引用本文： 胡承浩, 李東宇, 龐宗超, 李惠斌, 東野玉輝, 吳佳妮. 封閉式負壓引流技術治療糖尿病足對創面組織中 TGF-β1 及其受體表達的影響研究 . 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(8): 1061-1065. doi: 10.7507/1002-1892.201802024 復制
糖尿病足是下肢遠端神經異常和周圍血管病變導致的足潰瘍、感染和/或深層組織破壞，外周動脈阻塞性病變及潰瘍周圍皮膚微循環障礙造成的肢體缺血缺氧是潰瘍難愈合的主要因素[1-3]。臨床常用的封閉式負壓引流技術（vaccum sealing drainage，VSD）可縮短潰瘍創面愈合時間，但其促進創面愈合的分子機制尚未明確。研究發現 TGF-β1 與創面愈合有密切聯系[4]，組織損傷后損傷部位的血小板釋放 TGF-β1，經細胞外基質激活后，其強烈的趨化作用使各種炎性細胞聚集并分泌大量炎性介質，引起炎性反應，誘導成纖維細胞遷移并大量增殖，最終形成結締組織[5-6]。另外，釋放的 TGF-β1 還可以通過刺激血小板衍化生長因子和 VEGF 的分泌，進而刺激創面肉芽組織生長[7]。TGF-β 各型受體中，與 TGF-β1 結合能力最強的是其Ⅱ型受體（type Ⅱ of TGF-β-receptor，TβRⅡ）[8]。本研究擬通過觀察 VSD 治療糖尿病足后潰瘍創面組織中 TGF-β1 及 TβRⅡ表達的變化，探討 VSD 促進創面愈合的機制。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① 2012 年 5 月—2016 年 5 月入院治療的糖尿病足患者，既往或本次住院期間診斷為糖尿病[9]，擬行手術治療；② 潰瘍創面無骨組織外露；③ 肢體無大范圍壞死及血管危象；④ 無其他系統嚴重并發癥，無貧血及重度低蛋白血癥[10]。排除標準：① 創面未愈合而中斷治療方案者；② 伴有嚴重器官病變者，如心臟、腎臟病變。2012 年 5 月—2016 年 5 月共 80 例糖尿病足患者符合選擇標準納入研究，采用隨機區組法分為兩組，每組 40 例。VSD 組給予 VSD 治療，對照組給予外用油紗換藥治療。本研究經臨沂市人民醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。
1.2 一般資料
VSD 組：男 28 例，女 12 例；年齡 42～68 歲，平均 54.3 歲。病程 35～69 d，平均 50.2 d。體質量 57～71 kg，平均 63.1 kg。足部潰瘍面積 16.5～49.0 cm2，平均 28.0 cm2。糖尿病足 Wagner 分級：Ⅱ級 26 例，Ⅲ級 14 例。對照組：男 24 例，女 16 例；年齡 42～71 歲，平均 55.1 歲。病程 30～62 d，平均 47.6 d。體質量 53～72 kg，平均 64.3 kg。足部潰瘍面積 15～43 cm2，平均 26.8 cm2。糖尿病足 Wagner 分級：Ⅱ級 20 例，Ⅲ級 20 例。兩組患者性別、年齡、病程、體質量、潰瘍面積以及 Wagner 分級比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.3 治療方法
1.3.1 基礎治療
兩組患者入院后均給予飲食控制、營養支持治療，糾正低蛋白血癥；部分身體狀況較差伴嚴重營養不良者，給予白蛋白、能量合劑及懸浮紅細胞靜脈滴注治療。對于經飲食控制后血糖仍控制不理想者，皮下注射胰島素，控制血糖≤11.1 mmol/L。創面合并感染時，首先經驗性給予廣譜抗菌藥物治療，然后根據創面分泌物培養及藥敏檢測結果，更換為敏感抗菌藥物。
1.3.2 創面處理
入院后兩組患者均行手術徹底清創，清創后切取大小為 4 mm×3 mm×2 mm 創面組織，石蠟包埋備檢。VSD 組：清創后以油紗紗布覆蓋創面，外用負壓吸引泡沫敷料封閉創面，間歇負壓吸引治療，以 7 d 為 1 個治療周期。1 個治療周期結束后，拆除泡沫敷料，觀察潰瘍創面肉芽組織生長情況，并在局麻下切取大小為 4 mm×3 mm×2 mm 創面組織備檢。待創面肉芽組織生長旺盛、鮮紅平整、顆粒致密、分泌物少、觸之易出血、無組織水腫后，行清創植皮術，封閉創面；若創面肉芽組織顆粒稀疏、分泌物較多，再次行 VSD 治療，直至達植皮術標準。對照組：清創后油紗紗布覆蓋創面，外加多層紗布包扎固定，每隔 7 d 換藥 1 次，首次換藥時在局麻下切取大小為 4 mm×3 mm×2 mm 創面組織備檢。待創面肉芽組織生長旺盛、鮮紅平整、顆粒致密、分泌物少、觸之易出血、無組織水腫后，行清創植皮術。
1.4 觀測指標
記錄創基準備時間（即入院后開始創面處理至創面肉芽組織生長旺盛、顆粒致密適合植皮術時間）及患者住院時間。取治療前及治療后 7 d 時采集的創面組織，參照常規方法處理切片后行免疫組織化學染色，采用 Q550cw 型顯微鏡（Leica 公司，德國）及其圖像分析系統，觀察組織中 TGF-β1 或 TβRⅡ表達情況，陽性染色為棕黃色顆粒，呈現于細胞膜、細胞質或細胞核內。400 倍鏡下，每張切片選取 5 個 TGF-β1 及 TβRⅡ陽性細胞最密集區域，測定區域內（3 500 μm2）陽性、陰性細胞數，分別計算 TGF-β1、TβRⅡ陽性細胞染色指數，即 TGF-β1、TβRⅡ陽性細胞數分別與總細胞數的比值，作為組織切片中 TGF-β1、TβRⅡ表達陽性指數。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
VSD 組患者經 1～3 次 VSD 治療后行植皮術，平均 2 次；創基準備時間為（13.7±4.8）d，住院時間為（25.7±5.4）d。對照組患者經 1～6 次換藥后行植皮術，平均 4 次；創基準備時間為（35.4±5.3）d，住院時間為（46.7±5.0）d。VSD 組患者創基準備時間及住院時間均較對照組明顯縮短，比較差異有統計學意義（t=–13.546，P=0.036；t=–12.931，P=0.041）。兩組植皮均順利成活，創面愈合良好。見圖 1。
免疫組織化學染色示：治療前 TGF-β1 陽性顆粒主要存在于表皮細胞、汗腺及毛囊細胞中，而真皮成纖維細胞中表達很少，可見少量 TβRⅡ陽性顆粒存在于表皮細胞中。VSD 組 TGF-β1、TβRⅡ表達陽性指數分別為 5.3±2.4、14.0±2.6，對照組分別為 4.4±2.3、14.7±3.1，比較差異無統計學意義（t=1.137，P=0.263；t=1.231，P=0.409）。治療 7 d 后，VSD 組組織中 TGF-β1 陽性顆粒主要存在于成纖維細胞、血管內皮細胞和表皮基底層細胞中，TβRⅡ陽性顆粒主要存在于成纖維細胞、角質形成細胞和小血管內皮細胞中。對照組 TGF-β1 陽性顆粒主要存在于表皮細胞、汗腺及毛囊細胞中，成纖維細胞中表達較少；TβRⅡ陽性顆粒主要存在于表皮細胞中。VSD 組 TGF-β1、TβRⅡ表達陽性指數分別為 34.3±2.9、41.7±3.7，對照組分別為 5.8±2.0、18.1±2.5，VSD 組均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（t=–35.615，P=0.003；t=23.725，P=0.002）。見圖 2。
圖1
VSD 組患者，男，46 歲，糖尿病足（Wagner 分級Ⅱ級）
a. 治療前；b. VSD 治療 7 d；c. VSD 治療 14 d；d. 植皮術后 7 d
Figure1. A 46-year-old male patient with diabetic foot (Wagner gradeⅡ) in VSD groupa. Before treatment; b. At 7 days after VSD treatment; c. At 14 days after VSD treatment; d. At 7 days after skin grafting
圖2
兩組免疫組織化學染色觀察（×400）
a、b. VSD 組治療前后 TGF-β1 表達； c、d. 對照組治療前后 TGF-β1 表達；e、f. VSD 組治療前后 TβRⅡ表達；g、h. 對照組治療前后 TβRⅡ表達
Figure2. Immunohistochemical staining of 2 groups (×400)a, b. Expressions of TGF-β1 in VSD group at pre- and post-treatment; c, d. Expressions of TGF-β1 in control group at pre- and post-treatment; e, f. Expressions of TβRⅡ in VSD group at pre- and post-treatment; g, h. Expressions of TβRⅡ in control group at pre- and post-treatment
3 討論
目前，VSD 已廣泛用于治療燒傷、褥瘡、糖尿病足及經久不愈的創面潰瘍等難愈性創面[11-12]。負壓治療已納入糖尿病足治療國際指南[13]，但治療時需注意兩個原則，徹底清創和保證創面血運。本研究結果表明，經 VSD 治療后糖尿病足創面肉芽組織生長優于對照組，創基準備時間以及住院時間均明顯縮短，免疫組織化學染色觀察示治療后 7 d 組織中 TGF-β1 和 TβRⅡ表達陽性指數顯著高于對照組。結合相關文獻，我們分析有以下三方面原因：① VSD 可維持創面濕度平衡，為創面提供良好的愈合環境，并通過平衡透明質酸的代謝促進慢性創面的愈合[14]；② 負壓有利于維持創面清潔的內環境，改善創面微循環，減輕組織水腫，加速創面肉芽組織生長[15]；③ VSD 能全方位引流去除創區壞死滲出物，減少機體組織對毒性產物的重吸收，并利用可控負壓清除毒性分解產物，重建局部血液循環，刺激組織新生，從而促進機體的新陳代謝過程[16]。
創面愈合過程是一個生長因子和細胞因子相互作用的復雜過程[17]，我們通過免疫組織化學染色觀察了治療前后創面組織中 TGF-β1 及 TβRⅡ的變化。結果顯示，治療前兩組患者 TGF-β1、TβRⅡ表達陽性指數比較差異無統計學意義，但治療 7 d 后 VSD 組以上兩指標均顯著高于對照組，提示 VSD 處理可增加損傷部位組織中 TGF-β1 及 TβRⅡ的表達，進而促進創面肉芽組織生長，使創面愈合速度加快。有研究表明，只要有效地刺激 TGF-β 傳導通路中的信號轉導，就有可能使 TGF-β 改變或增強其生物學作用，促進創面愈合。VSD 治療創面是否使細胞中 TGF-β1 及 TβRⅡ的親和力發生改變，以及在 TGF-β 傳導通路中 Smads 蛋白家族在其中所扮演的角色，目前尚不清楚，這將是我們下一步研究方向。
糖尿病足是下肢遠端神經異常和周圍血管病變導致的足潰瘍、感染和/或深層組織破壞，外周動脈阻塞性病變及潰瘍周圍皮膚微循環障礙造成的肢體缺血缺氧是潰瘍難愈合的主要因素[1-3]。臨床常用的封閉式負壓引流技術（vaccum sealing drainage，VSD）可縮短潰瘍創面愈合時間，但其促進創面愈合的分子機制尚未明確。研究發現 TGF-β1 與創面愈合有密切聯系[4]，組織損傷后損傷部位的血小板釋放 TGF-β1，經細胞外基質激活后，其強烈的趨化作用使各種炎性細胞聚集并分泌大量炎性介質，引起炎性反應，誘導成纖維細胞遷移并大量增殖，最終形成結締組織[5-6]。另外，釋放的 TGF-β1 還可以通過刺激血小板衍化生長因子和 VEGF 的分泌，進而刺激創面肉芽組織生長[7]。TGF-β 各型受體中，與 TGF-β1 結合能力最強的是其Ⅱ型受體（type Ⅱ of TGF-β-receptor，TβRⅡ）[8]。本研究擬通過觀察 VSD 治療糖尿病足后潰瘍創面組織中 TGF-β1 及 TβRⅡ表達的變化，探討 VSD 促進創面愈合的機制。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① 2012 年 5 月—2016 年 5 月入院治療的糖尿病足患者，既往或本次住院期間診斷為糖尿病[9]，擬行手術治療；② 潰瘍創面無骨組織外露；③ 肢體無大范圍壞死及血管危象；④ 無其他系統嚴重并發癥，無貧血及重度低蛋白血癥[10]。排除標準：① 創面未愈合而中斷治療方案者；② 伴有嚴重器官病變者，如心臟、腎臟病變。2012 年 5 月—2016 年 5 月共 80 例糖尿病足患者符合選擇標準納入研究，采用隨機區組法分為兩組，每組 40 例。VSD 組給予 VSD 治療，對照組給予外用油紗換藥治療。本研究經臨沂市人民醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。
1.2 一般資料
VSD 組：男 28 例，女 12 例；年齡 42～68 歲，平均 54.3 歲。病程 35～69 d，平均 50.2 d。體質量 57～71 kg，平均 63.1 kg。足部潰瘍面積 16.5～49.0 cm2，平均 28.0 cm2。糖尿病足 Wagner 分級：Ⅱ級 26 例，Ⅲ級 14 例。對照組：男 24 例，女 16 例；年齡 42～71 歲，平均 55.1 歲。病程 30～62 d，平均 47.6 d。體質量 53～72 kg，平均 64.3 kg。足部潰瘍面積 15～43 cm2，平均 26.8 cm2。糖尿病足 Wagner 分級：Ⅱ級 20 例，Ⅲ級 20 例。兩組患者性別、年齡、病程、體質量、潰瘍面積以及 Wagner 分級比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.3 治療方法
1.3.1 基礎治療
兩組患者入院后均給予飲食控制、營養支持治療，糾正低蛋白血癥；部分身體狀況較差伴嚴重營養不良者，給予白蛋白、能量合劑及懸浮紅細胞靜脈滴注治療。對于經飲食控制后血糖仍控制不理想者，皮下注射胰島素，控制血糖≤11.1 mmol/L。創面合并感染時，首先經驗性給予廣譜抗菌藥物治療，然后根據創面分泌物培養及藥敏檢測結果，更換為敏感抗菌藥物。
1.3.2 創面處理
入院后兩組患者均行手術徹底清創，清創后切取大小為 4 mm×3 mm×2 mm 創面組織，石蠟包埋備檢。VSD 組：清創后以油紗紗布覆蓋創面，外用負壓吸引泡沫敷料封閉創面，間歇負壓吸引治療，以 7 d 為 1 個治療周期。1 個治療周期結束后，拆除泡沫敷料，觀察潰瘍創面肉芽組織生長情況，并在局麻下切取大小為 4 mm×3 mm×2 mm 創面組織備檢。待創面肉芽組織生長旺盛、鮮紅平整、顆粒致密、分泌物少、觸之易出血、無組織水腫后，行清創植皮術，封閉創面；若創面肉芽組織顆粒稀疏、分泌物較多，再次行 VSD 治療，直至達植皮術標準。對照組：清創后油紗紗布覆蓋創面，外加多層紗布包扎固定，每隔 7 d 換藥 1 次，首次換藥時在局麻下切取大小為 4 mm×3 mm×2 mm 創面組織備檢。待創面肉芽組織生長旺盛、鮮紅平整、顆粒致密、分泌物少、觸之易出血、無組織水腫后，行清創植皮術。
1.4 觀測指標
記錄創基準備時間（即入院后開始創面處理至創面肉芽組織生長旺盛、顆粒致密適合植皮術時間）及患者住院時間。取治療前及治療后 7 d 時采集的創面組織，參照常規方法處理切片后行免疫組織化學染色，采用 Q550cw 型顯微鏡（Leica 公司，德國）及其圖像分析系統，觀察組織中 TGF-β1 或 TβRⅡ表達情況，陽性染色為棕黃色顆粒，呈現于細胞膜、細胞質或細胞核內。400 倍鏡下，每張切片選取 5 個 TGF-β1 及 TβRⅡ陽性細胞最密集區域，測定區域內（3 500 μm2）陽性、陰性細胞數，分別計算 TGF-β1、TβRⅡ陽性細胞染色指數，即 TGF-β1、TβRⅡ陽性細胞數分別與總細胞數的比值，作為組織切片中 TGF-β1、TβRⅡ表達陽性指數。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
VSD 組患者經 1～3 次 VSD 治療后行植皮術，平均 2 次；創基準備時間為（13.7±4.8）d，住院時間為（25.7±5.4）d。對照組患者經 1～6 次換藥后行植皮術，平均 4 次；創基準備時間為（35.4±5.3）d，住院時間為（46.7±5.0）d。VSD 組患者創基準備時間及住院時間均較對照組明顯縮短，比較差異有統計學意義（t=–13.546，P=0.036；t=–12.931，P=0.041）。兩組植皮均順利成活，創面愈合良好。見圖 1。
免疫組織化學染色示：治療前 TGF-β1 陽性顆粒主要存在于表皮細胞、汗腺及毛囊細胞中，而真皮成纖維細胞中表達很少，可見少量 TβRⅡ陽性顆粒存在于表皮細胞中。VSD 組 TGF-β1、TβRⅡ表達陽性指數分別為 5.3±2.4、14.0±2.6，對照組分別為 4.4±2.3、14.7±3.1，比較差異無統計學意義（t=1.137，P=0.263；t=1.231，P=0.409）。治療 7 d 后，VSD 組組織中 TGF-β1 陽性顆粒主要存在于成纖維細胞、血管內皮細胞和表皮基底層細胞中，TβRⅡ陽性顆粒主要存在于成纖維細胞、角質形成細胞和小血管內皮細胞中。對照組 TGF-β1 陽性顆粒主要存在于表皮細胞、汗腺及毛囊細胞中，成纖維細胞中表達較少；TβRⅡ陽性顆粒主要存在于表皮細胞中。VSD 組 TGF-β1、TβRⅡ表達陽性指數分別為 34.3±2.9、41.7±3.7，對照組分別為 5.8±2.0、18.1±2.5，VSD 組均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（t=–35.615，P=0.003；t=23.725，P=0.002）。見圖 2。
圖1
VSD 組患者，男，46 歲，糖尿病足（Wagner 分級Ⅱ級）
a. 治療前；b. VSD 治療 7 d；c. VSD 治療 14 d；d. 植皮術后 7 d
Figure1. A 46-year-old male patient with diabetic foot (Wagner gradeⅡ) in VSD groupa. Before treatment; b. At 7 days after VSD treatment; c. At 14 days after VSD treatment; d. At 7 days after skin grafting
圖2
兩組免疫組織化學染色觀察（×400）
a、b. VSD 組治療前后 TGF-β1 表達； c、d. 對照組治療前后 TGF-β1 表達；e、f. VSD 組治療前后 TβRⅡ表達；g、h. 對照組治療前后 TβRⅡ表達
Figure2. Immunohistochemical staining of 2 groups (×400)a, b. Expressions of TGF-β1 in VSD group at pre- and post-treatment; c, d. Expressions of TGF-β1 in control group at pre- and post-treatment; e, f. Expressions of TβRⅡ in VSD group at pre- and post-treatment; g, h. Expressions of TβRⅡ in control group at pre- and post-treatment
3 討論
目前，VSD 已廣泛用于治療燒傷、褥瘡、糖尿病足及經久不愈的創面潰瘍等難愈性創面[11-12]。負壓治療已納入糖尿病足治療國際指南[13]，但治療時需注意兩個原則，徹底清創和保證創面血運。本研究結果表明，經 VSD 治療后糖尿病足創面肉芽組織生長優于對照組，創基準備時間以及住院時間均明顯縮短，免疫組織化學染色觀察示治療后 7 d 組織中 TGF-β1 和 TβRⅡ表達陽性指數顯著高于對照組。結合相關文獻，我們分析有以下三方面原因：① VSD 可維持創面濕度平衡，為創面提供良好的愈合環境，并通過平衡透明質酸的代謝促進慢性創面的愈合[14]；② 負壓有利于維持創面清潔的內環境，改善創面微循環，減輕組織水腫，加速創面肉芽組織生長[15]；③ VSD 能全方位引流去除創區壞死滲出物，減少機體組織對毒性產物的重吸收，并利用可控負壓清除毒性分解產物，重建局部血液循環，刺激組織新生，從而促進機體的新陳代謝過程[16]。
創面愈合過程是一個生長因子和細胞因子相互作用的復雜過程[17]，我們通過免疫組織化學染色觀察了治療前后創面組織中 TGF-β1 及 TβRⅡ的變化。結果顯示，治療前兩組患者 TGF-β1、TβRⅡ表達陽性指數比較差異無統計學意義，但治療 7 d 后 VSD 組以上兩指標均顯著高于對照組，提示 VSD 處理可增加損傷部位組織中 TGF-β1 及 TβRⅡ的表達，進而促進創面肉芽組織生長，使創面愈合速度加快。有研究表明，只要有效地刺激 TGF-β 傳導通路中的信號轉導，就有可能使 TGF-β 改變或增強其生物學作用，促進創面愈合。VSD 治療創面是否使細胞中 TGF-β1 及 TβRⅡ的親和力發生改變，以及在 TGF-β 傳導通路中 Smads 蛋白家族在其中所扮演的角色，目前尚不清楚，這將是我們下一步研究方向。
