引用本文： 楊曉, 李思, 向尚, 吳衣論, 王琳, 彭錦, 馮穎. RNA 干擾降低唾液酸酶 3 表達對骨肉瘤 MG-63 細胞增殖和凋亡影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(7): 887-892. doi: 10.7507/1002-1892.201801077 復制
糖基化異常是腫瘤細胞特異性特征之一，唾液酸是廣泛存在于生物體內的一類九碳糖類化合物[1-2]。在惡性轉化過程中，唾液酸化改變被認為與腫瘤細胞轉移和侵襲力密切相關。惡性腫瘤細胞表面常呈現糖蛋白唾液酸化程度升高[3-4]。機體內控制唾液酸水平的代謝關鍵酶是唾液酸酶（neuraminidase，NEU）和唾液酸糖基轉移酶，其中 NEU 是一種糖苷酶，能催化去除糖蛋白和糖酯末端的唾液酸殘基[5]。在哺乳動物體內，目前已鑒定并克隆出 4 種 NEU，根據其一級結構、定位、底物特性和酶學特性分為 NEU1、NEU2、NEU3 和 NEU4[6]，其中 NEU3 僅特異性水解神經節苷酯，幾乎不作用于其他底物；人源性 NEU3 在細胞膜和膜性細胞器上均有表達，并且在生長刺激下可以遷移濃聚[7]。一系列研究表明 NEU 活性與細胞分化、細胞增殖以及細胞黏附侵襲均密切相關，且 NEU3 是在腫瘤發生過程中唯一上調的 NEU[8-10]。
骨肉瘤是常見的骨原發性惡性腫瘤之一，好發于青少年，其惡性程度較高、預后較差。由于缺少有效的早期診斷方法，骨肉瘤確診時大多已為晚期，手術切除的預后并不理想。已有研究發現細胞質 NEU2 可抑制 FBJ 病毒誘導的小鼠骨肉瘤 FBJ-LL 細胞生長[11]。Sandhu 等[12]發現骨肉瘤及其他骨形成腫瘤患者血清唾液酸含量明顯增高，提示骨肉瘤的發生發展可能與唾液酸相關。本研究應用 RNA 干擾（RNA interfering，RNAi）技術，降低骨肉瘤 MG-63 細胞中 NEU3 基因的表達，并檢測此條件下 MG-63 細胞增殖和凋亡的情況，以分析 NEU3 在骨肉瘤 MG-63 細胞增殖和凋亡過程中的作用，以期為骨肉瘤治療提供可能的治療靶點和新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
骨肉瘤 MG-63 細胞由四川大學基礎醫學與法醫學院孫曉東博士贈送。MEM 培養基、FBS、青霉素-鏈霉素雙抗（HyClone 公司，美國）；0.25% EDTA-胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；RNAi 試劑 genOFFTM st-h-NEU3（廣州銳博生物科技有限公司）；Bcl-2 抗兔多克隆抗體、Ras 抗兔多克隆抗體、β-actin 抗鼠單克隆抗體（成都正能生物技術有限責任公司）；NEU3 抗羊多克隆抗體（Santa Cruz 公司，美國）；脂質體轉染試劑盒 Lipofectamine 3000、驢抗山羊二抗（Thermo Fisher 公司，美國）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；抗熒光淬滅封片液（上海碧云天生物技術有限公司）；PrimeScript RT Reagent Kit 逆轉錄試劑盒（Takara 公司，日本）；DNA 酶（Thermo Scientific 公司，美國）；SYBR Select Master Mix（Applied Biosystems 公司，美國）；TrizolTM（Ambion 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；DOJINDO 公司，日本）。流式細胞儀（MILLOPORE 公司，美國）；酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）；熒光定量 PCR 儀（Thermo Scientific 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
取 MG-63 細胞置于含 10%FBS 的 MEM 培養基中，于 37℃、5%CO2 條件下常規培養。待細胞貼壁，呈上皮細胞樣后，取對數生長期 MG-63 細胞，根據處理方法不同分為 5 組： 正常對照組（A 組），不作任何處理； 30、50、100 nmol/L NEU3 RNA 干擾組（分別為 B、C、D 組），分別以濃度為 30、50、100 nmol/L 的 NEU3 小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染細胞；陰性對照組（E 組），使用不同種屬陰性對照 siRNA （小鼠 actin siRNA，50 nmol/L）轉染細胞。轉染后細胞培養 24 h 或 48 h 后用于后續實驗檢測。
1.3 觀測指標
1.3.1 免疫熒光染色觀察
將 MG-63 細胞接種于 24 孔板圓形防脫玻璃蓋玻片上，培養 24 h，棄上清；室溫下多聚甲醛固定 30 min 后，0.1%PBS-Tween 溶液（PBST）洗 3 次；0.1%皂苷溶液室溫通透 15 min；1%牛血清白蛋白+3%山羊血清 PBST 溶液室溫封閉 1 h；NEU3 一抗（1∶100）4℃ 孵育過夜，DyLight680 山羊抗鼠二抗（1∶500）室溫避光 孵育1 h；DAPI 溶液（15 μg/mL）室溫避光孵育 15 min。用抗熒光淬滅封片劑封片后，熒光顯微鏡下觀察 MG-63 細胞中 NEU3 的表達情況。
1.3.2 實時熒光定量 PCR 檢測 NEU3 mRNA 表達水平
將 MG-63 細胞接種于 12 孔板后，按照 1.2 分組方法進行細胞轉染。24 h 后，各組取 3 孔細胞，以 Trizol 提取總 RNA，檢測 RNA 質量，并記錄濃度。使用 DNA 酶 37℃ 消化處理基因組 DNA 30 min，加入 1 μL 50 mmol/L EDTA 65℃ 滅活 10 min。然后使用逆轉錄試劑盒合成 cDNA，反應條件為：37℃、15 min，85℃、5 s。以此 cDNA 為模板進行 PCR，引物序列見表 1。PCR 反應條件：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、1 min，40 個循環。以 GAPDH 作為內參基因，使用 2–ΔΔCt法計算各組中 NEU3 mRNA 相對表達量。
表1
引物序列及擴增片段長度
Table1.
Primer sequence and amplification section length of real-time fluorescence quantitative PCR
1.3.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
取對數生長期 MG-63 細胞，常規消化計數，以 1×104個/孔密度接種于 96 孔板中；細胞貼壁后，更換含 10%FBS 的 MEM 培養基培養 24 h 使細胞同步化。按照 1.2 分組方法轉染細胞后培養 48 h，每孔加入 CCK-8 溶液 10 μL，繼續培養 4 h 后，使用酶標儀在 450 nm 處測定各孔吸光度（A）值，計算細胞成活率=（A 值 實驗孔 – A 值 空白孔）/（A 值 正常對照孔 – A 值 空白孔）×100%；抑制率=（A 值 正常對照孔 – A 值 實驗孔）/（A 值 正常對照孔 – A 值 空白孔）×100%。
1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡
將 MG-63 細胞以 1×106個/孔密度接種于 12 孔板中，培養過夜。按照 1.2 分組方法轉染細胞后培養 24 h，棄上清，以細胞刮刀收集細胞；70% 冷乙醇固定細胞 2 h；乙醇重懸細胞后，以離心半徑 5 cm、1 500 r/min 離心 5 min；棄乙醇，PBS 洗滌 1 次，將細胞重懸于含碘化丙啶的 PBS 中，室溫避光孵育 1 h。將樣品轉移至流式管，分別于激發波長 488 nm、發射波長 610 nm 處測熒光值。分布于散點圖左下象限散點代表正常細胞，右下象限的散點代表早期凋亡細胞，右上象限的散點代表中晚期凋亡細胞，左上象限散點代表細胞碎片和壞死細胞，計算細胞凋亡率。
1.3.5 Western blot 檢測 NEU3 表達抑制后細胞凋亡相關蛋白表達
取對數生長期 MG-63 細胞，常規消化計數，以 1×105個/孔密度接種于 6 孔板中，培養過夜。按照 1.2 分組方法轉染細胞后培養 24 h，棄上清，以細胞刮刀收集細胞；以 RIPA 裂解液+蛋白酶抑制劑 4℃ 裂解，將各組細胞裂解液以 BCA 法測定蛋白濃度后，進行 SDS-PAGE 電泳。電轉蛋白至聚偏氟乙烯膜，用 5%脫脂牛奶室溫封閉 60 min，加入相應比例的一抗 Ras、Bcl-2（1∶2 000）；actin（1∶4 000）室溫孵育 2 h，TBST 洗滌；加入相對應的二抗室溫孵育 1 h，TBST 洗滌；暗室 ECL 化學發光法顯影，Image J 軟件膠片條帶分析灰度值。
1.4 統計學方法
采用 Graphpad prism 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡觀察示，NEU3 表達集中在 MG-63 細胞的細胞質中。見圖 1。
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測
培養 24 h 后，B、C、D 組 NEU3 mRNA 相對表達量分別為 0.66±0.07、0.34±0.07、0.12±0.07，明顯低于 A 組（1.00±0.06）及 E 組（1.01±0.05），比較差異有統計學意義（P<0.05）。隨著 siRNA 濃度升高，B、C、D 組 NEU3 mRNA 相對表達量呈下降趨勢，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
培養 48 h 后，B、C、D、E 組細胞成活率分別為 44.80%±4.68%、21.85%±5.93%、15.08%±3.66%、80.04%±2.28%，抑制率分別為 55.20%±4.68%、78.15%±5.93%、84.92%±3.66%、19.96%±2.28%；隨 NEU3 siRNA 濃度升高，MG-63 細胞抑制率顯著升高，成活率顯著降低，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡
培養 24 h 后，A、B、C、D、E 組細胞凋亡率分別為 3.23%±0.06%、12.57%±0.64%、4.63%±0.52%、2.89%±0.72%、10.55%±0.87%。B、C、D 組與 A 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；與 E 組比較，C、D 組細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），B、E 組間差異無統計學意義（P>0.05）。隨 siRNA 濃度增加，B、C、D 組細胞凋亡率呈下降趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
2.5 Western blot 檢測細胞 Ras 和 Bcl-2 蛋白表達
培養 24 h，隨 NEU3 siRNA 濃度升高，Ras 蛋白和 Bcl-2 蛋白的表達逐漸降低。與 A 組和 E 組比較，B、C 組 Ras 和 Bcl-2 蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）；而 D 組以上蛋白表達均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
3 討論
當前國內外公認的骨肉瘤治療模式為術前新輔助化療+腫瘤手術切除+術后輔助化療，輔以介入治療、冷熱消融治療、分子靶向治療等[13]。目前骨肉瘤的分子靶向治療焦點主要集中于埃茲蛋白、表皮生長因子受體 2，但骨肉瘤患者長期生存率并未明顯提高[14]。因此，探索新的與骨肉瘤發病和轉移相關的分子機制及信號轉導途徑，從而提供可能更為有效的骨肉瘤治療靶點，以提高患者長期生存率，具有重要臨床意義。
研究表明 NEU3 在多種腫瘤中表達上調，其表達水平與腫瘤惡性程度成正相關，且其可能導致跨膜信號轉導的紊亂[15]。然而 NEU3 參與腫瘤發生發展的具體分子機制尚待明確。NEU3 可能通過多種機制參與腫瘤的發生發展：一方面，可能通過其 NEU 活性改變腫瘤細胞表面唾液酸修飾狀態，從而改變腫瘤細胞活性；另一方面，其作為信號轉導中間蛋白，參與和腫瘤發生發展相關的信號通路[16]。本研究通過 RNA 干擾的方式降低 NEU3 在骨肉瘤細胞 MG-63 中的表達，發現 NEU3 表達下降后，MG-63 細胞成活率顯著降低、凋亡率顯著升高，且與 NEU3 表達量相關。說明 NEU3 在 MG-63 細胞中的表達量與該細胞的生存具有緊密聯系。然而，本研究僅為體外實驗，確認 NEU3 在骨肉瘤發生發展中的具體作用，仍需要結合體內實驗進一步研究。NEU3 在 MG-63 細胞生存的促進作用，究竟是通過其 NEU 活性，還是參與腫瘤發生發展信號通路來發揮的，仍然有待進一步探索。
Ras 基因與 Bcl-2 基因是腫瘤研究中兩個重要基因。當原癌基因 Ras 異常活化時，Ras 蛋白持續處于活化狀態進而激活下游信號通路，使細胞無限增殖而引起腫瘤 [17-18]；而 Bcl-2 基因家族表達的凋亡抑制蛋白可通過抑制凋亡信號，從而阻礙細胞凋亡的激活，使腫瘤發生[19-20]。本研究結果發現，NEU3 的表達對原癌基因 Ras 蛋白以及凋亡抑制蛋白 Bcl-2 的影響只在 100 nmol/L NEU3 siRNA 處理時與正常對照組有顯著性區別，提示 NEU3 對 MG-63 的抑制有可能與其他信號通路有關。
綜上述，本實驗研究結果表明，通過抑制 NEU3 的表達可以抑制骨肉瘤 MG-63 細胞的增殖、增加其凋亡。提示若能找到一種穩定、安全、可靠地降低 NEU3 表達的方法，就可以抑制骨肉瘤細胞的增殖，進一步實現誘導人骨肉瘤細胞凋亡的目的，為骨肉瘤治療帶來新的方法。
圖1
免疫熒光染色觀察 NEU3 在 MG-63 細胞中的表達（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為 NEU3、DAPI 及兩者疊加
Figure1. NEU3 expression in MG-63 cells via immunofluorescence staining (Fluorescent microscope×400)From left to right for NEU3, DAPI, and merge
圖2
流式細胞儀檢測各組 MG-63 細胞凋亡情況
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure2. The apoptosis of MG-63 cells in different groups detected by flow cytometrya. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
圖3
Western blot 檢測各組 Ras 和 Bcl-2 蛋白表達
a. 電泳圖 1：B 組 2：C 組 3：D 組 4：E 組 5：A 組；b. 各組 Ras 蛋白相對表達量；c. 各組 Bcl-2 蛋白相對表達量
Figure3. Protein expressions of Ras and Bcl-2 in different groups detected by Western blota. Electrophorogram 1: Group B 2: Group C 3: Group D 4: Group E 5: Group A; b. Relative expression of Ras protein in different groups; c. Relative expression of Bcl-2 protein in different groups
糖基化異常是腫瘤細胞特異性特征之一，唾液酸是廣泛存在于生物體內的一類九碳糖類化合物[1-2]。在惡性轉化過程中，唾液酸化改變被認為與腫瘤細胞轉移和侵襲力密切相關。惡性腫瘤細胞表面常呈現糖蛋白唾液酸化程度升高[3-4]。機體內控制唾液酸水平的代謝關鍵酶是唾液酸酶（neuraminidase，NEU）和唾液酸糖基轉移酶，其中 NEU 是一種糖苷酶，能催化去除糖蛋白和糖酯末端的唾液酸殘基[5]。在哺乳動物體內，目前已鑒定并克隆出 4 種 NEU，根據其一級結構、定位、底物特性和酶學特性分為 NEU1、NEU2、NEU3 和 NEU4[6]，其中 NEU3 僅特異性水解神經節苷酯，幾乎不作用于其他底物；人源性 NEU3 在細胞膜和膜性細胞器上均有表達，并且在生長刺激下可以遷移濃聚[7]。一系列研究表明 NEU 活性與細胞分化、細胞增殖以及細胞黏附侵襲均密切相關，且 NEU3 是在腫瘤發生過程中唯一上調的 NEU[8-10]。
骨肉瘤是常見的骨原發性惡性腫瘤之一，好發于青少年，其惡性程度較高、預后較差。由于缺少有效的早期診斷方法，骨肉瘤確診時大多已為晚期，手術切除的預后并不理想。已有研究發現細胞質 NEU2 可抑制 FBJ 病毒誘導的小鼠骨肉瘤 FBJ-LL 細胞生長[11]。Sandhu 等[12]發現骨肉瘤及其他骨形成腫瘤患者血清唾液酸含量明顯增高，提示骨肉瘤的發生發展可能與唾液酸相關。本研究應用 RNA 干擾（RNA interfering，RNAi）技術，降低骨肉瘤 MG-63 細胞中 NEU3 基因的表達，并檢測此條件下 MG-63 細胞增殖和凋亡的情況，以分析 NEU3 在骨肉瘤 MG-63 細胞增殖和凋亡過程中的作用，以期為骨肉瘤治療提供可能的治療靶點和新思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
骨肉瘤 MG-63 細胞由四川大學基礎醫學與法醫學院孫曉東博士贈送。MEM 培養基、FBS、青霉素-鏈霉素雙抗（HyClone 公司，美國）；0.25% EDTA-胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；RNAi 試劑 genOFFTM st-h-NEU3（廣州銳博生物科技有限公司）；Bcl-2 抗兔多克隆抗體、Ras 抗兔多克隆抗體、β-actin 抗鼠單克隆抗體（成都正能生物技術有限責任公司）；NEU3 抗羊多克隆抗體（Santa Cruz 公司，美國）；脂質體轉染試劑盒 Lipofectamine 3000、驢抗山羊二抗（Thermo Fisher 公司，美國）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；抗熒光淬滅封片液（上海碧云天生物技術有限公司）；PrimeScript RT Reagent Kit 逆轉錄試劑盒（Takara 公司，日本）；DNA 酶（Thermo Scientific 公司，美國）；SYBR Select Master Mix（Applied Biosystems 公司，美國）；TrizolTM（Ambion 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；DOJINDO 公司，日本）。流式細胞儀（MILLOPORE 公司，美國）；酶標儀（Bio-Rad 公司，美國）；熒光定量 PCR 儀（Thermo Scientific 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
取 MG-63 細胞置于含 10%FBS 的 MEM 培養基中，于 37℃、5%CO2 條件下常規培養。待細胞貼壁，呈上皮細胞樣后，取對數生長期 MG-63 細胞，根據處理方法不同分為 5 組： 正常對照組（A 組），不作任何處理； 30、50、100 nmol/L NEU3 RNA 干擾組（分別為 B、C、D 組），分別以濃度為 30、50、100 nmol/L 的 NEU3 小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染細胞；陰性對照組（E 組），使用不同種屬陰性對照 siRNA （小鼠 actin siRNA，50 nmol/L）轉染細胞。轉染后細胞培養 24 h 或 48 h 后用于后續實驗檢測。
1.3 觀測指標
1.3.1 免疫熒光染色觀察
將 MG-63 細胞接種于 24 孔板圓形防脫玻璃蓋玻片上，培養 24 h，棄上清；室溫下多聚甲醛固定 30 min 后，0.1%PBS-Tween 溶液（PBST）洗 3 次；0.1%皂苷溶液室溫通透 15 min；1%牛血清白蛋白+3%山羊血清 PBST 溶液室溫封閉 1 h；NEU3 一抗（1∶100）4℃ 孵育過夜，DyLight680 山羊抗鼠二抗（1∶500）室溫避光 孵育1 h；DAPI 溶液（15 μg/mL）室溫避光孵育 15 min。用抗熒光淬滅封片劑封片后，熒光顯微鏡下觀察 MG-63 細胞中 NEU3 的表達情況。
1.3.2 實時熒光定量 PCR 檢測 NEU3 mRNA 表達水平
將 MG-63 細胞接種于 12 孔板后，按照 1.2 分組方法進行細胞轉染。24 h 后，各組取 3 孔細胞，以 Trizol 提取總 RNA，檢測 RNA 質量，并記錄濃度。使用 DNA 酶 37℃ 消化處理基因組 DNA 30 min，加入 1 μL 50 mmol/L EDTA 65℃ 滅活 10 min。然后使用逆轉錄試劑盒合成 cDNA，反應條件為：37℃、15 min，85℃、5 s。以此 cDNA 為模板進行 PCR，引物序列見表 1。PCR 反應條件：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、1 min，40 個循環。以 GAPDH 作為內參基因，使用 2–ΔΔCt法計算各組中 NEU3 mRNA 相對表達量。
表1
引物序列及擴增片段長度
Table1.
Primer sequence and amplification section length of real-time fluorescence quantitative PCR
1.3.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
取對數生長期 MG-63 細胞，常規消化計數，以 1×104個/孔密度接種于 96 孔板中；細胞貼壁后，更換含 10%FBS 的 MEM 培養基培養 24 h 使細胞同步化。按照 1.2 分組方法轉染細胞后培養 48 h，每孔加入 CCK-8 溶液 10 μL，繼續培養 4 h 后，使用酶標儀在 450 nm 處測定各孔吸光度（A）值，計算細胞成活率=（A 值 實驗孔 – A 值 空白孔）/（A 值 正常對照孔 – A 值 空白孔）×100%；抑制率=（A 值 正常對照孔 – A 值 實驗孔）/（A 值 正常對照孔 – A 值 空白孔）×100%。
1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡
將 MG-63 細胞以 1×106個/孔密度接種于 12 孔板中，培養過夜。按照 1.2 分組方法轉染細胞后培養 24 h，棄上清，以細胞刮刀收集細胞；70% 冷乙醇固定細胞 2 h；乙醇重懸細胞后，以離心半徑 5 cm、1 500 r/min 離心 5 min；棄乙醇，PBS 洗滌 1 次，將細胞重懸于含碘化丙啶的 PBS 中，室溫避光孵育 1 h。將樣品轉移至流式管，分別于激發波長 488 nm、發射波長 610 nm 處測熒光值。分布于散點圖左下象限散點代表正常細胞，右下象限的散點代表早期凋亡細胞，右上象限的散點代表中晚期凋亡細胞，左上象限散點代表細胞碎片和壞死細胞，計算細胞凋亡率。
1.3.5 Western blot 檢測 NEU3 表達抑制后細胞凋亡相關蛋白表達
取對數生長期 MG-63 細胞，常規消化計數，以 1×105個/孔密度接種于 6 孔板中，培養過夜。按照 1.2 分組方法轉染細胞后培養 24 h，棄上清，以細胞刮刀收集細胞；以 RIPA 裂解液+蛋白酶抑制劑 4℃ 裂解，將各組細胞裂解液以 BCA 法測定蛋白濃度后，進行 SDS-PAGE 電泳。電轉蛋白至聚偏氟乙烯膜，用 5%脫脂牛奶室溫封閉 60 min，加入相應比例的一抗 Ras、Bcl-2（1∶2 000）；actin（1∶4 000）室溫孵育 2 h，TBST 洗滌；加入相對應的二抗室溫孵育 1 h，TBST 洗滌；暗室 ECL 化學發光法顯影，Image J 軟件膠片條帶分析灰度值。
1.4 統計學方法
采用 Graphpad prism 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 免疫熒光染色觀察
熒光顯微鏡觀察示，NEU3 表達集中在 MG-63 細胞的細胞質中。見圖 1。
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測
培養 24 h 后，B、C、D 組 NEU3 mRNA 相對表達量分別為 0.66±0.07、0.34±0.07、0.12±0.07，明顯低于 A 組（1.00±0.06）及 E 組（1.01±0.05），比較差異有統計學意義（P<0.05）。隨著 siRNA 濃度升高，B、C、D 組 NEU3 mRNA 相對表達量呈下降趨勢，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
培養 48 h 后，B、C、D、E 組細胞成活率分別為 44.80%±4.68%、21.85%±5.93%、15.08%±3.66%、80.04%±2.28%，抑制率分別為 55.20%±4.68%、78.15%±5.93%、84.92%±3.66%、19.96%±2.28%；隨 NEU3 siRNA 濃度升高，MG-63 細胞抑制率顯著升高，成活率顯著降低，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡
培養 24 h 后，A、B、C、D、E 組細胞凋亡率分別為 3.23%±0.06%、12.57%±0.64%、4.63%±0.52%、2.89%±0.72%、10.55%±0.87%。B、C、D 組與 A 組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；與 E 組比較，C、D 組細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），B、E 組間差異無統計學意義（P>0.05）。隨 siRNA 濃度增加，B、C、D 組細胞凋亡率呈下降趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
2.5 Western blot 檢測細胞 Ras 和 Bcl-2 蛋白表達
培養 24 h，隨 NEU3 siRNA 濃度升高，Ras 蛋白和 Bcl-2 蛋白的表達逐漸降低。與 A 組和 E 組比較，B、C 組 Ras 和 Bcl-2 蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）；而 D 組以上蛋白表達均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
3 討論
當前國內外公認的骨肉瘤治療模式為術前新輔助化療+腫瘤手術切除+術后輔助化療，輔以介入治療、冷熱消融治療、分子靶向治療等[13]。目前骨肉瘤的分子靶向治療焦點主要集中于埃茲蛋白、表皮生長因子受體 2，但骨肉瘤患者長期生存率并未明顯提高[14]。因此，探索新的與骨肉瘤發病和轉移相關的分子機制及信號轉導途徑，從而提供可能更為有效的骨肉瘤治療靶點，以提高患者長期生存率，具有重要臨床意義。
研究表明 NEU3 在多種腫瘤中表達上調，其表達水平與腫瘤惡性程度成正相關，且其可能導致跨膜信號轉導的紊亂[15]。然而 NEU3 參與腫瘤發生發展的具體分子機制尚待明確。NEU3 可能通過多種機制參與腫瘤的發生發展：一方面，可能通過其 NEU 活性改變腫瘤細胞表面唾液酸修飾狀態，從而改變腫瘤細胞活性；另一方面，其作為信號轉導中間蛋白，參與和腫瘤發生發展相關的信號通路[16]。本研究通過 RNA 干擾的方式降低 NEU3 在骨肉瘤細胞 MG-63 中的表達，發現 NEU3 表達下降后，MG-63 細胞成活率顯著降低、凋亡率顯著升高，且與 NEU3 表達量相關。說明 NEU3 在 MG-63 細胞中的表達量與該細胞的生存具有緊密聯系。然而，本研究僅為體外實驗，確認 NEU3 在骨肉瘤發生發展中的具體作用，仍需要結合體內實驗進一步研究。NEU3 在 MG-63 細胞生存的促進作用，究竟是通過其 NEU 活性，還是參與腫瘤發生發展信號通路來發揮的，仍然有待進一步探索。
Ras 基因與 Bcl-2 基因是腫瘤研究中兩個重要基因。當原癌基因 Ras 異常活化時，Ras 蛋白持續處于活化狀態進而激活下游信號通路，使細胞無限增殖而引起腫瘤 [17-18]；而 Bcl-2 基因家族表達的凋亡抑制蛋白可通過抑制凋亡信號，從而阻礙細胞凋亡的激活，使腫瘤發生[19-20]。本研究結果發現，NEU3 的表達對原癌基因 Ras 蛋白以及凋亡抑制蛋白 Bcl-2 的影響只在 100 nmol/L NEU3 siRNA 處理時與正常對照組有顯著性區別，提示 NEU3 對 MG-63 的抑制有可能與其他信號通路有關。
綜上述，本實驗研究結果表明，通過抑制 NEU3 的表達可以抑制骨肉瘤 MG-63 細胞的增殖、增加其凋亡。提示若能找到一種穩定、安全、可靠地降低 NEU3 表達的方法，就可以抑制骨肉瘤細胞的增殖，進一步實現誘導人骨肉瘤細胞凋亡的目的，為骨肉瘤治療帶來新的方法。
圖1
免疫熒光染色觀察 NEU3 在 MG-63 細胞中的表達（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為 NEU3、DAPI 及兩者疊加
Figure1. NEU3 expression in MG-63 cells via immunofluorescence staining (Fluorescent microscope×400)From left to right for NEU3, DAPI, and merge
圖2
流式細胞儀檢測各組 MG-63 細胞凋亡情況
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure2. The apoptosis of MG-63 cells in different groups detected by flow cytometrya. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
圖3
Western blot 檢測各組 Ras 和 Bcl-2 蛋白表達
a. 電泳圖 1：B 組 2：C 組 3：D 組 4：E 組 5：A 組；b. 各組 Ras 蛋白相對表達量；c. 各組 Bcl-2 蛋白相對表達量
Figure3. Protein expressions of Ras and Bcl-2 in different groups detected by Western blota. Electrophorogram 1: Group B 2: Group C 3: Group D 4: Group E 5: Group A; b. Relative expression of Ras protein in different groups; c. Relative expression of Bcl-2 protein in different groups
