引用本文： 吳冰, 丘志河, 李盛, 梁達強, 許鑒, 鐘名金, 陸偉, 王大平, 柳海峰, 朱偉民, 歐陽侃, 李皓. 自體腘繩肌腱移植重建前交叉韌帶后移植物的組織學研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(7): 873-879. doi: 10.7507/1002-1892.201802001 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）撕裂是常見的膝關節運動損傷，臨床常用關節鏡下自體腘繩肌腱移植重建手術進行治療[1-4]。但文獻報道該手術中長期失敗率高達 5%～16%，二次損傷發生率達 3%～19%[5-9]。肌腱移植物在關節內通過一系列復雜變化轉變成與正常 ACL 相似的組織結構，該過程被定義為 ACL 移植物塑形或韌帶化[10-11]。根據移植物形態學變化特點，移植物塑形過程分為塑形早期、塑形期、塑形成熟期、塑形靜止期 4 個階段。其中，文獻報道的塑形穩定期（包括塑形成熟期與靜止期）時間為術后 9～36 個月，此時肌腱移植物組織學不會再發生明顯改變[12-15]。研究發現，移植物塑形結果直接決定其生物力學特性，進而影響膝關節穩定性及運動功能[16-17]。術后 MRI 和二次關節鏡探查可以為移植物塑形提供影像學和形態學的大體判斷，但移植物在塑形穩定期的組織學特點仍然是判定移植物最終轉歸結果及關節功能恢復的金標準。
目前，大量研究主要從時間維度上對移植物組織學不同塑形階段過程進行了縱向對比研究，根據不同塑形結果的人體 ACL 移植物組織學的橫向對比研究較少，尤其是術后 4 年以上的遠期隨訪病例。為此，經深圳大學第一附屬醫院（深圳市第二人民醫院）醫學倫理委員會批準，我們在關節鏡下對塑形穩定期移植物進行評估，對評估為塑形良好（good remodeling group, GRG）與塑形不良（poor remodeling group，PRG）患者進行組織學對比研究，探索關節鏡下不同評分狀態的移植物的組織學結構特點，總結 ACL 移植物轉歸的組織學規律。
1 臨床資料
1.1 研究對象選擇及分組標準
以關節鏡下應用自體腘繩肌腱單束重建 ACL 術后，為移除脛骨端內固定物于 2017 年 3 月—12 月行二次關節鏡探查患者作為研究對象，患者均知情同意。納入標準：① 關節鏡下應用自體腘繩肌腱單束解剖位或過頂位重建 ACL 術后 4 年以上，腘繩肌腱編織為 4～8 股，兩端高強線編織 2～3 cm，移植物直徑 7.5～9.0 mm，長度 7～10 cm；股骨端帶袢鈦板（1.5～2.5 cm；Smith&Nephew 公司，美國）懸吊固定，脛骨端骨道內羥基磷灰石生物界面螺釘（Smith&Nephew 公司，美國）、骨道外門形釘雙重固定。② 手術均由同一組醫生完成，術后采用相同康復訓練。③ 二次關節鏡探查前，KT2000（MED metric 公司，美國）檢查雙側膝關節前向位移差異≤5 mm；患膝關節 MRI 檢查證實移植物連續性完整、無移植物缺失。④ 二次關節鏡探查證實關節內移植物連續性完整且容量缺損≤30%。排除標準：① ACL 翻修者；② 單獨使用或加用同種異體肌腱重建 ACL 者；③ 膝關節痛風性關節炎、類風濕性關節炎、結核性關節炎等慢性代謝或傳染性關節病變。
二次關節鏡手術時，由 2 位未參與 ACL 重建術的高年資醫生分別對納入研究患者的移植物進行評分。評分標準[18-19]：① 移植物滑膜及血管覆蓋。A 級：移植物全部被滑膜覆蓋，滑膜中有大量血管；B 級：移植物部分區域無滑膜覆蓋，血管覆蓋較少；C 級：移植物大部分或全部無滑膜覆蓋，血管覆蓋極少或缺失。② 移植物張力。A 級：移植物張力良好，從屈膝 0～90° 之間張力類似正常 ACL；B 級：輕度松弛，較正常 ACL 張力減小且部分區域存在移植物迂曲、松散表現；C 級：明顯松弛，張力較正常 ACL 明顯降低。③ 移植物容量及纖維再撕裂情況，反映移植物撞擊情況。術中測量移植物絕對直徑，并與重建手術時移植物直徑進行對比，評估移植物容量減小比例。A 級：移植物無撕裂纖維，容量≥80%；B 級：移植物表面部分撕裂，移植物容量 30%～80%；C 級：移植物大部分撕裂，剩余纖維容量≤30%。以上 3 個指標中，A 級 2 分，B 級 1 分，C 級 0 分；其中移植物容量及再撕裂評分評定為 C 級者直接排除研究。總分為 4～6 分者歸為 GRG，1～3 分者歸為 PRG。
另取同期行人工全膝關節置換術且年齡<60 歲患者的正常 ACL 標本作為對照組。排除標準：60 歲以上老年嚴重骨關節炎患者、ACL 損傷患者、類風濕性膝關節炎、膝關節感染性疾病。
1.2 組織學觀察
1.2.1 移植物取材
關節鏡下使用 3 mm 籃鉗從移植物關節內部分的中央區域縱向鉗取移植物，移植物大小約 3 mm（厚度）×8 mm（長度），注意避開移植物撕裂或磨損區域，取樣前先用探鉤拉開移植物表面滑膜，并用射頻切開部分滑膜，避免鉗取滑膜組織。另外，用同樣方法從人工全膝關節置換患者正常 ACL 鉗取樣本。樣本分為 4 份，透射電鏡送檢樣品 2 份，縱切面與橫切面各 1 份，大小分別約 1 mm（厚度）×2 mm（長度）、2 mm（厚度）×1 mm（長度）；光鏡送檢樣品 2 份，均是縱切片，大小 3 mm（厚度）×3 mm（長度）。
1.2.2 HE 染色觀察
取樣本經 10% 中性甲醛固定、乙醇脫水、三氯甲烷透明化處理后石蠟包埋，制備 5 μm 厚縱切片，HE 染色后光鏡下觀察。光鏡下評估指標[20-21]：① 血管分布。0 分，豐富的血管分布，類似新鮮肉芽組織；1 分，肥厚性炎性血管增生；2 分：中等程度血管增生；3 分，少量血管分布；4 分：無血管分布。② 細胞形態。200 倍鏡下，0 分，標本大部分或絕大部分為圓形細胞核；1 分，紡錘形細胞核為主，其次為圓形細胞核；2 分，紡錘形細胞核為主，其次為橢圓形細胞核；3 分，紡錘形細胞核為主，其次為線形細胞核；4 分，線形細胞核為主。
1.2.3 透射電鏡觀察
取標本固定于預冷的 4℃ 電鏡固定液（2.5% 中性戊二醛），然后固定于 1.0% 四氧化鋨固定液中，經乙醇脫水、丙酮浸透、樹脂包埋。先行 5 μm 層厚組織切片及甲苯胺藍染色，光鏡下定位目標觀測區域，然后再行 70 nm 層厚序貫切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色后，透射電鏡觀察。透射電鏡下評估指標[12]：① 細胞合成代謝，反應膠原及其他蛋白合成代謝水平。0 分，細胞核體積遠大于細胞質，核質比≥4，沒有或有極少量細胞器；1 分，少量細胞質及細胞器，核質比為 2～4；2 分，中等量細胞質及細胞器，核質比為 1～2；3 分，較多的細胞質及細胞器，核質比為 0.5～1.0；4 分，大量細胞質及細胞器，核質比<0.5。② 膠原纖維分布：0 分，無大直徑（≥100 nm）膠原纖維存在，小直徑（≤100 nm）膠原纖維單峰分布；1 分，偶有少量大直徑膠原纖維焦點狀分布于小直徑膠原纖維中；2 分，大直徑膠原纖維局灶性分布，大、小膠原纖維混合呈雙峰分布；3 分，同一視野下各區域均有較多大直徑膠原纖維存在，大直徑膠原纖維不均勻排列，大、小膠原纖維混合呈雙峰分布；4 分，大量大直徑膠原纖維規律地分布于小直徑膠原纖維中，大、小膠原纖維混合呈雙峰分布。
1.3 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用 LSD 檢驗，方差不齊時采用 Dunnett t 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。計數資料組間比較采用 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 分組情況
共 18 例二次關節鏡探查患者符合選擇標準納入研究，關節鏡下移植物評分為 2～6 分，平均 4.7 分；其中 GRG 組 11 例、PRG 組 7 例。見圖 1。GRG 組與 PRG 組患者年齡、性別、受傷至 ACL 重建術時間、ACL 重建術至二次關節鏡手術時間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；國際膝關節文獻委員會（IKDC）評分、脛骨前向位移雙側差異比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。對照組 9 例，男 6 例、女 3 例；年齡 48～59 歲，平均 54.6 歲。
表1
GRG 組及 PRG 組患者一般資料比較（
）
Table1.
Comparison of general data between GRG and PRG groups (
)
圖1
不同塑形結果移植物關節鏡二次探查及 MRI 檢查
從左至右分別為關節鏡及 MRI T1、T2 加權像圖片 a. GRG 組；b. PRG 組
Figure1. The results of second-look arthroscopy and MRI of ACL grafts with different remodeling outcomesFrom left to right for arthroscopic image, and T1 and T2 of MRI images a. GRG group; b. PRG group
2.2 HE 染色觀察
GRG 組：組織學特點類似于對照組正常 ACL 組織，表現為血管分布較少或無；膠原纖維呈緊密的束狀、同向、均勻排列，同向波紋明顯；組織以橢圓形纖維細胞為主，成纖維細胞少見，細胞與膠原纖維呈同軸性排列，細胞核以線形或紡錘形為主，橢圓形及圓形細胞核少見。PRG 組：膠原纖維排列較松散、無規律，同向波紋不明顯，組織以多角形或星形成纖維細胞為主，細胞核主要呈橢圓形或圓形，線形及紡錘形細胞核少見。見圖 2。
PRG 組血管分布及細胞形態評分均明顯低于對照組及 GRG 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；GRG 組與對照組血管分布及細胞形態評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
2.3 透射電鏡觀察
透射電鏡觀察示，與正常 ACL 類似，所有重建的 ACL 移植物也表現為大直徑膠原纖維與小直徑膠原纖維雙峰混合排列。對照組及 GRG 組大直徑膠原纖維多，粗面內質網、線粒體、高爾基體、分泌小泡等細胞器較少；PRG 組小直徑膠原纖維多，細胞質及粗面內質網、線粒體、高爾基體、分泌小泡等細胞器含量豐富。見圖 3。
PRG 組膠原纖維分布評分明顯低于對照組及 GRG 組，但細胞合成代謝評分明顯高于對照組及 GRG 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；GRG 組細胞合成代謝評分與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05），但膠原纖維分布評分明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
圖2
HE 染色觀察（×100）
從左至右分別為對照組、GRG 組、PRG 組 a. 血管分布（箭頭）；b. 細胞形態
Figure2. Observation of HE staining (×100)From left to right for control group, GRG group and PRG group, respectively a. Graft vascularity (arrow); b. Graft cellular morphology
圖3
透射電鏡觀察
從左至右分別為對照組、GRG 組、PRG 組 a. 細胞合成代謝（×5 000）；b. 膠原纖維分布（×50 k）
Figure3. Representative cellular ultrastructure under transmission electron microscopyFrom left to right for control group, GRG group, and PRG group, respectively a. Cell anabolism (×5 000); b. Collagen fibril distribution (×50 k)
表2
3 組組織學評分比較（
）
Table2.
Comparision of histologic scores between 3 groups (
)
3 討論
3.1 ACL 移植物塑形與膠原纖維分布
自體腘繩肌腱因形態學、組織學及生物力學方面的優勢，已成為最常用的 ACL 重建移植物來源[1-4, 22]。目前，各研究對移植物塑形成熟時間描述不盡相同，從術后 9 個月到術后 36 個月不等。雖然在塑形成熟的時間上，目前仍存在較大分歧，但絕大多數研究認為游離的移植肌腱不可能塑形成為正常 ACL 組織[12, 23-24]。本研究的透射電鏡觀察也得到類似結果，雖然在細胞合成代謝方面，GRG 組 ACL 組織與正常 ACL 無明顯差異，但在膠原纖維分布特點上仍與正常 ACL 明顯不同，表現為大直徑膠原纖維顆粒的數量及比例明顯低于正常 ACL。
既往研究發現，正常韌帶與肌腱組織由大直徑與小直徑兩種類型的膠原纖維組成，形成大、小直徑膠原纖維雙峰態分布模式，而大直徑膠原纖維數量與移植物抗張力強度有直接關系[12, 22-27]。移植物塑形過程中，大直徑膠原纖維會逐漸減少，最終 ACL 移植物中只有小直徑膠原纖維呈單峰模式分布，而無大直徑膠原纖維的存在[12, 22, 24]。本研究發現，GRG 組及 PRG 組移植物均存在大直徑膠原纖維的分布，塑形成熟度越高的移植物組織，大直徑膠原纖維含量越豐富，且分布越均勻，這與 Dong 等[21]的研究結果一致。
3.2 不同塑形結果的移植物細胞形態及細胞代謝差異
正常肌腱與韌帶組織主要由橢圓形纖維細胞為主，較少多角形或星形成纖維細胞[12-15]。本研究發現，在塑形不良的移植物中，代謝活躍的成纖維細胞含量明顯多于處于成熟的纖維細胞，而塑形良好的移植物組織類似于正常肌腱和韌帶，以處于相對靜止狀態的纖維細胞數量為主。塑形不良的移植物組織中，膠原合成代謝明顯高于正常 ACL 及塑形良好的移植物組織，這可能與炎性血管增生所導致的一系列炎性因子及生長因子的刺激有關[13, 21]，表現為細胞質與細胞核比率明顯增高，線粒體、粗面內質網、高爾基體、分泌小泡等細胞器數量增多。
3.3 ACL 移植物塑形的“Wolf 定律”
本研究發現，塑形良好的移植物細胞合成代謝水平與正常 ACL 無明顯差異，但此時大直徑移植物膠原纖維含量仍低于正常 ACL。這從一個角度說明，移植物仍然無法塑形成為超微結構與正常 ACL 組織完全相同的結構。我們分析該現象可以從骨結構改建的 Wolf 定律加以解釋：ACL 重建術后，由于重建的 ACL 與正常 ACL 的解剖學差異、膝關節運動方式的改變、ACL 移植物關節內撞擊等因素，導致 ACL 移植物的局部生物力學環境較正常 ACL 發生改變，組織為適應這些差異表現出了不一樣的生物學特性，比如與抗張力強度直接相關的大直徑膠原纖維數量與分布方式的改變[26]。處于塑形成熟期或靜止期的 ACL 移植物已經適應目前的膝關節生物力學環境，而維持相對穩定的組織學特性，但當移植物內部生物力學環境改變，比如膝關節運動方式改變引起移植物內部張力增高，甚至出現少部分纖維撕裂時，移植物可以改變目前的組織學“靜止”狀態而再次進入塑形階段，類似于之前各階段的塑形過程。這種組織學塑形改變的程度與由周圍滑膜、脂肪墊等組織進入移植物的成纖維細胞及炎癥血管數量及細胞代謝的活躍程度有關[10, 16]。因此，關節鏡下移植物滑膜及血管組織覆蓋為移植物塑形的再血管化及膠原代謝及改建提供了基礎[12, 23]。但是該結論需要進一步的縱向長期研究進一步證實。
3.4 關節鏡與光鏡下移植物血管化評分差異
關節鏡下移植物滑膜及血管組織覆蓋程度低的組織往往被評估為移植物塑形不良[23-24]，但這與光鏡下血管分布（移植物再血管化）結果不一致，因為既往研究及本研究均發現移植物內部再血管化程度與炎性反應程度成正相關，而炎性反應是移植物塑形過程具有代表性組織學變化之一，血管分布越廣泛，表明移植物炎性反應程度越高，移植物組織塑形成熟度越低[13]。結合關節鏡探查與光鏡下血管分布結果，我們分析這種差異可能與移植物局部的生物學環境有關。由于骨道位置不合理、移植物撞擊、康復鍛煉激進等因素的影響，移植物局部纖維反復遭受微小撕裂創傷，對應的組織修復反應也越明顯，而表現為移植物內部過度肥厚增生的血管組織。但由于移植物外部受到移植物解剖學位置的反復變動（骨道位置位置不正確）或周邊其他結構的反復機械撞擊（移植物撞擊），塑形不良的移植物無法像處于解剖、生物力學環境相對穩定的塑形良好的組織一樣，表面形成大量、穩定的滑膜及血管包繞，而在關節鏡下表現為移植物表面滑膜及血管覆蓋較少，但移植物表面這些滑膜已經足夠為移植物內部的炎性反應提供充足的血管及細胞來源。
3.5 本研究不足
① 本研究是活體人體組織標本研究，受到標本取樣量的限制，不能取整個韌帶進行多處病理檢查。因此，實驗結果可能受取材部位差異的影響。② 對照組取材于人工全膝關節置換患者的正常 ACL，但這類患者年齡往往偏大，而 ACL 重建患者多為青壯年。因此，對照組結果可能不能完全反映人正常的 ACL 結構。③ 未考慮不同觀察者之間的觀察結果統計學差異。
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）撕裂是常見的膝關節運動損傷，臨床常用關節鏡下自體腘繩肌腱移植重建手術進行治療[1-4]。但文獻報道該手術中長期失敗率高達 5%～16%，二次損傷發生率達 3%～19%[5-9]。肌腱移植物在關節內通過一系列復雜變化轉變成與正常 ACL 相似的組織結構，該過程被定義為 ACL 移植物塑形或韌帶化[10-11]。根據移植物形態學變化特點，移植物塑形過程分為塑形早期、塑形期、塑形成熟期、塑形靜止期 4 個階段。其中，文獻報道的塑形穩定期（包括塑形成熟期與靜止期）時間為術后 9～36 個月，此時肌腱移植物組織學不會再發生明顯改變[12-15]。研究發現，移植物塑形結果直接決定其生物力學特性，進而影響膝關節穩定性及運動功能[16-17]。術后 MRI 和二次關節鏡探查可以為移植物塑形提供影像學和形態學的大體判斷，但移植物在塑形穩定期的組織學特點仍然是判定移植物最終轉歸結果及關節功能恢復的金標準。
目前，大量研究主要從時間維度上對移植物組織學不同塑形階段過程進行了縱向對比研究，根據不同塑形結果的人體 ACL 移植物組織學的橫向對比研究較少，尤其是術后 4 年以上的遠期隨訪病例。為此，經深圳大學第一附屬醫院（深圳市第二人民醫院）醫學倫理委員會批準，我們在關節鏡下對塑形穩定期移植物進行評估，對評估為塑形良好（good remodeling group, GRG）與塑形不良（poor remodeling group，PRG）患者進行組織學對比研究，探索關節鏡下不同評分狀態的移植物的組織學結構特點，總結 ACL 移植物轉歸的組織學規律。
1 臨床資料
1.1 研究對象選擇及分組標準
以關節鏡下應用自體腘繩肌腱單束重建 ACL 術后，為移除脛骨端內固定物于 2017 年 3 月—12 月行二次關節鏡探查患者作為研究對象，患者均知情同意。納入標準：① 關節鏡下應用自體腘繩肌腱單束解剖位或過頂位重建 ACL 術后 4 年以上，腘繩肌腱編織為 4～8 股，兩端高強線編織 2～3 cm，移植物直徑 7.5～9.0 mm，長度 7～10 cm；股骨端帶袢鈦板（1.5～2.5 cm；Smith&Nephew 公司，美國）懸吊固定，脛骨端骨道內羥基磷灰石生物界面螺釘（Smith&Nephew 公司，美國）、骨道外門形釘雙重固定。② 手術均由同一組醫生完成，術后采用相同康復訓練。③ 二次關節鏡探查前，KT2000（MED metric 公司，美國）檢查雙側膝關節前向位移差異≤5 mm；患膝關節 MRI 檢查證實移植物連續性完整、無移植物缺失。④ 二次關節鏡探查證實關節內移植物連續性完整且容量缺損≤30%。排除標準：① ACL 翻修者；② 單獨使用或加用同種異體肌腱重建 ACL 者；③ 膝關節痛風性關節炎、類風濕性關節炎、結核性關節炎等慢性代謝或傳染性關節病變。
二次關節鏡手術時，由 2 位未參與 ACL 重建術的高年資醫生分別對納入研究患者的移植物進行評分。評分標準[18-19]：① 移植物滑膜及血管覆蓋。A 級：移植物全部被滑膜覆蓋，滑膜中有大量血管；B 級：移植物部分區域無滑膜覆蓋，血管覆蓋較少；C 級：移植物大部分或全部無滑膜覆蓋，血管覆蓋極少或缺失。② 移植物張力。A 級：移植物張力良好，從屈膝 0～90° 之間張力類似正常 ACL；B 級：輕度松弛，較正常 ACL 張力減小且部分區域存在移植物迂曲、松散表現；C 級：明顯松弛，張力較正常 ACL 明顯降低。③ 移植物容量及纖維再撕裂情況，反映移植物撞擊情況。術中測量移植物絕對直徑，并與重建手術時移植物直徑進行對比，評估移植物容量減小比例。A 級：移植物無撕裂纖維，容量≥80%；B 級：移植物表面部分撕裂，移植物容量 30%～80%；C 級：移植物大部分撕裂，剩余纖維容量≤30%。以上 3 個指標中，A 級 2 分，B 級 1 分，C 級 0 分；其中移植物容量及再撕裂評分評定為 C 級者直接排除研究。總分為 4～6 分者歸為 GRG，1～3 分者歸為 PRG。
另取同期行人工全膝關節置換術且年齡<60 歲患者的正常 ACL 標本作為對照組。排除標準：60 歲以上老年嚴重骨關節炎患者、ACL 損傷患者、類風濕性膝關節炎、膝關節感染性疾病。
1.2 組織學觀察
1.2.1 移植物取材
關節鏡下使用 3 mm 籃鉗從移植物關節內部分的中央區域縱向鉗取移植物，移植物大小約 3 mm（厚度）×8 mm（長度），注意避開移植物撕裂或磨損區域，取樣前先用探鉤拉開移植物表面滑膜，并用射頻切開部分滑膜，避免鉗取滑膜組織。另外，用同樣方法從人工全膝關節置換患者正常 ACL 鉗取樣本。樣本分為 4 份，透射電鏡送檢樣品 2 份，縱切面與橫切面各 1 份，大小分別約 1 mm（厚度）×2 mm（長度）、2 mm（厚度）×1 mm（長度）；光鏡送檢樣品 2 份，均是縱切片，大小 3 mm（厚度）×3 mm（長度）。
1.2.2 HE 染色觀察
取樣本經 10% 中性甲醛固定、乙醇脫水、三氯甲烷透明化處理后石蠟包埋，制備 5 μm 厚縱切片，HE 染色后光鏡下觀察。光鏡下評估指標[20-21]：① 血管分布。0 分，豐富的血管分布，類似新鮮肉芽組織；1 分，肥厚性炎性血管增生；2 分：中等程度血管增生；3 分，少量血管分布；4 分：無血管分布。② 細胞形態。200 倍鏡下，0 分，標本大部分或絕大部分為圓形細胞核；1 分，紡錘形細胞核為主，其次為圓形細胞核；2 分，紡錘形細胞核為主，其次為橢圓形細胞核；3 分，紡錘形細胞核為主，其次為線形細胞核；4 分，線形細胞核為主。
1.2.3 透射電鏡觀察
取標本固定于預冷的 4℃ 電鏡固定液（2.5% 中性戊二醛），然后固定于 1.0% 四氧化鋨固定液中，經乙醇脫水、丙酮浸透、樹脂包埋。先行 5 μm 層厚組織切片及甲苯胺藍染色，光鏡下定位目標觀測區域，然后再行 70 nm 層厚序貫切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色后，透射電鏡觀察。透射電鏡下評估指標[12]：① 細胞合成代謝，反應膠原及其他蛋白合成代謝水平。0 分，細胞核體積遠大于細胞質，核質比≥4，沒有或有極少量細胞器；1 分，少量細胞質及細胞器，核質比為 2～4；2 分，中等量細胞質及細胞器，核質比為 1～2；3 分，較多的細胞質及細胞器，核質比為 0.5～1.0；4 分，大量細胞質及細胞器，核質比<0.5。② 膠原纖維分布：0 分，無大直徑（≥100 nm）膠原纖維存在，小直徑（≤100 nm）膠原纖維單峰分布；1 分，偶有少量大直徑膠原纖維焦點狀分布于小直徑膠原纖維中；2 分，大直徑膠原纖維局灶性分布，大、小膠原纖維混合呈雙峰分布；3 分，同一視野下各區域均有較多大直徑膠原纖維存在，大直徑膠原纖維不均勻排列，大、小膠原纖維混合呈雙峰分布；4 分，大量大直徑膠原纖維規律地分布于小直徑膠原纖維中，大、小膠原纖維混合呈雙峰分布。
1.3 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用 LSD 檢驗，方差不齊時采用 Dunnett t 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。計數資料組間比較采用 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 分組情況
共 18 例二次關節鏡探查患者符合選擇標準納入研究，關節鏡下移植物評分為 2～6 分，平均 4.7 分；其中 GRG 組 11 例、PRG 組 7 例。見圖 1。GRG 組與 PRG 組患者年齡、性別、受傷至 ACL 重建術時間、ACL 重建術至二次關節鏡手術時間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；國際膝關節文獻委員會（IKDC）評分、脛骨前向位移雙側差異比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。對照組 9 例，男 6 例、女 3 例；年齡 48～59 歲，平均 54.6 歲。
表1
GRG 組及 PRG 組患者一般資料比較（
）
Table1.
Comparison of general data between GRG and PRG groups (
)
圖1
不同塑形結果移植物關節鏡二次探查及 MRI 檢查
從左至右分別為關節鏡及 MRI T1、T2 加權像圖片 a. GRG 組；b. PRG 組
Figure1. The results of second-look arthroscopy and MRI of ACL grafts with different remodeling outcomesFrom left to right for arthroscopic image, and T1 and T2 of MRI images a. GRG group; b. PRG group
2.2 HE 染色觀察
GRG 組：組織學特點類似于對照組正常 ACL 組織，表現為血管分布較少或無；膠原纖維呈緊密的束狀、同向、均勻排列，同向波紋明顯；組織以橢圓形纖維細胞為主，成纖維細胞少見，細胞與膠原纖維呈同軸性排列，細胞核以線形或紡錘形為主，橢圓形及圓形細胞核少見。PRG 組：膠原纖維排列較松散、無規律，同向波紋不明顯，組織以多角形或星形成纖維細胞為主，細胞核主要呈橢圓形或圓形，線形及紡錘形細胞核少見。見圖 2。
PRG 組血管分布及細胞形態評分均明顯低于對照組及 GRG 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；GRG 組與對照組血管分布及細胞形態評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
2.3 透射電鏡觀察
透射電鏡觀察示，與正常 ACL 類似，所有重建的 ACL 移植物也表現為大直徑膠原纖維與小直徑膠原纖維雙峰混合排列。對照組及 GRG 組大直徑膠原纖維多，粗面內質網、線粒體、高爾基體、分泌小泡等細胞器較少；PRG 組小直徑膠原纖維多，細胞質及粗面內質網、線粒體、高爾基體、分泌小泡等細胞器含量豐富。見圖 3。
PRG 組膠原纖維分布評分明顯低于對照組及 GRG 組，但細胞合成代謝評分明顯高于對照組及 GRG 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；GRG 組細胞合成代謝評分與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05），但膠原纖維分布評分明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
圖2
HE 染色觀察（×100）
從左至右分別為對照組、GRG 組、PRG 組 a. 血管分布（箭頭）；b. 細胞形態
Figure2. Observation of HE staining (×100)From left to right for control group, GRG group and PRG group, respectively a. Graft vascularity (arrow); b. Graft cellular morphology
圖3
透射電鏡觀察
從左至右分別為對照組、GRG 組、PRG 組 a. 細胞合成代謝（×5 000）；b. 膠原纖維分布（×50 k）
Figure3. Representative cellular ultrastructure under transmission electron microscopyFrom left to right for control group, GRG group, and PRG group, respectively a. Cell anabolism (×5 000); b. Collagen fibril distribution (×50 k)
表2
3 組組織學評分比較（
）
Table2.
Comparision of histologic scores between 3 groups (
)
3 討論
3.1 ACL 移植物塑形與膠原纖維分布
自體腘繩肌腱因形態學、組織學及生物力學方面的優勢，已成為最常用的 ACL 重建移植物來源[1-4, 22]。目前，各研究對移植物塑形成熟時間描述不盡相同，從術后 9 個月到術后 36 個月不等。雖然在塑形成熟的時間上，目前仍存在較大分歧，但絕大多數研究認為游離的移植肌腱不可能塑形成為正常 ACL 組織[12, 23-24]。本研究的透射電鏡觀察也得到類似結果，雖然在細胞合成代謝方面，GRG 組 ACL 組織與正常 ACL 無明顯差異，但在膠原纖維分布特點上仍與正常 ACL 明顯不同，表現為大直徑膠原纖維顆粒的數量及比例明顯低于正常 ACL。
既往研究發現，正常韌帶與肌腱組織由大直徑與小直徑兩種類型的膠原纖維組成，形成大、小直徑膠原纖維雙峰態分布模式，而大直徑膠原纖維數量與移植物抗張力強度有直接關系[12, 22-27]。移植物塑形過程中，大直徑膠原纖維會逐漸減少，最終 ACL 移植物中只有小直徑膠原纖維呈單峰模式分布，而無大直徑膠原纖維的存在[12, 22, 24]。本研究發現，GRG 組及 PRG 組移植物均存在大直徑膠原纖維的分布，塑形成熟度越高的移植物組織，大直徑膠原纖維含量越豐富，且分布越均勻，這與 Dong 等[21]的研究結果一致。
3.2 不同塑形結果的移植物細胞形態及細胞代謝差異
正常肌腱與韌帶組織主要由橢圓形纖維細胞為主，較少多角形或星形成纖維細胞[12-15]。本研究發現，在塑形不良的移植物中，代謝活躍的成纖維細胞含量明顯多于處于成熟的纖維細胞，而塑形良好的移植物組織類似于正常肌腱和韌帶，以處于相對靜止狀態的纖維細胞數量為主。塑形不良的移植物組織中，膠原合成代謝明顯高于正常 ACL 及塑形良好的移植物組織，這可能與炎性血管增生所導致的一系列炎性因子及生長因子的刺激有關[13, 21]，表現為細胞質與細胞核比率明顯增高，線粒體、粗面內質網、高爾基體、分泌小泡等細胞器數量增多。
3.3 ACL 移植物塑形的“Wolf 定律”
本研究發現，塑形良好的移植物細胞合成代謝水平與正常 ACL 無明顯差異，但此時大直徑移植物膠原纖維含量仍低于正常 ACL。這從一個角度說明，移植物仍然無法塑形成為超微結構與正常 ACL 組織完全相同的結構。我們分析該現象可以從骨結構改建的 Wolf 定律加以解釋：ACL 重建術后，由于重建的 ACL 與正常 ACL 的解剖學差異、膝關節運動方式的改變、ACL 移植物關節內撞擊等因素，導致 ACL 移植物的局部生物力學環境較正常 ACL 發生改變，組織為適應這些差異表現出了不一樣的生物學特性，比如與抗張力強度直接相關的大直徑膠原纖維數量與分布方式的改變[26]。處于塑形成熟期或靜止期的 ACL 移植物已經適應目前的膝關節生物力學環境，而維持相對穩定的組織學特性，但當移植物內部生物力學環境改變，比如膝關節運動方式改變引起移植物內部張力增高，甚至出現少部分纖維撕裂時，移植物可以改變目前的組織學“靜止”狀態而再次進入塑形階段，類似于之前各階段的塑形過程。這種組織學塑形改變的程度與由周圍滑膜、脂肪墊等組織進入移植物的成纖維細胞及炎癥血管數量及細胞代謝的活躍程度有關[10, 16]。因此，關節鏡下移植物滑膜及血管組織覆蓋為移植物塑形的再血管化及膠原代謝及改建提供了基礎[12, 23]。但是該結論需要進一步的縱向長期研究進一步證實。
3.4 關節鏡與光鏡下移植物血管化評分差異
關節鏡下移植物滑膜及血管組織覆蓋程度低的組織往往被評估為移植物塑形不良[23-24]，但這與光鏡下血管分布（移植物再血管化）結果不一致，因為既往研究及本研究均發現移植物內部再血管化程度與炎性反應程度成正相關，而炎性反應是移植物塑形過程具有代表性組織學變化之一，血管分布越廣泛，表明移植物炎性反應程度越高，移植物組織塑形成熟度越低[13]。結合關節鏡探查與光鏡下血管分布結果，我們分析這種差異可能與移植物局部的生物學環境有關。由于骨道位置不合理、移植物撞擊、康復鍛煉激進等因素的影響，移植物局部纖維反復遭受微小撕裂創傷，對應的組織修復反應也越明顯，而表現為移植物內部過度肥厚增生的血管組織。但由于移植物外部受到移植物解剖學位置的反復變動（骨道位置位置不正確）或周邊其他結構的反復機械撞擊（移植物撞擊），塑形不良的移植物無法像處于解剖、生物力學環境相對穩定的塑形良好的組織一樣，表面形成大量、穩定的滑膜及血管包繞，而在關節鏡下表現為移植物表面滑膜及血管覆蓋較少，但移植物表面這些滑膜已經足夠為移植物內部的炎性反應提供充足的血管及細胞來源。
3.5 本研究不足
① 本研究是活體人體組織標本研究，受到標本取樣量的限制，不能取整個韌帶進行多處病理檢查。因此，實驗結果可能受取材部位差異的影響。② 對照組取材于人工全膝關節置換患者的正常 ACL，但這類患者年齡往往偏大，而 ACL 重建患者多為青壯年。因此，對照組結果可能不能完全反映人正常的 ACL 結構。③ 未考慮不同觀察者之間的觀察結果統計學差異。
