引用本文： 李菁, 陳盈, 滕偉, 王琴梅. 載基因脂多糖胺納米囊泡誘導BMSCs定向成骨分化. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(11): 1469-1476. doi: 10.7507/1002-1892.201804125 復制
近年來，隨著干細胞在疾病治療、多能性建立、細胞重編程、疾病動物模型的建立及其調控等研究領域取得的良好進展，基于干細胞的療法已成為研究熱點[1-3]。其中 BMSCs 因具有來源廣泛、取材簡便、有多向分化潛能與自我更新能力等優點，被認為是組織重塑和功能修復的理想細胞來源，是目前最有希望在臨床廣泛使用的干細胞[4-5]。目前 BMSCs 已被嘗試用于動物骨缺損修復，心血管疾病、神經系統疾病如缺血性腦血管病、帕金森綜合征及脊髓損傷等的治療。但 BMSCs 的臨床應用仍面臨很多挑戰，定向分化就是其中一個核心問題。
BMSCs 的定向分化可以通過基因轉染誘導來實現，這種誘導不僅依賴于基因，還依賴于載體本身。即載體并非惰性的運載工具，它們還通過自身理化性能影響細胞形貌、應力纖維形成、基因轉錄等來調控分化[6]。與病毒載體相比，聚合物基因載體在不引起插入誘變、基因裝載能力大、低免疫原性、大規模生產及靶向性等方面有顯著優勢[7-9]。因此，科學家們設計合成了各種聚合物作為基因載體，但這些研究絕大多數聚焦于提高轉染效率，而誘導干細胞定向分化的研究不多[10-11]。本課題組也設計制備了一種用于胞液遞送的水溶、可降解、低毒的兩親兩性共聚物脂多糖胺納米囊泡（lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes，LNPs），我們前期研究表明，當以其為載體遞送 BMP-2 基因轉染 BMSCs 時，可獲得高達 95% 的轉染效率[12-13]。基于此，本研究擬通過控制合成時反應 pH 值進一步對 LNPs 理化、生理性能進行優化，然后用其負載 BMP-2 基因，通過體外 BMSCs 細胞轉染實驗評價該體系誘導 BMSCs 成骨分化的能力，旨在為 BMSCs 的體外定向分化提供依據及切實可行的方案，促進其臨床轉化。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
支鏈型聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI；相對分子質量 1.8×103）、PEI 25K（相對分子質量 25×103）（Sigma 公司，美國）；茜素紅、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素 C（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Lipofectamine 2000（Lipo；Thermo Fisher Scientific，美國）；ALP 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因非融合表達的人源性 BMP-2 真核表達質粒 pBMP-2-GFP（產品編號：EX-A0241-M61；Gene-Copoeia 公司，美國）；BMP-2 ELISA 檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；氧化海藻酸鈉（oxidized alginate，OA；氧化程度 30%），由本實驗室自制[14]。Nano-ZS90 型粒徑分析儀（Malvern Instruments 公司，英國）；倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；流式細胞儀（Beckman Coulter 公司，美國）；酶標儀（Thermo 公司，美國）。
1.2 合成時不同 pH 對脂多糖胺（lipopolysaccharide-amine，LPSA）理化性能的影響
1.2.1 不同 pH 下 LPSA 共聚物的合成
按我們前期研究方法[12]稍加修改合成 LPSA：首先按文獻[12]方法合成膽固醇接枝的 PEI（cholesteryl-graft-PEI，PEI-Cho）；然后將 PEI-Cho 溶于超純水中，使用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH 溶液調節 pH 值分別為 7.5、8.0、8.5、9.0；攪拌下將 PEI-Cho 溶液慢慢滴加入 OA 水溶液中，室溫下反應 24 h，之后加入過量硼氫化鈉繼續反應 24 h；隨后將溶液透析凍干，室溫下密封干燥保存備用。取 1 mg 新鮮凍干的 LPSA 做元素分析，測定其氮（N）含量。
1.2.2 LNPs/pBMP-2-GFP 復合物的制備
參照文獻[12]方法，將不同 pH 下合成的 LPSA 溶于無菌超純水中配制成 1.85 mg/mL LNPs 溶液，置于 4℃ 冰箱備用。轉染前，根據實驗所需 N/磷（P）［LNPs 中 N 元素與質粒 DNA 中 P 元素的摩爾比，我們前期實驗結果顯示 N/P=60 時轉染效果最佳，因此如無特殊說明，本研究中 N/P 均為 60］，用超純水將 LNPs 溶液稀釋成所需濃度，再將其與等體積 pBMP-2-GFP（40 ng/μL）混合，渦旋 3～5 s，室溫靜置 30 min 后立即使用。
1.2.3 LNPs/pBMP-2-GFP 復合物粒徑及 zeta 電位測定
分別取 1 mg/mL 不同 pH 下合成的 LNPs 和 LNPs/pBMP-2-GFP 溶液，采用 Nano-ZS90 型粒徑分析儀測定粒徑和 zeta 電位。
1.3 體外實驗
1.3.1 大鼠 BMSCs 分離培養
參照文獻[7, 15]方法常規分離、純化、培養大鼠 BMSCs。選取第 2～4 代 BMSCs 行流式細胞檢測，發現其表面標記物 CD29、CD44 表達陽性，CD31、CD45 表達陰性，提示獲得細胞是 BMSCs。取第 2～4 代大鼠 BMSCs 進行以下實驗。
1.3.2 細胞毒性實驗
將 BMSCs 按 1×104個/孔密度接種于 96 孔板，常規培養至細胞融合度達 90% 時，模擬無血清轉染，即加入不同 pH 下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 復合物在無血清培養基（V復合物溶液:V培養基=10%）與細胞共孵育 4 h 后，更換新的完全培養基繼續培養 44 h；然后使用 Alamar Blue 法[12-13, 16]測定 LNPs/pBMP-2-GFP 對 BMSCs 的毒性。以無復合物干預的 BMSCs 存活率為 100% 對結果進行標準化，并根據國標 ISO10993 對細胞毒性進行分級。實驗重復 3 次，取均值。
1.3.3 不同 LNPs/pBMP-2-GFP 無血清轉染 BMSCs
按照文獻實驗方法進行無血清轉染[12-13, 17]。首先將 BMSCs 以 1×105個/孔密度接種于 24 孔板，常規培養至細胞融合度達 70%～80%，加入不同 pH 下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 復合物共孵育 4 h，換液。繼續常規培養，48 h 后取一部分細胞于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞狀態及轉染效果；另一部分細胞采用流式細胞儀檢測細胞熒光陽性率（即轉染效率）。根據細胞毒性和轉染效率實驗結果，選取毒性最小、轉染效率最高的 LNPs 進行下列 BMP-2 蛋白表達和成骨誘導實驗。
1.3.4 Western blot 和 ELISA 檢測 BMP-2 蛋白表達
以 LNPs/pBMP-2-GFP 為實驗組（A 組），Lipo/pBMP-2-GFP、PEI25K/pBMP-2-GFP 為陽性對照組（分別為 B、C 組），不加轉染試劑為空白對照組（D 組），按 1.3.3 方法對大鼠 BMSCs 進行無血清轉染。轉染 48 h 后提取細胞蛋白常規行 Western blot 檢測 A、D 兩組 BMP-2 蛋白表達；轉染后 1、2、3、4 d 收集細胞上清液行 ELISA 檢測各組 BMP-2 蛋白濃度[13]。
1.3.5 成骨誘導檢測
將 BMSCs 以 1×105個/孔密度接種于 24 孔板，常規培養至細胞融合度達 60% 時，將細胞分為 4 組：A1 組用 LNPs/pBMP-2-GFP 行常規無血清轉染，B1 組用 Lipo/pBMP-2-GFP 行常規無血清轉染，C1 組用成骨誘導培養基（含 10%FBS、1×10–8 mol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油酸磷鈉、50 mg/L 維生素 C 的 DMEM 培養基）進行誘導，D1 組為不加轉染試劑及成骨誘導液的空白對照組。每隔 1 d 換液 1 次，培養至 14 d 時收集細胞懸液，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 10 min 后取上清液進行 ALP 活性檢測。同時對一部分細胞行茜素紅染色，觀察鈣結節生成情況；另一部分 A1 組細胞繼續培養至 21 d，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，方差齊性數據組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；方差不齊數據比較采用秩和檢驗；檢驗水準取雙側 α=0.05。
2 結果
2.1 合成時不同 pH 對 LPSA 理化性能的影響
元素分析法測定顯示，當 pH 為 7.5、8.0、8.5、9.0 時，LPSA 的 N 含量分別為 13.69、11.84、10.87、12.21 mmol/g，LPSA 的 N 含量隨 pH 值增加呈先減后增的趨勢，當 pH=8.5 時，LPSA 的 N 含量最低。
粒徑和 zeta 電位分析顯示，各 pH 值下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 粒徑和 zeta 電位均小于 LNPs；pH 為 7.5 時合成的 LNPs 及 LNPs/pBMP-2-GFP 粒徑和 zeta 電位均最大，pH 為 8.5 時均最小。pH 為 7.5 時合成的 LNPs、LNPs/pBMP-2-GFP 粒徑顯著高于其余 3 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余 3 組間粒徑比較差異無統計學意義（P>0.05）。除 pH 為 8.5 時合成的 LNPs、LNPs/pBMP-2-GFP zeta 電位顯著低于 pH 7.5 和 8.0 組，差異有統計學意義（P<0.05）外，其余組間 zeta 電位比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
不同 pH 下合成的 LNPs 和 LNPs/pBMP-2-GFP 粒徑及 zeta 電位比較
a. 粒徑；b. zeta 電位
Figure1. Comparison of particle size and zeta potential of LNPs and LNPs/pBMP-2-GFP synthesized under different pHa. Particle size; b. Zeta potential
2.2 體外實驗
2.2.1 細胞毒性實驗
無血清條件下 BMSCs 與 pH 為 7.5、8.0、8.5、9.0 條件下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 共孵育 4 h 后，更換新的完全培養基繼續孵育 44 h，此時細胞存活率分別為 88.7%±1.60%、92.26%±2.86%、96.5%±1.4%、93.84%±2.42%，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.001）；細胞毒性均為 1 級，可用于體內實驗。其中當 pH 為 8.5 時得到的 LNPs/pBMP-2-GFP 細胞毒性最小。
2.2.2 細胞轉染實驗
無血清轉染 48 h 后，倒置熒光顯微鏡觀察示，所有 pH 值下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 均有較高的轉染效率，且細胞密度及形態均較好。見圖 2。流式細胞儀檢測示，pH 為 7.5、8.0、8.5、9.0 組的轉染效率分別為 95.37%±1.24%、96.55%±0.93%、98.8%±0.1%、90.59%±1.29%，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。其中當 pH 為 8.5 時合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染效果最佳。
圖2
不同 pH 下合成 LNPs 介導 pBMP-2-GFP 轉染大鼠 BMSCs 48 h 后觀察
左為明場，右為倒置熒光顯微鏡（×100）觀察 a. pH 7.5；b. pH 8.0；c. pH 8.5；d. pH 9.0
Figure2. Observation of LNPs synthesized under different pH mediated pBMP-2-GFP transfection in rat BMSCs after 48 hoursThe left was the bright field and the right was the inverted fluorescence microscope (×100) observation a. pH 7.5; b. pH 8.0; c. pH 8.5; d. pH 9.0
根據細胞毒性和轉染實驗結果，pH 為 8.5 下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 具有最小細胞毒性和最大轉染效率，因此選其進行下列 BMP-2 蛋白表達和成骨誘導實驗。
2.2.3 Western blot 和 ELISA 檢測 BMP-2 蛋白表達
Western blot 檢測示，A、D 組均可見綠色 β-actin 內參條帶；A 組可見紅色 BMP-2 條帶與內參條帶相重疊，在相對分子質量為 55×103處可見較多 BMP-2 紅色條帶顯影及部分雜帶顯示，表明 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染 BMSCs 后表達 BMP-2 陽性。見圖 3。
圖3
Western blot 檢測 A、D 組 BMP-2 蛋白表達
Mr：相對分子質量 M：Marker 1：D 組 2：A 組
Figure3. The expression of BMP-2 protein in groups A and D detected by Western blotMr: Relative molecular mass M: Marker 1: Group D 2: Group A
ELISA 檢測示轉染后第 2 天，各組 BMP-2 蛋白表達量達最大值，之后開始出現下降趨勢。各時間點 A 組 BMP-2 蛋白表達量均顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
ELISA 檢測各組 BMP-2 蛋白表達量
Figure4.
The expression of BMP-2 protein in each group detected by ELISA
2.3 成骨誘導檢測
2.3.1 ALP 活性檢測
培養后 14 d ，A1、B1、C1、D1 組 ALP 活性分別為（2.75±0.19）、（1.63±0.14）、（2.80±0.17）、（0.88±0.01）U/L，A1、B1、C1 組顯著高于 D1 組，A1、C1 組顯著高于 B1 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A1、C1 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.2 茜素紅染色觀察
培養后 14 d 茜素紅染色示，A1、C1 組可見明顯鈣結節，B1、D1 組未見明顯鈣結節且出現細胞凋亡，尤其是 D1 組細胞大面積脫離板底。見圖 5。
圖5
培養 14 d 各組茜素紅染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. A1 組；b. B1 組；c. C1 組；d. D1 組
Figure5. Alizarin red staining observation in each group after being cultured for 14 days (Inverted fluorescence microscope×100)a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1
2.3.3 細胞形態觀察
A1 組細胞培養至 21 d 時，倒置熒光顯微鏡下可見細胞體積增大，聚集成集落樣生長，且聚集處有凸起的透明塊狀結節，細胞質內出現顆粒樣物質，細胞結節中心的細胞逐漸融合失去細胞結構，具有成骨細胞形態特點[18]。見圖 6。
圖6
A1 組培養 21 d 時倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態
a. ×100；b. ×200
Figure6. Cell morphology of BMSCs at 21 days after transfection in group A1 observed under inverted fluorescence microscopea. ×100; b. ×2003 討論
隨著全球細胞生物技術和產業快速發展，“細胞治療及臨床轉化”成為我國健康保障發展的重大課題，干細胞因具有自我更新和多向分化潛能，成為細胞治療的核心。干細胞能為臨床組織移植、細胞治療、基因治療、藥物研發等提供大量細胞源，在醫學的眾多領域發揮著重要作用。目前人們研究較多的干細胞主要有胚胎干細胞、誘導性多能干細胞、BMSCs 等。其中 BMSCs 具有易獲得、增殖傳代能力強、有多向分化潛能，且連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，分化為成體細胞的途徑較短、不存在倫理問題和低免疫原性等特點，臨床應用前景廣闊。但基于 BMSCs 的新療法、新技術實現臨床轉化，必須解決許多基礎問題。干細胞的定向分化是生物體發育、生長和修復的基礎，因此明確 BMSCs 的定向分化機制，在體外建立切實可行的誘導分化條件，提高定向誘導分化效率，是急需解決的重要問題。
目前體外誘導 BMSCs 定向分化的方法主要有物理因素誘導、化學藥物誘導、誘導因子誘導、基因轉染誘導 4 種，它們各有優點和局限性，都處于亟待發展階段。比如，化學藥物在促進 BMSCs 成骨分化的同時可能對細胞產生其他不利影響，如地塞米松促進成骨分化但抑制細胞的分裂和增殖，使得干細胞數量難以得到滿足；誘導因子價格昂貴、易失活、用藥量高于生理劑量等[19-20]。而基因轉染誘導因能通過細胞持續實時合成天然蛋白發揮誘導作用，而獲得人們青睞。再加上基因治療領域在 2017 年獲得的里程碑式進展—2017 年美國食品藥品監督管理局（FDA）首次批準兩種針對血液疾病的基因治療，這標志著基因治療正式走向臨床。可以預測，未來干細胞的基因轉染誘導將引起更多關注和研究[21]。
基因轉染誘導成功的關鍵因素之一是高效低毒的基因載體。目前主要的基因載體有病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體轉染效率高，但其制備困難，目的基因容量小，靶向特異性差，且存在免疫原性和生物安全性問題；非病毒載體盡管轉染效率不及病毒載體，但因具有低毒、低免疫原性，目的基因裝載量大，易于大量制備等特點而被廣泛研究。常用的非病毒載體有質粒、聚陽離子聚合物、陽離子脂質體、納米粒子等。其中質粒作為最簡單的非病毒基因轉染系統，操作簡便且安全性高，但其細胞穿透能力弱，易被降解和清除，從而導致轉染效率低且基因表達短暫。而聚陽離子聚合物、陽離子脂質體、納米粒子等制備相對簡便，易于進行多功能的修飾，且有良好的生物相容性，能有效保護所攜帶的外源基因，利于基因的高效表達。因此，我們前期采用接枝共聚方法，制備了以 OA 為主鏈，PEI-Cho 為側鏈的刷狀共聚物 LPSA，LPSA 能在水中自組裝形成納米囊泡，當作為載體遞送多種基因轉染多種細胞時，均有較高轉染效率和較低細胞毒性[12-13]，顯示出巨大的臨床應用潛能。在此基礎上，本研究深入探討了陽離子載體 LPSA 合成條件的優化，期望能標準化 LPSA 的制備，同時獲得具更高轉染效率、更低細胞毒性的通用基因載體，從而能負載靶基因高效轉染大鼠 BMSCs，最終高效促進 BMSCs 定向分化。
LPSA 的合成分 3 步[12]，其中第 2 步最為關鍵，即 PEI-Cho 側鏈和 OA 主鏈之間的接枝反應。此反應為 Schiff 堿反應，通過 OA 上的醛基和 PEI-Cho 上的伯氨反應來實現，反應過程中的 pH 對 Schiff 堿的高效生成至關重要：pH 太低易使 PEI 上的伯胺質子化而失去親核特性，不利于進攻羰基 C，且質子化的 PEI 可能和帶負電的 OA 發生靜電中和反應而產生沉淀；太高則不易使 OA 上的羰基質子化。這些均不利于反應的進行，影響產物的理化性能，因此需要精確控制反應 pH。由于 PEI 上伯胺的酸度系數 pKa 約為 9，因此我們將反應 pH 設定在 7.5～9.0，研究反應 pH 變化對 LPSA 性能的影響。結果表明，合成時的 pH 的確會影響 LPSA 的理化、生理性能，在所研究的 pH 范圍內，pH 為 8.5 時合成的 LPSA 形成的納米囊泡細胞毒性最小，細胞存活率及轉染效率均最高，其含氮量、粒徑、zeta 電位在所研究的 LPSA 中均最小，分別為10.87 mmol/g、122.73 nm、42.0 mV，與 pBMP-2-GFP 通過靜電作用形成的復合物的粒徑和 zeta 電位分別為 100.01 nm、31.6 mV，說明 pBMP-2-GFP 和 LNPs 通過靜電作用結合后能壓縮粒子，并中和 LNPs 表面部分正電荷，更有利于 LNPs/pBMP-2-GFP 進入細胞且減少對細胞的毒性。
接下來，我們用 pH 為 8.5 時合成的 LPSA 作為載體遞送 pBMP-2-GFP 轉染大鼠 BMSCs，檢測細胞持續表達目標蛋白情況。我們選擇 BMP-2 作為模型基因的原因是，BMP-2 是 BMP 家族中的一個重要亞型，在體外和體內均對 BMSCs 具有很強的促成骨分化作用，能誘導未分化的 MSCs 不可逆地向成骨細胞定向分化與增殖，促進成骨細胞分化成熟，通過鈣鹽沉積參與骨形成與重建，具有高效的異位誘導成骨以及跨種屬誘導成骨作用[22-24]。我們的實驗結果表明，A 組 BMP-2 蛋白表達量遠遠高于其他對照組，差異有統計學意義。說明 LNPs 能成功介導 BMP-2-GFP 基因轉入大鼠 BMSCs 中，使其表達 BMP-2 目標蛋白，這為 LNPs/pBMP-2-GFP 修飾的 BMSCs 通過 BMP-2 信號通路促進其成骨定向分化提供了物質基礎。
隨后，我們通過細胞形態觀察、ALP 活性檢測、鈣鹽沉積、細胞形態觀察來評價 LNPs/pBMP-2-GFP 體系轉染大鼠 BMSCs 后促其成骨定向分化的能力，并與化學藥物（成骨誘導液）誘導方法對比。ALP 作為成骨細胞分化早期的標志性酶之一，是衡量 BMSCs 定向成骨分化和功能狀態的一個重要指標。動物組織中 ALP 的活性與鈣、磷的吸收及骨組織中的沉積等都有關。骨組織中含有大量 ALP，它們位于成骨細胞周圍及其表面，極易釋放進入血液中。因此當成骨細胞增殖、骨生長亢進時，會出現血清 ALP 活性上升。本研究結果顯示，經 LNPs/pBMP-2-GFP 誘導 14 d 后的 BMSCs，ALP 活性高于對照組，且與成骨誘導液處理組相當。
茜素紅對礦化結節的染色也是衡量細胞體內成骨能力的一個重要指標。本研究將經不同方式處理的 BMSCs 培養 14 d 時行茜素紅染色發現，D1 組未見鈣結節，B1 組鈣結節不明顯，而 A1 組及 C1 組可見明顯鈣結節，說明 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染 BMSCs 促進其成骨分化。另外，B1 組和 D1 組的 BMSCs 在 14 d 后出現凋亡，而 A1 組和 C1 組細胞則狀態良好，可正常培養。研究表明，未誘導分化的 BMSCs 具有生長快速和接觸抑制的生物學特性，其在普通培養基中 6～7 d 即可長滿單層，再繼續培養將導致其不斷增殖、細胞密度過大而造成凋亡；而成功成骨誘導分化的 BMSCs 則具有增殖較慢、細胞可復層生長的成骨細胞生物學特性[25-27]，這與我們的實驗結果一致。另外，經 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染誘導處理的 BMSCs 繼續培養至 21 d 時表現出成骨細胞的形態特點。這些都從不同側面說明 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染可促進 BMSCs 成骨分化。
綜上述，我們認為 pH 為 8.5 條件下合成的 LNPs 載體性能最佳，能夠高效負載 BMP-2-GFP 基因轉入大鼠 BMSCs 中，并成功誘導其成骨定向分化。需要指出的是，本研究僅通過目標蛋白表達、細胞形態、ALP 活性及鈣結節形成來評價 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染大鼠 BMSCs 促進其成骨分化的情況，并未對其誘導機制進行深入探討，未來應繼續進行相關機制方面的研究。
近年來，隨著干細胞在疾病治療、多能性建立、細胞重編程、疾病動物模型的建立及其調控等研究領域取得的良好進展，基于干細胞的療法已成為研究熱點[1-3]。其中 BMSCs 因具有來源廣泛、取材簡便、有多向分化潛能與自我更新能力等優點，被認為是組織重塑和功能修復的理想細胞來源，是目前最有希望在臨床廣泛使用的干細胞[4-5]。目前 BMSCs 已被嘗試用于動物骨缺損修復，心血管疾病、神經系統疾病如缺血性腦血管病、帕金森綜合征及脊髓損傷等的治療。但 BMSCs 的臨床應用仍面臨很多挑戰，定向分化就是其中一個核心問題。
BMSCs 的定向分化可以通過基因轉染誘導來實現，這種誘導不僅依賴于基因，還依賴于載體本身。即載體并非惰性的運載工具，它們還通過自身理化性能影響細胞形貌、應力纖維形成、基因轉錄等來調控分化[6]。與病毒載體相比，聚合物基因載體在不引起插入誘變、基因裝載能力大、低免疫原性、大規模生產及靶向性等方面有顯著優勢[7-9]。因此，科學家們設計合成了各種聚合物作為基因載體，但這些研究絕大多數聚焦于提高轉染效率，而誘導干細胞定向分化的研究不多[10-11]。本課題組也設計制備了一種用于胞液遞送的水溶、可降解、低毒的兩親兩性共聚物脂多糖胺納米囊泡（lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes，LNPs），我們前期研究表明，當以其為載體遞送 BMP-2 基因轉染 BMSCs 時，可獲得高達 95% 的轉染效率[12-13]。基于此，本研究擬通過控制合成時反應 pH 值進一步對 LNPs 理化、生理性能進行優化，然后用其負載 BMP-2 基因，通過體外 BMSCs 細胞轉染實驗評價該體系誘導 BMSCs 成骨分化的能力，旨在為 BMSCs 的體外定向分化提供依據及切實可行的方案，促進其臨床轉化。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
支鏈型聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI；相對分子質量 1.8×103）、PEI 25K（相對分子質量 25×103）（Sigma 公司，美國）；茜素紅、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素 C（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Lipofectamine 2000（Lipo；Thermo Fisher Scientific，美國）；ALP 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因非融合表達的人源性 BMP-2 真核表達質粒 pBMP-2-GFP（產品編號：EX-A0241-M61；Gene-Copoeia 公司，美國）；BMP-2 ELISA 檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；氧化海藻酸鈉（oxidized alginate，OA；氧化程度 30%），由本實驗室自制[14]。Nano-ZS90 型粒徑分析儀（Malvern Instruments 公司，英國）；倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；流式細胞儀（Beckman Coulter 公司，美國）；酶標儀（Thermo 公司，美國）。
1.2 合成時不同 pH 對脂多糖胺（lipopolysaccharide-amine，LPSA）理化性能的影響
1.2.1 不同 pH 下 LPSA 共聚物的合成
按我們前期研究方法[12]稍加修改合成 LPSA：首先按文獻[12]方法合成膽固醇接枝的 PEI（cholesteryl-graft-PEI，PEI-Cho）；然后將 PEI-Cho 溶于超純水中，使用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH 溶液調節 pH 值分別為 7.5、8.0、8.5、9.0；攪拌下將 PEI-Cho 溶液慢慢滴加入 OA 水溶液中，室溫下反應 24 h，之后加入過量硼氫化鈉繼續反應 24 h；隨后將溶液透析凍干，室溫下密封干燥保存備用。取 1 mg 新鮮凍干的 LPSA 做元素分析，測定其氮（N）含量。
1.2.2 LNPs/pBMP-2-GFP 復合物的制備
參照文獻[12]方法，將不同 pH 下合成的 LPSA 溶于無菌超純水中配制成 1.85 mg/mL LNPs 溶液，置于 4℃ 冰箱備用。轉染前，根據實驗所需 N/磷（P）［LNPs 中 N 元素與質粒 DNA 中 P 元素的摩爾比，我們前期實驗結果顯示 N/P=60 時轉染效果最佳，因此如無特殊說明，本研究中 N/P 均為 60］，用超純水將 LNPs 溶液稀釋成所需濃度，再將其與等體積 pBMP-2-GFP（40 ng/μL）混合，渦旋 3～5 s，室溫靜置 30 min 后立即使用。
1.2.3 LNPs/pBMP-2-GFP 復合物粒徑及 zeta 電位測定
分別取 1 mg/mL 不同 pH 下合成的 LNPs 和 LNPs/pBMP-2-GFP 溶液，采用 Nano-ZS90 型粒徑分析儀測定粒徑和 zeta 電位。
1.3 體外實驗
1.3.1 大鼠 BMSCs 分離培養
參照文獻[7, 15]方法常規分離、純化、培養大鼠 BMSCs。選取第 2～4 代 BMSCs 行流式細胞檢測，發現其表面標記物 CD29、CD44 表達陽性，CD31、CD45 表達陰性，提示獲得細胞是 BMSCs。取第 2～4 代大鼠 BMSCs 進行以下實驗。
1.3.2 細胞毒性實驗
將 BMSCs 按 1×104個/孔密度接種于 96 孔板，常規培養至細胞融合度達 90% 時，模擬無血清轉染，即加入不同 pH 下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 復合物在無血清培養基（V復合物溶液:V培養基=10%）與細胞共孵育 4 h 后，更換新的完全培養基繼續培養 44 h；然后使用 Alamar Blue 法[12-13, 16]測定 LNPs/pBMP-2-GFP 對 BMSCs 的毒性。以無復合物干預的 BMSCs 存活率為 100% 對結果進行標準化，并根據國標 ISO10993 對細胞毒性進行分級。實驗重復 3 次，取均值。
1.3.3 不同 LNPs/pBMP-2-GFP 無血清轉染 BMSCs
按照文獻實驗方法進行無血清轉染[12-13, 17]。首先將 BMSCs 以 1×105個/孔密度接種于 24 孔板，常規培養至細胞融合度達 70%～80%，加入不同 pH 下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 復合物共孵育 4 h，換液。繼續常規培養，48 h 后取一部分細胞于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞狀態及轉染效果；另一部分細胞采用流式細胞儀檢測細胞熒光陽性率（即轉染效率）。根據細胞毒性和轉染效率實驗結果，選取毒性最小、轉染效率最高的 LNPs 進行下列 BMP-2 蛋白表達和成骨誘導實驗。
1.3.4 Western blot 和 ELISA 檢測 BMP-2 蛋白表達
以 LNPs/pBMP-2-GFP 為實驗組（A 組），Lipo/pBMP-2-GFP、PEI25K/pBMP-2-GFP 為陽性對照組（分別為 B、C 組），不加轉染試劑為空白對照組（D 組），按 1.3.3 方法對大鼠 BMSCs 進行無血清轉染。轉染 48 h 后提取細胞蛋白常規行 Western blot 檢測 A、D 兩組 BMP-2 蛋白表達；轉染后 1、2、3、4 d 收集細胞上清液行 ELISA 檢測各組 BMP-2 蛋白濃度[13]。
1.3.5 成骨誘導檢測
將 BMSCs 以 1×105個/孔密度接種于 24 孔板，常規培養至細胞融合度達 60% 時，將細胞分為 4 組：A1 組用 LNPs/pBMP-2-GFP 行常規無血清轉染，B1 組用 Lipo/pBMP-2-GFP 行常規無血清轉染，C1 組用成骨誘導培養基（含 10%FBS、1×10–8 mol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油酸磷鈉、50 mg/L 維生素 C 的 DMEM 培養基）進行誘導，D1 組為不加轉染試劑及成骨誘導液的空白對照組。每隔 1 d 換液 1 次，培養至 14 d 時收集細胞懸液，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 10 min 后取上清液進行 ALP 活性檢測。同時對一部分細胞行茜素紅染色，觀察鈣結節生成情況；另一部分 A1 組細胞繼續培養至 21 d，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，方差齊性數據組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；方差不齊數據比較采用秩和檢驗；檢驗水準取雙側 α=0.05。
2 結果
2.1 合成時不同 pH 對 LPSA 理化性能的影響
元素分析法測定顯示，當 pH 為 7.5、8.0、8.5、9.0 時，LPSA 的 N 含量分別為 13.69、11.84、10.87、12.21 mmol/g，LPSA 的 N 含量隨 pH 值增加呈先減后增的趨勢，當 pH=8.5 時，LPSA 的 N 含量最低。
粒徑和 zeta 電位分析顯示，各 pH 值下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 粒徑和 zeta 電位均小于 LNPs；pH 為 7.5 時合成的 LNPs 及 LNPs/pBMP-2-GFP 粒徑和 zeta 電位均最大，pH 為 8.5 時均最小。pH 為 7.5 時合成的 LNPs、LNPs/pBMP-2-GFP 粒徑顯著高于其余 3 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；其余 3 組間粒徑比較差異無統計學意義（P>0.05）。除 pH 為 8.5 時合成的 LNPs、LNPs/pBMP-2-GFP zeta 電位顯著低于 pH 7.5 和 8.0 組，差異有統計學意義（P<0.05）外，其余組間 zeta 電位比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
不同 pH 下合成的 LNPs 和 LNPs/pBMP-2-GFP 粒徑及 zeta 電位比較
a. 粒徑；b. zeta 電位
Figure1. Comparison of particle size and zeta potential of LNPs and LNPs/pBMP-2-GFP synthesized under different pHa. Particle size; b. Zeta potential
2.2 體外實驗
2.2.1 細胞毒性實驗
無血清條件下 BMSCs 與 pH 為 7.5、8.0、8.5、9.0 條件下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 共孵育 4 h 后，更換新的完全培養基繼續孵育 44 h，此時細胞存活率分別為 88.7%±1.60%、92.26%±2.86%、96.5%±1.4%、93.84%±2.42%，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.001）；細胞毒性均為 1 級，可用于體內實驗。其中當 pH 為 8.5 時得到的 LNPs/pBMP-2-GFP 細胞毒性最小。
2.2.2 細胞轉染實驗
無血清轉染 48 h 后，倒置熒光顯微鏡觀察示，所有 pH 值下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 均有較高的轉染效率，且細胞密度及形態均較好。見圖 2。流式細胞儀檢測示，pH 為 7.5、8.0、8.5、9.0 組的轉染效率分別為 95.37%±1.24%、96.55%±0.93%、98.8%±0.1%、90.59%±1.29%，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。其中當 pH 為 8.5 時合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染效果最佳。
圖2
不同 pH 下合成 LNPs 介導 pBMP-2-GFP 轉染大鼠 BMSCs 48 h 后觀察
左為明場，右為倒置熒光顯微鏡（×100）觀察 a. pH 7.5；b. pH 8.0；c. pH 8.5；d. pH 9.0
Figure2. Observation of LNPs synthesized under different pH mediated pBMP-2-GFP transfection in rat BMSCs after 48 hoursThe left was the bright field and the right was the inverted fluorescence microscope (×100) observation a. pH 7.5; b. pH 8.0; c. pH 8.5; d. pH 9.0
根據細胞毒性和轉染實驗結果，pH 為 8.5 下合成的 LNPs/pBMP-2-GFP 具有最小細胞毒性和最大轉染效率，因此選其進行下列 BMP-2 蛋白表達和成骨誘導實驗。
2.2.3 Western blot 和 ELISA 檢測 BMP-2 蛋白表達
Western blot 檢測示，A、D 組均可見綠色 β-actin 內參條帶；A 組可見紅色 BMP-2 條帶與內參條帶相重疊，在相對分子質量為 55×103處可見較多 BMP-2 紅色條帶顯影及部分雜帶顯示，表明 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染 BMSCs 后表達 BMP-2 陽性。見圖 3。
圖3
Western blot 檢測 A、D 組 BMP-2 蛋白表達
Mr：相對分子質量 M：Marker 1：D 組 2：A 組
Figure3. The expression of BMP-2 protein in groups A and D detected by Western blotMr: Relative molecular mass M: Marker 1: Group D 2: Group A
ELISA 檢測示轉染后第 2 天，各組 BMP-2 蛋白表達量達最大值，之后開始出現下降趨勢。各時間點 A 組 BMP-2 蛋白表達量均顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
ELISA 檢測各組 BMP-2 蛋白表達量
Figure4.
The expression of BMP-2 protein in each group detected by ELISA
2.3 成骨誘導檢測
2.3.1 ALP 活性檢測
培養后 14 d ，A1、B1、C1、D1 組 ALP 活性分別為（2.75±0.19）、（1.63±0.14）、（2.80±0.17）、（0.88±0.01）U/L，A1、B1、C1 組顯著高于 D1 組，A1、C1 組顯著高于 B1 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A1、C1 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.2 茜素紅染色觀察
培養后 14 d 茜素紅染色示，A1、C1 組可見明顯鈣結節，B1、D1 組未見明顯鈣結節且出現細胞凋亡，尤其是 D1 組細胞大面積脫離板底。見圖 5。
圖5
培養 14 d 各組茜素紅染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. A1 組；b. B1 組；c. C1 組；d. D1 組
Figure5. Alizarin red staining observation in each group after being cultured for 14 days (Inverted fluorescence microscope×100)a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1
2.3.3 細胞形態觀察
A1 組細胞培養至 21 d 時，倒置熒光顯微鏡下可見細胞體積增大，聚集成集落樣生長，且聚集處有凸起的透明塊狀結節，細胞質內出現顆粒樣物質，細胞結節中心的細胞逐漸融合失去細胞結構，具有成骨細胞形態特點[18]。見圖 6。
圖6
A1 組培養 21 d 時倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態
a. ×100；b. ×200
Figure6. Cell morphology of BMSCs at 21 days after transfection in group A1 observed under inverted fluorescence microscopea. ×100; b. ×2003 討論
隨著全球細胞生物技術和產業快速發展，“細胞治療及臨床轉化”成為我國健康保障發展的重大課題，干細胞因具有自我更新和多向分化潛能，成為細胞治療的核心。干細胞能為臨床組織移植、細胞治療、基因治療、藥物研發等提供大量細胞源，在醫學的眾多領域發揮著重要作用。目前人們研究較多的干細胞主要有胚胎干細胞、誘導性多能干細胞、BMSCs 等。其中 BMSCs 具有易獲得、增殖傳代能力強、有多向分化潛能，且連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，分化為成體細胞的途徑較短、不存在倫理問題和低免疫原性等特點，臨床應用前景廣闊。但基于 BMSCs 的新療法、新技術實現臨床轉化，必須解決許多基礎問題。干細胞的定向分化是生物體發育、生長和修復的基礎，因此明確 BMSCs 的定向分化機制，在體外建立切實可行的誘導分化條件，提高定向誘導分化效率，是急需解決的重要問題。
目前體外誘導 BMSCs 定向分化的方法主要有物理因素誘導、化學藥物誘導、誘導因子誘導、基因轉染誘導 4 種，它們各有優點和局限性，都處于亟待發展階段。比如，化學藥物在促進 BMSCs 成骨分化的同時可能對細胞產生其他不利影響，如地塞米松促進成骨分化但抑制細胞的分裂和增殖，使得干細胞數量難以得到滿足；誘導因子價格昂貴、易失活、用藥量高于生理劑量等[19-20]。而基因轉染誘導因能通過細胞持續實時合成天然蛋白發揮誘導作用，而獲得人們青睞。再加上基因治療領域在 2017 年獲得的里程碑式進展—2017 年美國食品藥品監督管理局（FDA）首次批準兩種針對血液疾病的基因治療，這標志著基因治療正式走向臨床。可以預測，未來干細胞的基因轉染誘導將引起更多關注和研究[21]。
基因轉染誘導成功的關鍵因素之一是高效低毒的基因載體。目前主要的基因載體有病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體轉染效率高，但其制備困難，目的基因容量小，靶向特異性差，且存在免疫原性和生物安全性問題；非病毒載體盡管轉染效率不及病毒載體，但因具有低毒、低免疫原性，目的基因裝載量大，易于大量制備等特點而被廣泛研究。常用的非病毒載體有質粒、聚陽離子聚合物、陽離子脂質體、納米粒子等。其中質粒作為最簡單的非病毒基因轉染系統，操作簡便且安全性高，但其細胞穿透能力弱，易被降解和清除，從而導致轉染效率低且基因表達短暫。而聚陽離子聚合物、陽離子脂質體、納米粒子等制備相對簡便，易于進行多功能的修飾，且有良好的生物相容性，能有效保護所攜帶的外源基因，利于基因的高效表達。因此，我們前期采用接枝共聚方法，制備了以 OA 為主鏈，PEI-Cho 為側鏈的刷狀共聚物 LPSA，LPSA 能在水中自組裝形成納米囊泡，當作為載體遞送多種基因轉染多種細胞時，均有較高轉染效率和較低細胞毒性[12-13]，顯示出巨大的臨床應用潛能。在此基礎上，本研究深入探討了陽離子載體 LPSA 合成條件的優化，期望能標準化 LPSA 的制備，同時獲得具更高轉染效率、更低細胞毒性的通用基因載體，從而能負載靶基因高效轉染大鼠 BMSCs，最終高效促進 BMSCs 定向分化。
LPSA 的合成分 3 步[12]，其中第 2 步最為關鍵，即 PEI-Cho 側鏈和 OA 主鏈之間的接枝反應。此反應為 Schiff 堿反應，通過 OA 上的醛基和 PEI-Cho 上的伯氨反應來實現，反應過程中的 pH 對 Schiff 堿的高效生成至關重要：pH 太低易使 PEI 上的伯胺質子化而失去親核特性，不利于進攻羰基 C，且質子化的 PEI 可能和帶負電的 OA 發生靜電中和反應而產生沉淀；太高則不易使 OA 上的羰基質子化。這些均不利于反應的進行，影響產物的理化性能，因此需要精確控制反應 pH。由于 PEI 上伯胺的酸度系數 pKa 約為 9，因此我們將反應 pH 設定在 7.5～9.0，研究反應 pH 變化對 LPSA 性能的影響。結果表明，合成時的 pH 的確會影響 LPSA 的理化、生理性能，在所研究的 pH 范圍內，pH 為 8.5 時合成的 LPSA 形成的納米囊泡細胞毒性最小，細胞存活率及轉染效率均最高，其含氮量、粒徑、zeta 電位在所研究的 LPSA 中均最小，分別為10.87 mmol/g、122.73 nm、42.0 mV，與 pBMP-2-GFP 通過靜電作用形成的復合物的粒徑和 zeta 電位分別為 100.01 nm、31.6 mV，說明 pBMP-2-GFP 和 LNPs 通過靜電作用結合后能壓縮粒子，并中和 LNPs 表面部分正電荷，更有利于 LNPs/pBMP-2-GFP 進入細胞且減少對細胞的毒性。
接下來，我們用 pH 為 8.5 時合成的 LPSA 作為載體遞送 pBMP-2-GFP 轉染大鼠 BMSCs，檢測細胞持續表達目標蛋白情況。我們選擇 BMP-2 作為模型基因的原因是，BMP-2 是 BMP 家族中的一個重要亞型，在體外和體內均對 BMSCs 具有很強的促成骨分化作用，能誘導未分化的 MSCs 不可逆地向成骨細胞定向分化與增殖，促進成骨細胞分化成熟，通過鈣鹽沉積參與骨形成與重建，具有高效的異位誘導成骨以及跨種屬誘導成骨作用[22-24]。我們的實驗結果表明，A 組 BMP-2 蛋白表達量遠遠高于其他對照組，差異有統計學意義。說明 LNPs 能成功介導 BMP-2-GFP 基因轉入大鼠 BMSCs 中，使其表達 BMP-2 目標蛋白，這為 LNPs/pBMP-2-GFP 修飾的 BMSCs 通過 BMP-2 信號通路促進其成骨定向分化提供了物質基礎。
隨后，我們通過細胞形態觀察、ALP 活性檢測、鈣鹽沉積、細胞形態觀察來評價 LNPs/pBMP-2-GFP 體系轉染大鼠 BMSCs 后促其成骨定向分化的能力，并與化學藥物（成骨誘導液）誘導方法對比。ALP 作為成骨細胞分化早期的標志性酶之一，是衡量 BMSCs 定向成骨分化和功能狀態的一個重要指標。動物組織中 ALP 的活性與鈣、磷的吸收及骨組織中的沉積等都有關。骨組織中含有大量 ALP，它們位于成骨細胞周圍及其表面，極易釋放進入血液中。因此當成骨細胞增殖、骨生長亢進時，會出現血清 ALP 活性上升。本研究結果顯示，經 LNPs/pBMP-2-GFP 誘導 14 d 后的 BMSCs，ALP 活性高于對照組，且與成骨誘導液處理組相當。
茜素紅對礦化結節的染色也是衡量細胞體內成骨能力的一個重要指標。本研究將經不同方式處理的 BMSCs 培養 14 d 時行茜素紅染色發現，D1 組未見鈣結節，B1 組鈣結節不明顯，而 A1 組及 C1 組可見明顯鈣結節，說明 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染 BMSCs 促進其成骨分化。另外，B1 組和 D1 組的 BMSCs 在 14 d 后出現凋亡，而 A1 組和 C1 組細胞則狀態良好，可正常培養。研究表明，未誘導分化的 BMSCs 具有生長快速和接觸抑制的生物學特性，其在普通培養基中 6～7 d 即可長滿單層，再繼續培養將導致其不斷增殖、細胞密度過大而造成凋亡；而成功成骨誘導分化的 BMSCs 則具有增殖較慢、細胞可復層生長的成骨細胞生物學特性[25-27]，這與我們的實驗結果一致。另外，經 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染誘導處理的 BMSCs 繼續培養至 21 d 時表現出成骨細胞的形態特點。這些都從不同側面說明 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染可促進 BMSCs 成骨分化。
綜上述，我們認為 pH 為 8.5 條件下合成的 LNPs 載體性能最佳，能夠高效負載 BMP-2-GFP 基因轉入大鼠 BMSCs 中，并成功誘導其成骨定向分化。需要指出的是，本研究僅通過目標蛋白表達、細胞形態、ALP 活性及鈣結節形成來評價 LNPs/pBMP-2-GFP 轉染大鼠 BMSCs 促進其成骨分化的情況，并未對其誘導機制進行深入探討，未來應繼續進行相關機制方面的研究。
