引用本文： 何穎, 鄒立津, 高蔓蔓, 梁堂釗, 鄒學農. 體外長期培養的豬 BMSCs 發生轉化過程中基因表達譜和 DNA 甲基化譜關聯分析. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(8): 1066-1073. doi: 10.7507/1002-1892.201801037 復制
BMSCs 具有自我更新、增殖及多向分化的潛能，在體外可被誘導分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪和神經等組織細胞，還能進行遺傳修飾，成為再生醫學、組織工程和基因治療領域研究的熱點。BMSCs 體內應用的一個重要前提是體外安全和高效的擴增。BMSCs 經過體外長期培養，其生物學特性的改變和安全性值得關注[1]。研究發現 BMSCs 在體外長期培養后會自發惡性轉化[2-8]，且 BMSCs 參與了腫瘤的形成[9-13]，然而其分子機制并不是很清楚。為了深入探討 BMSCs 自發惡性轉化的表觀遺傳學作用機制，本研究利用 DNA 甲基化芯片和全基因組表達譜芯片技術，分析 BMSCs 轉化過程中 DNA 甲基化譜和基因表達譜的改變，并通過聯合分析探討 DNA 甲基化的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3 月齡雌性長白豬 6 頭，體質量約 50 kg；4～6 周齡雄性 NOD/SCID 小鼠 20 只，體質量 15～25 g；均由丹麥奧胡斯大學實驗動物中心提供。
1.077 g/mL Ficoll-Paque Plus 分離液（Amersham 公司，美國）；DMEM 培養液（GIBCO 公司，英國）；FBS（Bio Whittaker Europe 公司，比利時）；胰蛋白酶、EDTA（Sigma 公司，美國）；Trizol 試劑、DNase Ⅰ（Invitrogen 公司，英國）；ND-1000 分光光度儀（Nanodrop 公司，美國）；QIAamp DNA mini Kit（DNA 提取試劑盒；Qiagen 公司，德國）；安捷倫豬表達譜基因芯片（Agilent Pig 4x44K Gene Expression Microarray，表示 44 000 個探針）、定制的家豬甲基化芯片（包括 22 017 個基因啟動子）（上海康成生物工程有限公司設計）。塑料培養瓶、板（Nunc 公司，丹麥）；玻片式細胞培養皿（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）。倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；熒光顯微鏡（ Zeiss 公司，德國）；Agilent Scanner G2505B 掃描儀（Agilent 公司，美國）；GeneSpring GX v11.5.1 軟件包（Agilent Technologies 公司，美國）；NimbleScan v2.5 軟件（Roche-NimbleGen 公司，瑞士）。Agilent Array 平臺（上海康成生物工程有限公司設計訂購）。
1.2 BMSCs 分離培養
收集長白豬脛骨近端 15 mL 骨髓置于肝素化試管內，取 6 mL 骨髓分裝于含 4 mL Ficoll-Paque Plus 分離液的離心管內，室溫下以 400×g 離心 30 min；收集中間層有核細胞，PBS 稀釋后以 100×g 離心 10 min，共 2 次，懸于 DMEM 培養液中并計數。將 1×107 個細胞接種于 75 cm2 塑料培養瓶中，加入 12 mL 含 10% 經滅活處理的 FBS 的 DMEM 培養液，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養；3 d 后更換培養液，棄去未貼壁細胞；隨后每隔 3～4 d 換液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。待接近融合時，吸去培養液，PBS 沖洗后，用 0.125% 胰蛋白酶-5 mmol/L EDTA 于 37℃ 消化 4 min，以 400×g 離心 10 min，棄上清液，進行傳代培養，倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.3 正常 BMSCs 與惡性轉化的 BMSCs 生物學特性觀察
1.3.1 核型分析
分別把第 4 代和第 30 代約 2×105 個細胞種植到玻片式細胞培養皿上，第 2 天更換細胞培養液為含秋水仙酰胺（終濃度 10 ng/mL）的 DMEM 培養液培養約 50 min；然后，細胞直接在玻片式細胞培養皿中按照下列步驟進行固定：① 用不含鈣鎂離子的 PBS 沖洗細胞；② 細胞在 60 mmol/L KCl 溶液中低滲 20 min；③ 濃度梯度固定細胞，依次在 17%、38%、58% 和 100% 醋酸∶乙醇（1∶3）固定液中分別固定 5、5、5、40 min。染色體使用 0.1 μg/μL DAPI 進行染色 10 min，顯微鏡下觀察。
1.3.2 雙層軟瓊脂克隆形成實驗
將 DMEM（2×）培養液與 1.2% 瓊脂 1∶1 混合后，作為下層瓊脂鋪于 24 孔板，室溫凝固后 37℃ 平衡備用。分別將第 2 代與第 25 代 BMSCs 以 500 個/孔密度接種于含 0.6% 瓊脂的 DMEM 培養基中，鋪于下層瓊脂上。每組設計 3 個平行孔，培養 21 d 后進行 Mayers 蘇木素染色，光鏡觀察克隆形成。此外進行鈣黃綠素/乙錠均二聚物-1（calcein-AM/ethidium homodimer-1，calcein-AM/EthD-1）熒光雙染，熒光顯微鏡下觀察克隆細胞活/死細胞情況。
1.3.3 血清依賴性實驗
分別將第 2 代和第 25 代 BMSCs 以 2×105個/孔密度接種于含 10%FBS 的 DMEM 培養基的 24 孔板中，每代 3 個平行孔；24 h 后棄去原培養基，以 PBS 洗滌 2 次后加入含 0.1%FBS 的 DMEM 培養基，培養 10 d 后進行錐蟲藍染色并用 Bürker-Türk 血球計數板進行計數。
1.3.4 小鼠體內致瘤實驗
將含 2×106個第 24 代 BMSCs 的 Matrigel 膠注入 NOD/SCID 小鼠皮下，8 周后處死，組織取出后切片，常規 HE 染色觀察。
1.4 基因表達譜檢測
采用 Trizol 提取分別來自 6 頭長白豬的第 2 代和第 25 代 BMSCs 的總 RNA，使用 NanoDrop ND-1000 分光光度儀檢測總 RNA 量，用瓊脂糖電泳驗證完整性。使用 Agilent Array 平臺檢測基因表達譜。將 1 μg 總 RNA 擴增轉錄成熒光 cRNA，再與安捷倫豬表達譜基因芯片雜交。使用 Agilent Scanner G2505B 掃描儀掃描，結果使用 GeneSpring GX v11.5.1 軟件包進行分析。
1.5 DNA 甲基化芯片分析
取第 2 代和第 25 代 BMSCs，采用定制的家豬甲基化芯片（包括 22 017 個基因啟動子）按步驟依次進行雜交、洗片、掃描與分析操作，甲基化數據導入 NimbleScan v2.5 軟件進行分析。
1.6 統計學方法
兩組間差異基因表達比較采用 t 檢驗，如果表達相差 2 倍及以上且有統計學意義，則認為該基因表達有顯著差異，篩選出差異表達基因，采用 KEGG 數據庫進行通路分析。采用 MEDME （modeling experimentaldata with MeDIP enrichment）篩選出組間差異性甲基化區域（組間比較采用 t 檢驗）。篩選出轉化 BMSCs 基因啟動子區甲基化程度升高和降低的基因個數，進一步采用 GoMiner 數據庫行基因本體（gene ontology，GO）分析。DNA 異常甲基化基因與表達譜關聯分析采用 Pearson 相關性檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 正常 BMSCs 與惡性轉化的 BMSCs 生物學特性觀察
2.1.1 體外生長特征改變
第 1 代 BMSCs 細胞形態為較大的紡錘形，隨傳代次數增加，細胞形態逐漸變化為小的梭形。倍增時間由原代的（1.08±0.03）d 延長到第 4 代的（8.67±4.27）d，從 12 代開始又逐漸下降到（2.39±0.45）d。培養至 25 代累積細胞群體倍增值（將各代倍增時間累加）達（105.73±11.06）d。見圖 1、2。
2.1.2 核型分析
第 4 代 BMSCs 染色體數為 38 條，第 30 代 BMSCs 全部表現為三倍體，共 57 條染色體。見圖 3。
2.1.3 雙層軟瓊脂克隆形成實驗
第 2 代 BMSCs 在軟瓊脂上基本不形成或形成很少的細胞克隆，而第 25 代 BMSCs 形成大量大小不一的細胞克隆。見圖 4、5。
2.1.4 血清依賴性實驗
當生長在低血清（0.1%FBS）DMEM 培養液下，第 25 代 BMSCs 的細胞活性為 71.6%±10.9%，而第 2 代 BMSCs 細胞活性只有 5.2%±2.1%。
2.1.5 小鼠體內致瘤實驗
注射 8 周小鼠背部有包塊形成，取組織行 HE 染色示淋巴細胞、漿細胞中可見散在分布的大體積細胞，其細胞質豐富、嗜酸性，細胞核形態多樣，呈多角形或分葉狀，并可見核分裂象。見圖 6。
2.2 基因表達譜檢測
全基因表達譜芯片篩選出 BMSCs 轉化過程中上調表達的 257 條基因（信號比倍數>2，P<0.05）和下調表達的 315 條基因（信號比倍數<0.5，P<0.05），信號通路分析發現部分細胞周期相關基因表達上調，部分細胞外基質受體相互作用（ECM-receptor interaction）、黏著斑通路（focal adhesion）、肌動蛋白細胞骨架調節（regulation of actin cytoskeleton）、癌癥通路（pathways in cancer）、P53 等通路相關基因表達下調。見圖 7。此外，BMSCs 自發轉化后，在干細胞的自我更新、多向分化潛能等生物學特性中扮演重要角色的 Hedgehog、Wnt、TGF-β/BMPs 等信號轉導通路上的若干基因的表達譜發生了變化，提示這些信號轉導通路可能在 BMSCs 自發轉化中起到重要作用。見圖 8。
2.3 DNA 甲基化芯片分析
轉化 BMSCs 基因啟動子區甲基化程度升高的基因有 962 個，其中 383 個屬于高密度 CpG 啟動子區（high CpG density promoters，HCP），262 個屬于中等密度 CpG 啟動子區（intermediate CpG density promoters，ICP），317 個屬于低密度 CpG 啟動子區（low CpG density promoters，LCP）。基因啟動子區甲基化程度降低的基因有 1 219 個，其中 661 個屬于 HCP，320 個屬于 ICP，238 個屬于 LCP。我們進一步對其生物過程進行分析，發現 DNA 甲基化的改變主要參與細胞代謝、增殖分化、細胞結構、炎性免疫、腫瘤發生等生物過程。見圖 9。
采用 DNA 甲基化芯片和基因芯片聯合分析 BMSCs 經長期培養后受甲基化調控的基因，即表達譜基因下調表達的與 DNA 甲基化相關的基因，和表達譜基因上調表達的與 DNA 去甲基化相關的基因進行整合，結果發現，35 個基因的甲基化改變與表達變化方向相反（r=–0.686，P=0.000）；其中 21 個基因啟動子區甲基化程度升高而基因表達下降，14 個基因啟動子區甲基化程度下降而基因表達升高。KEGG 分析發現 CDKN3、Cyclinb2、CDK1、CDK4、runx1t1、cdk2ap1 等表達異常改變參與了細胞周期的調控。此外，在 14 條甲基化下調而表達上調的基因中，很多具有調節腫瘤發生與免疫炎性相互平衡的作用，與上述有關的基因主要有 ACTC1、actin-α1、CDKN3、B2M 等。其中 CDKN3 啟動子區甲基化狀態改變，可能與細胞腫瘤化密切相關。見圖 10。
圖1
各代次 BMSCs 倍增時間
Figure1.
Doubling time of each generation of BMSCs
圖2
各代次 BMSCs 形態學觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 第 4 代；b. 第 12 代；c. 第 25 代
Figure2. Morphology observation of each generation of BMSCs (Inverted microscope×100)a. The fourth generation; b. The twelfth generation; c. The twenty-fifth generation
圖3
BMSCs 核型分析（×400）
a. 第 4 代；b. 第 30 代
Figure3. Karyotype analysis of BMSCs (×400)a. The fourth generation; b. The thirtieth generation
圖4
第 25 代細胞雙層軟瓊脂克隆形成實驗光鏡觀察（×25）
Figure4.
Optical microscope observation of cloning formation experiment on the double layer soft agar of the twenty- fifth generation cells (×25)
圖5
Calcein-AM/EthD-1 熒光雙染觀察克隆細胞活/死細胞情況
a. 第 2 代細胞（熒光顯微鏡×200）；b. 第 25 代細胞（熒光顯微鏡×20）；c. 第 25 代細胞其中 1 個細胞克隆（熒光顯微鏡×100）
Figure5. Cloned cell live/death observation by calcein-AM/EthD-1 fluorescence double staininga. The second generation cells (Fluorescence microscope×200); b. The twenty-fifth generation cells (Fluorescence microscope×20); c. One cell clone in twenty-fifth generation cells (Fluorescence microscope×100)
圖6
小鼠背部皮下注射第 24 代 BMSCs 后 8 周 HE 染色觀察a. ×25；b. ×100
Figure6.
HE staining observation at 8 weeks after subcutaneous injection of twenty-fourth generation BMSCs on the back of mice
a. ×25; b. ×100
圖7
細胞周期信號通路
Figure7.
Cell cycle signal pathway
圖8
Hedgehog/Wnt/TGF-β 信號轉導通路
Figure8.
Hedgehog/Wnt/TGF-β/signaling pathway
圖9
DNA 甲基化芯片掃描 GO 分析
Figure9.
GO analysis of differentially methylated genes expression
圖10
P53/RB-E2F 信號通路
Figure10.
P53/RB-E2F signaling pathway
3 討論
本研究中長白豬 BMSCs 在體外長期培養下，逐漸表現出轉化細胞的特性：對培養液中血清依賴程度顯著降低，能夠在雙層軟瓊脂培養基中錨著獨立生長并形成細胞集落，并且植入裸鼠皮下形成腫瘤組織，這一現象表明 BMSCs 獲得了腫瘤的生物學特性。目前，一般認為 BMSCs 惡性轉化與染色體的不穩定性有關[2, 6, 9-10, 14]。研究表明，P53、CDKN2 丟失[8, 14]，c-Myc 高表達[6]與 BMSCs 惡性轉化關系密切。最近研究表明免疫相關蛋白 P62 通過 Ras 通路參與人 BMSCs 的惡性轉化[15]。Rubio 等[16]采用基因芯片分析發現，BMSC 自發惡性轉化與癌基因、抑癌基因、線粒體代謝活性、DNA 損傷-修復相關蛋白及細胞周期調控因子變化有關。腫瘤相關信號通路的異常參與了體外培養的 BMSCs 的轉化[17]。國內高蕓等[18]研究也發現，Wnt、SonicHed-gehog、Notch、TGF-β/BMPs 等信號轉導通路上的若干基因在大鼠 BMSCs 自發惡性轉化中起到重要作用。然而，越來越多研究表明，異常的 DNA 甲基化為腫瘤發生的早期變化，與多種腫瘤的發生、發展密切相關。Teng 等[19]最近研究表明，靶向 2 個腫瘤抑制基因 HIC1 和 RassF1A 甲基化能將 BMSCs 轉化為腫瘤起源細胞，進一步提示甲基化在腫瘤啟動中起重要作用。這些研究僅集中在普遍接受的特異性定向分化的基因，沒有在整個基因組水平進行全面掃描，導致遺漏一些受 DNA 甲基化調控的非常規分化相關基因。而且，結合基因表達譜芯片和 DNA 甲基化芯片，在 BMSCs 轉化過程中，啟動子受 DNA 甲基化調控的差異表達的基因表達譜，及是否存在一系列受甲基化調控的 BMSCs 轉化的關鍵調節因子，目前還不清楚。有關 BMSCs 轉化的表達譜研究很多[16-18]。Choi 等[20]比較了早期 BMSCs 和晚期衰老 BMSCs 甲基化水平，發現甲基化水平存在明顯差異，并發現與 DNA 復制、細胞周期及過氧化物酶體增殖物活化受體信號通路相關基因的高甲基化，可能是導致 BMSCs 衰老的重要原因。通過高通量全基因組聯合高通量甲基化研究，可以更細節性地捕捉到關鍵基因或者是信號轉導通路，對細胞轉化發生機制的研究有極大幫助。本研究首次應用定制的家豬啟動子區 CpG 島甲基化芯片研究 BMSCs 自發轉化中的甲基化狀態，并聯合全基因組表達譜結果找出與 DNA 甲基化狀態相關的差異表達甲基化情況，將有利于探討整個表觀遺傳的改變。
本研究甲基化芯片實驗結果發現，BMSCs 自發轉化后受甲基化調控的基因主要參與細胞代謝、增殖分化、細胞結構、炎性免疫、腫瘤發生等生物過程。聯合分析 BMSCs 轉化過程受甲基化調控的基因，發現參與調控細胞周期的基因 CDKN3、Cyclinb2、CDK1、CDK4、runx1t1、cdk2ap1 等表達異常改變，其中 CDKN3 啟動子區甲基化狀態改變，可能與細胞腫瘤化密切相關。CDKN3 是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子中的一種，作為細胞周期蛋白依賴性激酶的負調節蛋白，是細胞周期調控網絡中的重要一環。在正常的細胞周期中，CDKN3 主要是作為 CDK2 的抑制因子，在 G1～S 期與 CDK2 穩定結合，來參與細胞周期的調節，阻滯細胞周期。CDK2 充分活化需要 Thr160 的磷酸化和 Tyr15、Thr14 的去磷酸化，而 pThr160 的去磷酸化是 CDK2 失活的關鍵。CDKN3 通過其 C-末端螺旋與 CDK2 C-末端的葉狀結構域結合，促使 CDK2 T 環處的 pThr160 區域伸展暴露，完成去磷酸化。CDKN3 被證實在多種人類惡性腫瘤中表達異常，深入研究 CDKN3 及其甲基化作用機制，將為進一步揭示 BMSCs 惡性轉化發生、發展的表觀遺傳學機制提供理論依據，為 BMSCs 臨床應用預警和防止轉化提供新線索。
BMSCs 具有自我更新、增殖及多向分化的潛能，在體外可被誘導分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪和神經等組織細胞，還能進行遺傳修飾，成為再生醫學、組織工程和基因治療領域研究的熱點。BMSCs 體內應用的一個重要前提是體外安全和高效的擴增。BMSCs 經過體外長期培養，其生物學特性的改變和安全性值得關注[1]。研究發現 BMSCs 在體外長期培養后會自發惡性轉化[2-8]，且 BMSCs 參與了腫瘤的形成[9-13]，然而其分子機制并不是很清楚。為了深入探討 BMSCs 自發惡性轉化的表觀遺傳學作用機制，本研究利用 DNA 甲基化芯片和全基因組表達譜芯片技術，分析 BMSCs 轉化過程中 DNA 甲基化譜和基因表達譜的改變，并通過聯合分析探討 DNA 甲基化的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3 月齡雌性長白豬 6 頭，體質量約 50 kg；4～6 周齡雄性 NOD/SCID 小鼠 20 只，體質量 15～25 g；均由丹麥奧胡斯大學實驗動物中心提供。
1.077 g/mL Ficoll-Paque Plus 分離液（Amersham 公司，美國）；DMEM 培養液（GIBCO 公司，英國）；FBS（Bio Whittaker Europe 公司，比利時）；胰蛋白酶、EDTA（Sigma 公司，美國）；Trizol 試劑、DNase Ⅰ（Invitrogen 公司，英國）；ND-1000 分光光度儀（Nanodrop 公司，美國）；QIAamp DNA mini Kit（DNA 提取試劑盒；Qiagen 公司，德國）；安捷倫豬表達譜基因芯片（Agilent Pig 4x44K Gene Expression Microarray，表示 44 000 個探針）、定制的家豬甲基化芯片（包括 22 017 個基因啟動子）（上海康成生物工程有限公司設計）。塑料培養瓶、板（Nunc 公司，丹麥）；玻片式細胞培養皿（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）。倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；熒光顯微鏡（ Zeiss 公司，德國）；Agilent Scanner G2505B 掃描儀（Agilent 公司，美國）；GeneSpring GX v11.5.1 軟件包（Agilent Technologies 公司，美國）；NimbleScan v2.5 軟件（Roche-NimbleGen 公司，瑞士）。Agilent Array 平臺（上海康成生物工程有限公司設計訂購）。
1.2 BMSCs 分離培養
收集長白豬脛骨近端 15 mL 骨髓置于肝素化試管內，取 6 mL 骨髓分裝于含 4 mL Ficoll-Paque Plus 分離液的離心管內，室溫下以 400×g 離心 30 min；收集中間層有核細胞，PBS 稀釋后以 100×g 離心 10 min，共 2 次，懸于 DMEM 培養液中并計數。將 1×107 個細胞接種于 75 cm2 塑料培養瓶中，加入 12 mL 含 10% 經滅活處理的 FBS 的 DMEM 培養液，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養；3 d 后更換培養液，棄去未貼壁細胞；隨后每隔 3～4 d 換液，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。待接近融合時，吸去培養液，PBS 沖洗后，用 0.125% 胰蛋白酶-5 mmol/L EDTA 于 37℃ 消化 4 min，以 400×g 離心 10 min，棄上清液，進行傳代培養，倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.3 正常 BMSCs 與惡性轉化的 BMSCs 生物學特性觀察
1.3.1 核型分析
分別把第 4 代和第 30 代約 2×105 個細胞種植到玻片式細胞培養皿上，第 2 天更換細胞培養液為含秋水仙酰胺（終濃度 10 ng/mL）的 DMEM 培養液培養約 50 min；然后，細胞直接在玻片式細胞培養皿中按照下列步驟進行固定：① 用不含鈣鎂離子的 PBS 沖洗細胞；② 細胞在 60 mmol/L KCl 溶液中低滲 20 min；③ 濃度梯度固定細胞，依次在 17%、38%、58% 和 100% 醋酸∶乙醇（1∶3）固定液中分別固定 5、5、5、40 min。染色體使用 0.1 μg/μL DAPI 進行染色 10 min，顯微鏡下觀察。
1.3.2 雙層軟瓊脂克隆形成實驗
將 DMEM（2×）培養液與 1.2% 瓊脂 1∶1 混合后，作為下層瓊脂鋪于 24 孔板，室溫凝固后 37℃ 平衡備用。分別將第 2 代與第 25 代 BMSCs 以 500 個/孔密度接種于含 0.6% 瓊脂的 DMEM 培養基中，鋪于下層瓊脂上。每組設計 3 個平行孔，培養 21 d 后進行 Mayers 蘇木素染色，光鏡觀察克隆形成。此外進行鈣黃綠素/乙錠均二聚物-1（calcein-AM/ethidium homodimer-1，calcein-AM/EthD-1）熒光雙染，熒光顯微鏡下觀察克隆細胞活/死細胞情況。
1.3.3 血清依賴性實驗
分別將第 2 代和第 25 代 BMSCs 以 2×105個/孔密度接種于含 10%FBS 的 DMEM 培養基的 24 孔板中，每代 3 個平行孔；24 h 后棄去原培養基，以 PBS 洗滌 2 次后加入含 0.1%FBS 的 DMEM 培養基，培養 10 d 后進行錐蟲藍染色并用 Bürker-Türk 血球計數板進行計數。
1.3.4 小鼠體內致瘤實驗
將含 2×106個第 24 代 BMSCs 的 Matrigel 膠注入 NOD/SCID 小鼠皮下，8 周后處死，組織取出后切片，常規 HE 染色觀察。
1.4 基因表達譜檢測
采用 Trizol 提取分別來自 6 頭長白豬的第 2 代和第 25 代 BMSCs 的總 RNA，使用 NanoDrop ND-1000 分光光度儀檢測總 RNA 量，用瓊脂糖電泳驗證完整性。使用 Agilent Array 平臺檢測基因表達譜。將 1 μg 總 RNA 擴增轉錄成熒光 cRNA，再與安捷倫豬表達譜基因芯片雜交。使用 Agilent Scanner G2505B 掃描儀掃描，結果使用 GeneSpring GX v11.5.1 軟件包進行分析。
1.5 DNA 甲基化芯片分析
取第 2 代和第 25 代 BMSCs，采用定制的家豬甲基化芯片（包括 22 017 個基因啟動子）按步驟依次進行雜交、洗片、掃描與分析操作，甲基化數據導入 NimbleScan v2.5 軟件進行分析。
1.6 統計學方法
兩組間差異基因表達比較采用 t 檢驗，如果表達相差 2 倍及以上且有統計學意義，則認為該基因表達有顯著差異，篩選出差異表達基因，采用 KEGG 數據庫進行通路分析。采用 MEDME （modeling experimentaldata with MeDIP enrichment）篩選出組間差異性甲基化區域（組間比較采用 t 檢驗）。篩選出轉化 BMSCs 基因啟動子區甲基化程度升高和降低的基因個數，進一步采用 GoMiner 數據庫行基因本體（gene ontology，GO）分析。DNA 異常甲基化基因與表達譜關聯分析采用 Pearson 相關性檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 正常 BMSCs 與惡性轉化的 BMSCs 生物學特性觀察
2.1.1 體外生長特征改變
第 1 代 BMSCs 細胞形態為較大的紡錘形，隨傳代次數增加，細胞形態逐漸變化為小的梭形。倍增時間由原代的（1.08±0.03）d 延長到第 4 代的（8.67±4.27）d，從 12 代開始又逐漸下降到（2.39±0.45）d。培養至 25 代累積細胞群體倍增值（將各代倍增時間累加）達（105.73±11.06）d。見圖 1、2。
2.1.2 核型分析
第 4 代 BMSCs 染色體數為 38 條，第 30 代 BMSCs 全部表現為三倍體，共 57 條染色體。見圖 3。
2.1.3 雙層軟瓊脂克隆形成實驗
第 2 代 BMSCs 在軟瓊脂上基本不形成或形成很少的細胞克隆，而第 25 代 BMSCs 形成大量大小不一的細胞克隆。見圖 4、5。
2.1.4 血清依賴性實驗
當生長在低血清（0.1%FBS）DMEM 培養液下，第 25 代 BMSCs 的細胞活性為 71.6%±10.9%，而第 2 代 BMSCs 細胞活性只有 5.2%±2.1%。
2.1.5 小鼠體內致瘤實驗
注射 8 周小鼠背部有包塊形成，取組織行 HE 染色示淋巴細胞、漿細胞中可見散在分布的大體積細胞，其細胞質豐富、嗜酸性，細胞核形態多樣，呈多角形或分葉狀，并可見核分裂象。見圖 6。
2.2 基因表達譜檢測
全基因表達譜芯片篩選出 BMSCs 轉化過程中上調表達的 257 條基因（信號比倍數>2，P<0.05）和下調表達的 315 條基因（信號比倍數<0.5，P<0.05），信號通路分析發現部分細胞周期相關基因表達上調，部分細胞外基質受體相互作用（ECM-receptor interaction）、黏著斑通路（focal adhesion）、肌動蛋白細胞骨架調節（regulation of actin cytoskeleton）、癌癥通路（pathways in cancer）、P53 等通路相關基因表達下調。見圖 7。此外，BMSCs 自發轉化后，在干細胞的自我更新、多向分化潛能等生物學特性中扮演重要角色的 Hedgehog、Wnt、TGF-β/BMPs 等信號轉導通路上的若干基因的表達譜發生了變化，提示這些信號轉導通路可能在 BMSCs 自發轉化中起到重要作用。見圖 8。
2.3 DNA 甲基化芯片分析
轉化 BMSCs 基因啟動子區甲基化程度升高的基因有 962 個，其中 383 個屬于高密度 CpG 啟動子區（high CpG density promoters，HCP），262 個屬于中等密度 CpG 啟動子區（intermediate CpG density promoters，ICP），317 個屬于低密度 CpG 啟動子區（low CpG density promoters，LCP）。基因啟動子區甲基化程度降低的基因有 1 219 個，其中 661 個屬于 HCP，320 個屬于 ICP，238 個屬于 LCP。我們進一步對其生物過程進行分析，發現 DNA 甲基化的改變主要參與細胞代謝、增殖分化、細胞結構、炎性免疫、腫瘤發生等生物過程。見圖 9。
采用 DNA 甲基化芯片和基因芯片聯合分析 BMSCs 經長期培養后受甲基化調控的基因，即表達譜基因下調表達的與 DNA 甲基化相關的基因，和表達譜基因上調表達的與 DNA 去甲基化相關的基因進行整合，結果發現，35 個基因的甲基化改變與表達變化方向相反（r=–0.686，P=0.000）；其中 21 個基因啟動子區甲基化程度升高而基因表達下降，14 個基因啟動子區甲基化程度下降而基因表達升高。KEGG 分析發現 CDKN3、Cyclinb2、CDK1、CDK4、runx1t1、cdk2ap1 等表達異常改變參與了細胞周期的調控。此外，在 14 條甲基化下調而表達上調的基因中，很多具有調節腫瘤發生與免疫炎性相互平衡的作用，與上述有關的基因主要有 ACTC1、actin-α1、CDKN3、B2M 等。其中 CDKN3 啟動子區甲基化狀態改變，可能與細胞腫瘤化密切相關。見圖 10。
圖1
各代次 BMSCs 倍增時間
Figure1.
Doubling time of each generation of BMSCs
圖2
各代次 BMSCs 形態學觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 第 4 代；b. 第 12 代；c. 第 25 代
Figure2. Morphology observation of each generation of BMSCs (Inverted microscope×100)a. The fourth generation; b. The twelfth generation; c. The twenty-fifth generation
圖3
BMSCs 核型分析（×400）
a. 第 4 代；b. 第 30 代
Figure3. Karyotype analysis of BMSCs (×400)a. The fourth generation; b. The thirtieth generation
圖4
第 25 代細胞雙層軟瓊脂克隆形成實驗光鏡觀察（×25）
Figure4.
Optical microscope observation of cloning formation experiment on the double layer soft agar of the twenty- fifth generation cells (×25)
圖5
Calcein-AM/EthD-1 熒光雙染觀察克隆細胞活/死細胞情況
a. 第 2 代細胞（熒光顯微鏡×200）；b. 第 25 代細胞（熒光顯微鏡×20）；c. 第 25 代細胞其中 1 個細胞克隆（熒光顯微鏡×100）
Figure5. Cloned cell live/death observation by calcein-AM/EthD-1 fluorescence double staininga. The second generation cells (Fluorescence microscope×200); b. The twenty-fifth generation cells (Fluorescence microscope×20); c. One cell clone in twenty-fifth generation cells (Fluorescence microscope×100)
圖6
小鼠背部皮下注射第 24 代 BMSCs 后 8 周 HE 染色觀察a. ×25；b. ×100
Figure6.
HE staining observation at 8 weeks after subcutaneous injection of twenty-fourth generation BMSCs on the back of mice
a. ×25; b. ×100
圖7
細胞周期信號通路
Figure7.
Cell cycle signal pathway
圖8
Hedgehog/Wnt/TGF-β 信號轉導通路
Figure8.
Hedgehog/Wnt/TGF-β/signaling pathway
圖9
DNA 甲基化芯片掃描 GO 分析
Figure9.
GO analysis of differentially methylated genes expression
圖10
P53/RB-E2F 信號通路
Figure10.
P53/RB-E2F signaling pathway
3 討論
本研究中長白豬 BMSCs 在體外長期培養下，逐漸表現出轉化細胞的特性：對培養液中血清依賴程度顯著降低，能夠在雙層軟瓊脂培養基中錨著獨立生長并形成細胞集落，并且植入裸鼠皮下形成腫瘤組織，這一現象表明 BMSCs 獲得了腫瘤的生物學特性。目前，一般認為 BMSCs 惡性轉化與染色體的不穩定性有關[2, 6, 9-10, 14]。研究表明，P53、CDKN2 丟失[8, 14]，c-Myc 高表達[6]與 BMSCs 惡性轉化關系密切。最近研究表明免疫相關蛋白 P62 通過 Ras 通路參與人 BMSCs 的惡性轉化[15]。Rubio 等[16]采用基因芯片分析發現，BMSC 自發惡性轉化與癌基因、抑癌基因、線粒體代謝活性、DNA 損傷-修復相關蛋白及細胞周期調控因子變化有關。腫瘤相關信號通路的異常參與了體外培養的 BMSCs 的轉化[17]。國內高蕓等[18]研究也發現，Wnt、SonicHed-gehog、Notch、TGF-β/BMPs 等信號轉導通路上的若干基因在大鼠 BMSCs 自發惡性轉化中起到重要作用。然而，越來越多研究表明，異常的 DNA 甲基化為腫瘤發生的早期變化，與多種腫瘤的發生、發展密切相關。Teng 等[19]最近研究表明，靶向 2 個腫瘤抑制基因 HIC1 和 RassF1A 甲基化能將 BMSCs 轉化為腫瘤起源細胞，進一步提示甲基化在腫瘤啟動中起重要作用。這些研究僅集中在普遍接受的特異性定向分化的基因，沒有在整個基因組水平進行全面掃描，導致遺漏一些受 DNA 甲基化調控的非常規分化相關基因。而且，結合基因表達譜芯片和 DNA 甲基化芯片，在 BMSCs 轉化過程中，啟動子受 DNA 甲基化調控的差異表達的基因表達譜，及是否存在一系列受甲基化調控的 BMSCs 轉化的關鍵調節因子，目前還不清楚。有關 BMSCs 轉化的表達譜研究很多[16-18]。Choi 等[20]比較了早期 BMSCs 和晚期衰老 BMSCs 甲基化水平，發現甲基化水平存在明顯差異，并發現與 DNA 復制、細胞周期及過氧化物酶體增殖物活化受體信號通路相關基因的高甲基化，可能是導致 BMSCs 衰老的重要原因。通過高通量全基因組聯合高通量甲基化研究，可以更細節性地捕捉到關鍵基因或者是信號轉導通路，對細胞轉化發生機制的研究有極大幫助。本研究首次應用定制的家豬啟動子區 CpG 島甲基化芯片研究 BMSCs 自發轉化中的甲基化狀態，并聯合全基因組表達譜結果找出與 DNA 甲基化狀態相關的差異表達甲基化情況，將有利于探討整個表觀遺傳的改變。
本研究甲基化芯片實驗結果發現，BMSCs 自發轉化后受甲基化調控的基因主要參與細胞代謝、增殖分化、細胞結構、炎性免疫、腫瘤發生等生物過程。聯合分析 BMSCs 轉化過程受甲基化調控的基因，發現參與調控細胞周期的基因 CDKN3、Cyclinb2、CDK1、CDK4、runx1t1、cdk2ap1 等表達異常改變，其中 CDKN3 啟動子區甲基化狀態改變，可能與細胞腫瘤化密切相關。CDKN3 是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子中的一種，作為細胞周期蛋白依賴性激酶的負調節蛋白，是細胞周期調控網絡中的重要一環。在正常的細胞周期中，CDKN3 主要是作為 CDK2 的抑制因子，在 G1～S 期與 CDK2 穩定結合，來參與細胞周期的調節，阻滯細胞周期。CDK2 充分活化需要 Thr160 的磷酸化和 Tyr15、Thr14 的去磷酸化，而 pThr160 的去磷酸化是 CDK2 失活的關鍵。CDKN3 通過其 C-末端螺旋與 CDK2 C-末端的葉狀結構域結合，促使 CDK2 T 環處的 pThr160 區域伸展暴露，完成去磷酸化。CDKN3 被證實在多種人類惡性腫瘤中表達異常，深入研究 CDKN3 及其甲基化作用機制，將為進一步揭示 BMSCs 惡性轉化發生、發展的表觀遺傳學機制提供理論依據，為 BMSCs 臨床應用預警和防止轉化提供新線索。
