引用本文： 張東力, 劉文, 吳向東, 何小強, 林梟, 黃偉. 新型納米羥基磷灰石/聚氨酯復合材料治療慢性骨髓炎的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(7): 880-886. doi: 10.7507/1002-1892.201802049 復制
慢性骨髓炎是創傷和矯形外科手術中常見的、潛在的災難性并發癥[1-4]，金黃色葡萄球菌是最常見的致病菌[5-6]。左氧氟沙星（levofloxacin，Lev）已被證明可應用于治療慢性骨髓炎，并具有對葡萄球菌抗菌活性強、骨滲透性強、低毒性等優點[7-9]。載 Lev 介孔二氧化硅納米微球（Lev@mesoporous silica microspheres，Lev@MSNs）/納米羥基磷灰石（nano hydroxyapatite，n-HA）/聚氨酯（polyurethane，PU）（Lev@MSNs/n-HA/PU）是本課題組新合成的復合材料，我們的前期研究已揭示了該材料具有抗感染以及促進新生骨形成的能力[10]。本研究將進一步探討其代替骨水泥治療慢性骨髓炎的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
SPF 級成年雌性新西蘭兔 50 只，體質量（2.2±0.1）kg，由重慶醫科大學動物實驗中心提供。
金黃色葡萄球菌的標準菌株（ATCC 25923）由重慶醫科大學附屬第一醫院感染科提供，于 37℃ 營養肉湯管中培養細菌，24 h 后將細菌轉移至無菌 PBS 液中，濃度稀釋至 3×107 CFU/mL[10]。Lev（國家食品藥品檢驗所）；Palacos R+G 骨水泥粉末（Heraeus 公司，德國）。掃描電鏡（日立公司，日本）；EXAKT 300 CP 鉆石切割系統（EXAKT 公司，德國）；SANS CMT5105 萬能力學試驗機［深圳美特斯工業系統（中國）有限公司］。
1.2 材料制備及表面結構觀察
MSNs 及 n-HA 采用本課題組前期研究報道方法制備[11-13]，通過原位聚合法和同步發泡法生成 Lev@MSNs/n-HA/PU 支架[14]，并通過前期研究步驟[10]分別制備出 10 mm×6 mm×6 mm 大小的載 1 mg 和 5 mg Lev 的復合物（1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU）。另外，將 5 mg Lev 與 Palacos R+G 骨水泥粉末混合，加入 0.95 mL 聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）液體，快速混勻后填入模具中制備出 10 mm×6 mm×6 mm 大小的 Lev@PMMA。所有材料均使用 15 kGy 60Co 輻照滅菌。
取 5 mg Lev@PMMA 和 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU，用金膜包裹材料，使用掃描電鏡觀察其表面結構。
1.3 實驗分組及方法
取 50 只新西蘭兔，采用 Norden[15]的方法用 3×107 CFU/mL 濃度的金黃色葡萄球菌菌液制備右側脛骨慢性骨髓炎模型，4 周后行 X 線片檢查，其中 2 只實驗動物未觀察到明顯感染征象；其余動物造模后 4 周體溫顯著升高（P<0.05），符合慢性骨感染征象，且 X 線片上觀察到骨髓炎征象，如骨質破壞、軟組織腫脹、骨膜反應及骨硬化癥等表現，處死其中 3 只行脛骨細菌培養，結果均為陽性，提示造模成功。將造模成功的 45 只動物隨機分為 4 組，于右脛骨皮質開窗，空白對照組（A 組，n=9）僅行徹底清創術；B、C、D 組（n=12）徹底清創后分別植入材料 5 mg Lev@PMMA、1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU。術中嚴格遵守無菌原則。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況觀察
術前及術后每日監測實驗動物的體溫、體質量等指標。
1.4.2 X 線片觀察
術后 12 周取各組實驗動物，行右脛骨 X 線片檢查，觀察骨愈合情況。
1.4.3 大體觀察
X 線片觀察后過量麻醉處死各組動物，逐層分離后肢皮膚和軟組織，顯露右脛骨，行大體形態觀察脛骨骨質破壞及植入物周圍新生骨的情況。
1.4.4 組織學觀察
術后 12 周處死動物后每組隨機取 3 個右側脛骨樣本，4% 多聚甲醛固定，沖洗標本，梯度乙醇逐級脫水，包埋液浸泡。采用 EXAKT 300 CP 鉆石切割系統切片，片厚 30 μm，行亞甲基藍/酸性品紅染色，光鏡下觀察。
1.4.5 植入物-骨界面掃描電鏡觀察
B、C、D 組各隨機選取 3 個右側脛骨標本，小心清理移植體表面軟組織，掃描電鏡觀察植入材料-骨組織界面新生骨生長情況。
1.4.6 生物力學試驗
每組取 6 只實驗動物的右側脛骨，修剪半月板及軟組織后固定骨標本，使用 SANS CMT5105 萬能力學試驗機進行壓縮試驗，活塞完全覆蓋關節面并向下以 2 mm/min 施加垂直壓縮力直至骨折發生，由儀器自動記錄最大壓縮力。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較以及組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 材料表面結構觀察
掃描電鏡觀察示，5 mg Lev@PMMA 材料表面粗糙，呈不規則顆粒狀；5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 材料可觀察到典型的 n-HA 疏松多孔特征，材料孔隙大小范圍為 200～500 μm，適合骨組織再生。見圖 1。
2.2 一般情況觀察
A 組動物體質量持續下降至術后 12 周；B 組術后體質量雖增加，但術后 12 周較術前及 A 組各時間點差異無統計學意義（P>0.05）；C 組術后各時間點體質量差異均無統計學意義（P>0.05），與 A 組比較各時間點差異亦無統計學意義（P>0.05）；D 組術后 3 周體質量明顯增加，術后 12 周較術前顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05），且與 A、C 組術后 12 周比較差異有統計學意義（P<0.05），與 B 組術后 12 周比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2a。
A 組治療后體溫繼續上升，于術后 6 周達峰值，12 周時略下降；B 組體溫維持術前水平至術后 12 周略下降，但與術前比較差異無統計學意義（P>0.05）；C 組手術前后各時間點體溫比較差異均無統計學意義（P>0.05）；而 D 組體溫持續下降，術后 12 周較術前體溫顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），且與 A 組術后 12 周比較差異有統計學意義（P<0.05），與 B、C 組術后 12 周比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2b。
2.3 X 線片觀察
術后 12 周，A 組可見廣泛骨質破壞及明顯的骨膜反應，炎癥感染較術前更嚴重，波及脛骨中下段；B 組可見炎癥得到較好控制，無骨質破壞或軟組織腫脹，但 PMMA 材料占位效應明顯；C 組發現輕微骨膜反應及軟組織腫脹，提示感染未獲得良好控制；D 組可觀察到材料降解、體積減小，新骨生長覆蓋缺損部位，骨愈合表現良好。見圖 3。
2.4 大體觀察
A 組發現大面積骨缺損及廣泛的骨質破壞，脛骨近端已完全被炎癥感染破壞；B 組無明顯骨質破壞等感染表現，脛骨近端保持正常形態，但材料-骨間隙明顯，材料結構完整，無新生骨長入；C 組也見材料-骨間隙存在，可見髓腔增大，無明顯新生骨圍繞材料生長；D 組發現骨缺損修復良好，材料已出現明顯降解，骨組織與其緊密結合，大量新生骨包繞材料周圍及覆蓋材料表面。見圖 4。
2.5 組織學觀察
A 組未見明顯新生骨形成且觀察到死腔；B 組見植入物與骨組織存在間隙，間隙周圍骨壁僅有少量新生骨，未沿植入物表面爬行，界面骨改建不活躍；C 組植入物與部分骨組織間可觀察到間隙，新生骨小梁稀疏，少量新骨與舊骨間界面明顯，新生骨向植入物表面爬行緩慢；D 組見植入物周圍有大量成骨細胞，可見類骨質，界面骨吸收、骨形成活躍，新生骨圍繞材料表面及穿過材料的孔隙生長，外周骨修復區已改建形成成熟板狀骨，新生骨小梁排列整齊，結構增粗，較致密且連續。見圖 5。
2.6 植入物-骨界面掃描電鏡觀察
B 組無新生骨向材料表面生長，可見材料凸出，其界面粗糙，且與骨組織間有明顯界限；C 組可見材料-骨組織界面有纖維組織形成，未見新生骨形成，有明顯的腔隙存在；而 D 組見材料界面平坦，其與骨組織的界限已變得模糊，之間形成明顯的骨性連接，材料表面也觀察到有新生骨長入。見圖 6。
2.7 生物力學試驗
術后 12 周 A、B、C、D 組最大壓縮力分別為（281±98）、（450±120）、（355±71）、（503±101）N，B、D 組最大壓縮力顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、D 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖1
材料表面結構掃描電鏡觀察
a. 5 mg Lev@PMMA（×50）；b. 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU（×25）
Figure1. Scanning electron microscope observation of the surface structure of the materialsa. 5 mg Lev@PMMA (×50); b. 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU (×25)
圖2
各組動物手術前后體質量和體溫比較
a. 體質量；b. 體溫
Figure2. Comparison of the body weight and body temperature in each group before and after operationa. Body weight; b. Body temperature
圖3
術前及術后 12 周各組 X 線片觀察
a. 術前；b. 術后 A 組；c. 術后 B 組；d. 術后 C 組；e. 術后 D 組
Figure3. X-ray films observation of each group before and at 12 weeks after operationa. Preoperative; b. Group A at postoperation; c. Group B at postoperation; d. Group C at postoperation; e. Group D at postoperation
圖4
術后 12 周各組標本大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4. Gross observation of the specimen of each group at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖5
術后 12 周各組亞甲基藍/酸性品紅染色觀察（×200）
黑箭頭示植入物，黃箭頭示新生骨 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Methylene blue/acid fuchsin staining observation of each group at 12 weeks after operation (×200)The black arrow indicated biomaterials, yellow arrow indicated new bone a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖6
術后 12 周植入物-骨界面掃描電鏡觀察
紅箭頭示植入物，黑箭頭示植入物-骨組織界面，綠箭頭示纖維組織，藍箭頭示新生骨a. B 組（×100）；b. C 組（×25）；c. D 組（×25）；d. D 組（×700）
Figure6. Scanning electron microscope observation of the bone-implant interface at 12 weeks after operationThe red arrow indicated biomaterials, black arrow indicated the interface between biomaterial and bone, green arrow indicated fibrous tissue, blue arrow indicated new bone a. Group B (×100); b. Group C (×25); c. Group D (×25); d. Group D (×700)
3 討論
研究報道開放性骨折 3 個月內出現嚴重感染的發生率高達 27%[16]，而開放性骨折發生后其深部感染率為 2%～50%[17]。脛骨是人體發生開放性骨折和骨感染最常見的部位[18]。廣泛切除感染骨組織可有效降低慢性骨髓炎復發的風險，但徹底清創常導致節段性骨缺損[19]。Lev 為廣譜抗生素，已被多數專家推薦用于治療骨感染[20]，且其相對分子質量小，易被 MSNs 裝載[21]。有研究報道 n-HA/PU 對成骨細胞 MG63 具有良好的骨誘導性能[22]。本課題組前期研究將 n-HA/PU 與 Lev@MSNs 復合，發現其植入體內后可使炎性細胞減少，新骨量及新生膠原纖維增加。本研究擬進一步揭示該新型復合材料治療慢性骨感染的骨修復能力，并評估其后期生物力學性能。
研究者發現骨水泥中抗生素可釋放量較低，且植入體內后藥物釋放不穩定[23-25]。據報道，骨水泥珠在植入人體內 5 年后，PMMA 將成為體內的異物，由釋放抗生素的載體轉變為培養耐藥菌的溫床[26]。而本研究的新型復合材料可在植入后 12 周內逐漸降解，在長期治療中無需二次手術取出，且其降解速度合適，降解過程中不斷有新生骨生長替代。
本研究中，A 組治療后體質量持續下降而體溫繼續上升，而 D 組植入材料 12 周后體質量明顯增加，體溫明顯下降，較治療前有顯著差異，說明其感染控制良好。X 線片及大體觀察也顯示 D 組脛骨炎癥破壞終止，可為新生骨生長提供有利環境，從而加快骨修復進程，與前期研究一致[10]，可能與 Lev@MSNs/n-HA/PU 抗生素緩釋效應延長藥物有效濃度時間有關。而掃描電鏡觀察顯示，與 D 組相比，C 組材料-骨界面形成纖維連接及有明顯間隙，結合前期研究分析原因，可能由于其植入物附近脛骨中 Lev 濃度較低，抑菌性不足，未有效控制骨感染而影響新生骨生長。
掃描電鏡及組織學觀察示，B 組中未見明顯新生骨形成，是由于 PMMA 不具有微孔結構和骨傳導作用，新生骨無法長入材料形成生物固定。而 D 組在感染控制的基礎上表現出良好的骨傳導性能，見其骨修復區改建為成熟板狀骨，新生骨小梁排列整齊，新生骨組織向植入物表面延伸生長較快。Mastrogiacomo 等[27]研究將一種羥基磷灰石支架承載 BMSCs 后植入免疫缺陷小鼠體內，其聯通孔直徑大多數超過 200 μm，較聯通孔直徑大多數<100 μm 的支架誘導新生骨生長作用更強。本研究中，D 組新型材料孔隙大小范圍為 200～500 μm，見其孔隙內有明顯的新生骨形成，也表明其孔隙結構適合新生骨生長。
根據 Li 等[28]報道，評價骨皮質承載能力的最佳方法是縱向壓縮試驗，本研究選用此方法評估材料的生物力學性能。結果顯示，PMMA 的生物惰性阻礙了其界面的骨吸收及骨形成，因而不能獲得最理想的生物力學性能。5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 組材料與骨組織結合緊密并形成堅強的骨性連接，植入后新生骨沿其構架逐步爬行，可有效修復感染性骨缺損，與 PMMA 相比具有更好的生物相容性，故表現出良好的抗壓縮性能。
綜上述，該新型 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 復合材料可有效抑制兔脛骨慢性骨髓炎炎癥，植入 12 周后表現出良好的骨傳導性和骨修復能力，以及較好的生物力學性能，有望成為治療慢性骨感染的新型骨替代物。但其長期的生物安全性還需通過監測血藥濃度及肝腎病理切片等方法進一步論證，而植入體內后長期的療效和風險在本研究中并未評估。因此新型材料 Lev@MSNs/n-HA/PU 距臨床應用尚需要進一步研究證據。
慢性骨髓炎是創傷和矯形外科手術中常見的、潛在的災難性并發癥[1-4]，金黃色葡萄球菌是最常見的致病菌[5-6]。左氧氟沙星（levofloxacin，Lev）已被證明可應用于治療慢性骨髓炎，并具有對葡萄球菌抗菌活性強、骨滲透性強、低毒性等優點[7-9]。載 Lev 介孔二氧化硅納米微球（Lev@mesoporous silica microspheres，Lev@MSNs）/納米羥基磷灰石（nano hydroxyapatite，n-HA）/聚氨酯（polyurethane，PU）（Lev@MSNs/n-HA/PU）是本課題組新合成的復合材料，我們的前期研究已揭示了該材料具有抗感染以及促進新生骨形成的能力[10]。本研究將進一步探討其代替骨水泥治療慢性骨髓炎的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
SPF 級成年雌性新西蘭兔 50 只，體質量（2.2±0.1）kg，由重慶醫科大學動物實驗中心提供。
金黃色葡萄球菌的標準菌株（ATCC 25923）由重慶醫科大學附屬第一醫院感染科提供，于 37℃ 營養肉湯管中培養細菌，24 h 后將細菌轉移至無菌 PBS 液中，濃度稀釋至 3×107 CFU/mL[10]。Lev（國家食品藥品檢驗所）；Palacos R+G 骨水泥粉末（Heraeus 公司，德國）。掃描電鏡（日立公司，日本）；EXAKT 300 CP 鉆石切割系統（EXAKT 公司，德國）；SANS CMT5105 萬能力學試驗機［深圳美特斯工業系統（中國）有限公司］。
1.2 材料制備及表面結構觀察
MSNs 及 n-HA 采用本課題組前期研究報道方法制備[11-13]，通過原位聚合法和同步發泡法生成 Lev@MSNs/n-HA/PU 支架[14]，并通過前期研究步驟[10]分別制備出 10 mm×6 mm×6 mm 大小的載 1 mg 和 5 mg Lev 的復合物（1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU）。另外，將 5 mg Lev 與 Palacos R+G 骨水泥粉末混合，加入 0.95 mL 聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）液體，快速混勻后填入模具中制備出 10 mm×6 mm×6 mm 大小的 Lev@PMMA。所有材料均使用 15 kGy 60Co 輻照滅菌。
取 5 mg Lev@PMMA 和 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU，用金膜包裹材料，使用掃描電鏡觀察其表面結構。
1.3 實驗分組及方法
取 50 只新西蘭兔，采用 Norden[15]的方法用 3×107 CFU/mL 濃度的金黃色葡萄球菌菌液制備右側脛骨慢性骨髓炎模型，4 周后行 X 線片檢查，其中 2 只實驗動物未觀察到明顯感染征象；其余動物造模后 4 周體溫顯著升高（P<0.05），符合慢性骨感染征象，且 X 線片上觀察到骨髓炎征象，如骨質破壞、軟組織腫脹、骨膜反應及骨硬化癥等表現，處死其中 3 只行脛骨細菌培養，結果均為陽性，提示造模成功。將造模成功的 45 只動物隨機分為 4 組，于右脛骨皮質開窗，空白對照組（A 組，n=9）僅行徹底清創術；B、C、D 組（n=12）徹底清創后分別植入材料 5 mg Lev@PMMA、1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU。術中嚴格遵守無菌原則。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況觀察
術前及術后每日監測實驗動物的體溫、體質量等指標。
1.4.2 X 線片觀察
術后 12 周取各組實驗動物，行右脛骨 X 線片檢查，觀察骨愈合情況。
1.4.3 大體觀察
X 線片觀察后過量麻醉處死各組動物，逐層分離后肢皮膚和軟組織，顯露右脛骨，行大體形態觀察脛骨骨質破壞及植入物周圍新生骨的情況。
1.4.4 組織學觀察
術后 12 周處死動物后每組隨機取 3 個右側脛骨樣本，4% 多聚甲醛固定，沖洗標本，梯度乙醇逐級脫水，包埋液浸泡。采用 EXAKT 300 CP 鉆石切割系統切片，片厚 30 μm，行亞甲基藍/酸性品紅染色，光鏡下觀察。
1.4.5 植入物-骨界面掃描電鏡觀察
B、C、D 組各隨機選取 3 個右側脛骨標本，小心清理移植體表面軟組織，掃描電鏡觀察植入材料-骨組織界面新生骨生長情況。
1.4.6 生物力學試驗
每組取 6 只實驗動物的右側脛骨，修剪半月板及軟組織后固定骨標本，使用 SANS CMT5105 萬能力學試驗機進行壓縮試驗，活塞完全覆蓋關節面并向下以 2 mm/min 施加垂直壓縮力直至骨折發生，由儀器自動記錄最大壓縮力。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較以及組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 材料表面結構觀察
掃描電鏡觀察示，5 mg Lev@PMMA 材料表面粗糙，呈不規則顆粒狀；5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 材料可觀察到典型的 n-HA 疏松多孔特征，材料孔隙大小范圍為 200～500 μm，適合骨組織再生。見圖 1。
2.2 一般情況觀察
A 組動物體質量持續下降至術后 12 周；B 組術后體質量雖增加，但術后 12 周較術前及 A 組各時間點差異無統計學意義（P>0.05）；C 組術后各時間點體質量差異均無統計學意義（P>0.05），與 A 組比較各時間點差異亦無統計學意義（P>0.05）；D 組術后 3 周體質量明顯增加，術后 12 周較術前顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05），且與 A、C 組術后 12 周比較差異有統計學意義（P<0.05），與 B 組術后 12 周比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2a。
A 組治療后體溫繼續上升，于術后 6 周達峰值，12 周時略下降；B 組體溫維持術前水平至術后 12 周略下降，但與術前比較差異無統計學意義（P>0.05）；C 組手術前后各時間點體溫比較差異均無統計學意義（P>0.05）；而 D 組體溫持續下降，術后 12 周較術前體溫顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），且與 A 組術后 12 周比較差異有統計學意義（P<0.05），與 B、C 組術后 12 周比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2b。
2.3 X 線片觀察
術后 12 周，A 組可見廣泛骨質破壞及明顯的骨膜反應，炎癥感染較術前更嚴重，波及脛骨中下段；B 組可見炎癥得到較好控制，無骨質破壞或軟組織腫脹，但 PMMA 材料占位效應明顯；C 組發現輕微骨膜反應及軟組織腫脹，提示感染未獲得良好控制；D 組可觀察到材料降解、體積減小，新骨生長覆蓋缺損部位，骨愈合表現良好。見圖 3。
2.4 大體觀察
A 組發現大面積骨缺損及廣泛的骨質破壞，脛骨近端已完全被炎癥感染破壞；B 組無明顯骨質破壞等感染表現，脛骨近端保持正常形態，但材料-骨間隙明顯，材料結構完整，無新生骨長入；C 組也見材料-骨間隙存在，可見髓腔增大，無明顯新生骨圍繞材料生長；D 組發現骨缺損修復良好，材料已出現明顯降解，骨組織與其緊密結合，大量新生骨包繞材料周圍及覆蓋材料表面。見圖 4。
2.5 組織學觀察
A 組未見明顯新生骨形成且觀察到死腔；B 組見植入物與骨組織存在間隙，間隙周圍骨壁僅有少量新生骨，未沿植入物表面爬行，界面骨改建不活躍；C 組植入物與部分骨組織間可觀察到間隙，新生骨小梁稀疏，少量新骨與舊骨間界面明顯，新生骨向植入物表面爬行緩慢；D 組見植入物周圍有大量成骨細胞，可見類骨質，界面骨吸收、骨形成活躍，新生骨圍繞材料表面及穿過材料的孔隙生長，外周骨修復區已改建形成成熟板狀骨，新生骨小梁排列整齊，結構增粗，較致密且連續。見圖 5。
2.6 植入物-骨界面掃描電鏡觀察
B 組無新生骨向材料表面生長，可見材料凸出，其界面粗糙，且與骨組織間有明顯界限；C 組可見材料-骨組織界面有纖維組織形成，未見新生骨形成，有明顯的腔隙存在；而 D 組見材料界面平坦，其與骨組織的界限已變得模糊，之間形成明顯的骨性連接，材料表面也觀察到有新生骨長入。見圖 6。
2.7 生物力學試驗
術后 12 周 A、B、C、D 組最大壓縮力分別為（281±98）、（450±120）、（355±71）、（503±101）N，B、D 組最大壓縮力顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B、D 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖1
材料表面結構掃描電鏡觀察
a. 5 mg Lev@PMMA（×50）；b. 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU（×25）
Figure1. Scanning electron microscope observation of the surface structure of the materialsa. 5 mg Lev@PMMA (×50); b. 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU (×25)
圖2
各組動物手術前后體質量和體溫比較
a. 體質量；b. 體溫
Figure2. Comparison of the body weight and body temperature in each group before and after operationa. Body weight; b. Body temperature
圖3
術前及術后 12 周各組 X 線片觀察
a. 術前；b. 術后 A 組；c. 術后 B 組；d. 術后 C 組；e. 術后 D 組
Figure3. X-ray films observation of each group before and at 12 weeks after operationa. Preoperative; b. Group A at postoperation; c. Group B at postoperation; d. Group C at postoperation; e. Group D at postoperation
圖4
術后 12 周各組標本大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4. Gross observation of the specimen of each group at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖5
術后 12 周各組亞甲基藍/酸性品紅染色觀察（×200）
黑箭頭示植入物，黃箭頭示新生骨 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Methylene blue/acid fuchsin staining observation of each group at 12 weeks after operation (×200)The black arrow indicated biomaterials, yellow arrow indicated new bone a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖6
術后 12 周植入物-骨界面掃描電鏡觀察
紅箭頭示植入物，黑箭頭示植入物-骨組織界面，綠箭頭示纖維組織，藍箭頭示新生骨a. B 組（×100）；b. C 組（×25）；c. D 組（×25）；d. D 組（×700）
Figure6. Scanning electron microscope observation of the bone-implant interface at 12 weeks after operationThe red arrow indicated biomaterials, black arrow indicated the interface between biomaterial and bone, green arrow indicated fibrous tissue, blue arrow indicated new bone a. Group B (×100); b. Group C (×25); c. Group D (×25); d. Group D (×700)
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研究報道開放性骨折 3 個月內出現嚴重感染的發生率高達 27%[16]，而開放性骨折發生后其深部感染率為 2%～50%[17]。脛骨是人體發生開放性骨折和骨感染最常見的部位[18]。廣泛切除感染骨組織可有效降低慢性骨髓炎復發的風險，但徹底清創常導致節段性骨缺損[19]。Lev 為廣譜抗生素，已被多數專家推薦用于治療骨感染[20]，且其相對分子質量小，易被 MSNs 裝載[21]。有研究報道 n-HA/PU 對成骨細胞 MG63 具有良好的骨誘導性能[22]。本課題組前期研究將 n-HA/PU 與 Lev@MSNs 復合，發現其植入體內后可使炎性細胞減少，新骨量及新生膠原纖維增加。本研究擬進一步揭示該新型復合材料治療慢性骨感染的骨修復能力，并評估其后期生物力學性能。
研究者發現骨水泥中抗生素可釋放量較低，且植入體內后藥物釋放不穩定[23-25]。據報道，骨水泥珠在植入人體內 5 年后，PMMA 將成為體內的異物，由釋放抗生素的載體轉變為培養耐藥菌的溫床[26]。而本研究的新型復合材料可在植入后 12 周內逐漸降解，在長期治療中無需二次手術取出，且其降解速度合適，降解過程中不斷有新生骨生長替代。
本研究中，A 組治療后體質量持續下降而體溫繼續上升，而 D 組植入材料 12 周后體質量明顯增加，體溫明顯下降，較治療前有顯著差異，說明其感染控制良好。X 線片及大體觀察也顯示 D 組脛骨炎癥破壞終止，可為新生骨生長提供有利環境，從而加快骨修復進程，與前期研究一致[10]，可能與 Lev@MSNs/n-HA/PU 抗生素緩釋效應延長藥物有效濃度時間有關。而掃描電鏡觀察顯示，與 D 組相比，C 組材料-骨界面形成纖維連接及有明顯間隙，結合前期研究分析原因，可能由于其植入物附近脛骨中 Lev 濃度較低，抑菌性不足，未有效控制骨感染而影響新生骨生長。
掃描電鏡及組織學觀察示，B 組中未見明顯新生骨形成，是由于 PMMA 不具有微孔結構和骨傳導作用，新生骨無法長入材料形成生物固定。而 D 組在感染控制的基礎上表現出良好的骨傳導性能，見其骨修復區改建為成熟板狀骨，新生骨小梁排列整齊，新生骨組織向植入物表面延伸生長較快。Mastrogiacomo 等[27]研究將一種羥基磷灰石支架承載 BMSCs 后植入免疫缺陷小鼠體內，其聯通孔直徑大多數超過 200 μm，較聯通孔直徑大多數<100 μm 的支架誘導新生骨生長作用更強。本研究中，D 組新型材料孔隙大小范圍為 200～500 μm，見其孔隙內有明顯的新生骨形成，也表明其孔隙結構適合新生骨生長。
根據 Li 等[28]報道，評價骨皮質承載能力的最佳方法是縱向壓縮試驗，本研究選用此方法評估材料的生物力學性能。結果顯示，PMMA 的生物惰性阻礙了其界面的骨吸收及骨形成，因而不能獲得最理想的生物力學性能。5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 組材料與骨組織結合緊密并形成堅強的骨性連接，植入后新生骨沿其構架逐步爬行，可有效修復感染性骨缺損，與 PMMA 相比具有更好的生物相容性，故表現出良好的抗壓縮性能。
綜上述，該新型 5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU 復合材料可有效抑制兔脛骨慢性骨髓炎炎癥，植入 12 周后表現出良好的骨傳導性和骨修復能力，以及較好的生物力學性能，有望成為治療慢性骨感染的新型骨替代物。但其長期的生物安全性還需通過監測血藥濃度及肝腎病理切片等方法進一步論證，而植入體內后長期的療效和風險在本研究中并未評估。因此新型材料 Lev@MSNs/n-HA/PU 距臨床應用尚需要進一步研究證據。
