能力。
2.3 USCs 與皮膚修復
許多研究發現 USCs 通過促進血管形成，進而加快皮膚組織的修復。Fu 等[35]利用 USCs 復合聚己內酯/明膠構建新型組織工程生物材料，并觀察其對兔全層皮膚缺損修復的療效發現，與單純聚己內酯/明膠相比，搭載了 USCs 組的傷口閉合速度更快，有更多血管和膠原生成。此外，該課題組還發現 USCs 可以釋放增強內皮細胞遷移、增殖和成血管能力的細胞因子（VEGF 和 TGF-β1）。在細胞治療過程中，干細胞對組織的修復再生能力主要通過旁分泌效應作用于受體細胞實現。而生物活性玻璃被證實可以增強干細胞的旁分泌作用，進而促進組織修復[36]。Zhang 等[37]研究發現，生物玻璃的離子產物可以促進 USCs 相關生長因子表達。通過生物玻璃粒子產物處理 USCs 獲得條件培養基，可以促進內皮細胞和成纖維細胞的增殖。該研究[37]體內實驗中發現經生物活性玻璃激活的 USCs，與未經處理過的 USCs 相比，有更多的血管生成以及膠原沉積，展現出更好的傷口修復能力。
外泌體是細胞分泌的的一類包含了 RNA 或細胞因子的小分子物質，被廣泛應用于疾病診斷與治療中[38]。Chen 等[39]成功分離獲取了 USCs 來源外泌體并進行相關生物學特性檢測。結果顯示，USCs 來源外泌體外觀呈杯狀或球形，直徑為（1.57±2.93）nm，陽性表達分子 CD63 和腫瘤易感基因 101 蛋白；USCs 來源外泌體富含傷口愈合相關蛋白，可以增強內皮細胞成血管能力、傷口愈合能力。該研究為 USCs 應用于糖尿病軟組織創傷修復提供了理論基礎。
2.4 USCs 與骨骼肌修復
許多研究已證實 USCs 經過誘導可以分化為骨骼肌細胞。Chen 等[40]發現 USCs 在進行肌源性誘導分化后，細胞形態由米粒樣向紡錘形改變；USCs 經過肌源性誘導分化后，體外穩定表達骨骼肌細胞譜系（skeletal muscle linage cells，Sk-MCs）轉錄物和蛋白質標記物（myf5、myoD、肌球蛋白和肌間線蛋白）；將標記過的 USCs 植入裸鼠脛骨肌 1 個月后，細胞在體內仍可穩定表達 CD117、CD133、CD146、SSEA-4 和 STRO-1，陰性表達 CD14、CD31、CD34 和 CD45。該研究表明 USCs 體內體外均可誘導分化為 SK-MCs。Kim 等[41]利用轉錄因子 MyoD 對 USCs 進行基因重編，經過誘導分化成功建立了人類肌源細胞。
2.5 USCs 與神經修復
研究證實 USCs 可以經過誘導分化為神經樣細胞，但目前將 USCs 應用于神經修復的研究仍較少。將 USCs 復合水凝膠植入小鼠動物模型中發現 USCs 可以遷移至顱內病灶部位，并表達與神經表型相關蛋白質[21]。Yang 等[42]通過海綿體注射色素上皮衍生因子基因修飾的 USCs 可以有效對海綿體神經進行修復，并且可以阻止海綿體結構的進一步破壞，改善海綿體內內皮細胞功能，增加平滑肌含量，減少細胞凋亡。
3 USCs 與骨骼肌肉系統疾病模型的構建
誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSs）是指將多能遺傳基因導入體細胞，在其他誘導因子的作用下進行基因的重新排列，進而獲取得到類似胚胎干細胞的具備多向分化潛能的細胞[43-44]。目前許多研究通過分離不同疾病患者尿液中的 USCs 進行基因重編，構建 iPSs 骨骼肌肉系統疾病的細胞模型，用于骨骼肌肉系統疾病的診斷、篩選有效藥物以及機制學研究。無創來源 USCs 構建的多能干細胞與胚胎干細胞高度相似，在罕見疾病細胞模型構建以及藥物篩選等方面具備廣闊的應用前景。
肌肉疾病涉及到的大量基因突變需要進行個體化的檢測與治療，因此構建肌肉系統疾病的細胞模型十分必要。成纖維細胞是目前廣泛應用于多能干細胞構建的一種細胞來源[45]，但成纖維細胞的獲取需要通過有創的皮膚活檢。Kim 等[41]將 MyoD 基因導入 USCs 并對其進行基因重編，成功構建出人類肌源性細胞疾病模型，并證實此構建過程高效可重復。Zhang 等[46]從患有常染色體顯性遺傳疾病陣發性運動興奮性運動障礙的患者尿液中分離獲取得到 USCs，構建疾病特異性人 iPSs 細胞模型，用于疾病細胞機制相關研究。Afzal 等[47]成功從肌營養不良患者的尿液中分離獲取 USCs，并利用仙臺病毒進行病毒轉導，成功構建出 iPSs 特異性疾病模型用于后續研究。Wang 等[48]利用 TGF-β 顯著提高了 USCs 進行基因重編構建 iPSs 的效率，該方法為 USCs 基因重編提供了一種簡化方式。M Lee 等[49]從唐氏綜合征患者尿液中分離獲取 USCs 并誘導生成 iPSs，彌補了先前產生的 T21-iPSs 的不足，并認為 USCs-iPSs 可以良好地應用于唐氏綜合征以及其他神經發育退行性疾病模型的構建。
4 USCs 的臨床應用
我們通過廣泛查閱臨床注冊研究信息，發現目前有關 USCs 的國家臨床注冊研究仍較少。王琛等分離獲取 20～79 歲正常糖耐量志愿者以及 2 型糖尿病患者的 USCs 后，用于糖尿病的治療及相關機制研究（臨床注冊號：ChiCTR1800016260）。王墨等從正常兒童清潔中段尿中分離獲取 USCs，通過體內體外實驗探討 PI3K/Akt/mTORC1 信號通路激活是否參與原發性腎病綜合征慢性化進展，以及 USCs 移植是否通過旁分泌、抗炎抗氧化損傷和調節 PI3K/Akt/mTORC1 信號通路活化狀態而保護腎臟（臨床注冊號：ChiCTR-ROC-17013715）。兩項研究均處于初級階段，尚未得出臨床隨訪結果。此外，目前尚無有關 USCs 直接應用于人體骨骼肌肉系統疾病修復的相關臨床研究報道。隨著研究者們對 USCs 相關生物學特性研究的深入，我們相信未來會有更多的 USCs 臨床研究報道出現。
5 小結與展望
許多基礎以及臨床研究結果表明，MSCs 對骨骼肌肉系統具備一定的再生修復能力，但其細胞類型、細胞劑量、治療頻率以及修復方式存在巨大差異[50-52]。不同組織來源的 MSCs 雖然均具備 MSCs 的特性，但是在細胞生物學特性以及組織修復能力方面仍存在一定差異。因此發現不同來源的 MSCs 為不同組織的修復再生提供了更多可能性。此外，如何提高干細胞體內存活率、豐富干細胞來源以及細胞相關倫理學問題，同樣是干細胞研究者亟待解決的問題。
目前組織工程與再生醫學的研究者們已經發現了多種不同來源的 MSCs，包括骨髓、脂肪、胎盤、臍帶、外周血以及尿液等組織[53-55]。USCs 作為近年來發現的一種無創來源的成體干細胞，表達 MSCs 表面分子標記，具備良好的細胞增殖能力，經過誘導可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、尿路上皮細胞、內皮細胞、心肌細胞以及平滑肌細胞。近年來 USCs 開始被廣泛應用于骨骼肌肉系統的修復重建中，并展現了一定的修復效果。但有關 USCs 的生物學特點以及組織修復的分子生物學機制尚需進一步研究確定。此外，許多研究者通過分離獲取不同罕見骨骼肌肉疾病患者尿液中的 USCs 進行基因重編構建 iPSs，應用于罕見疾病細胞模型構建以及特異性藥物篩選。總之，USCs 作為一種新發現的無創來源的干細胞，在骨骼肌肉系統修復領域有著廣闊的應用前景。