引用本文： 任憲盛, 丁巍, 楊小玉. 蝦青素對大鼠脊髓損傷后細胞凋亡的影響. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(5): 548-553. doi: 10.7507/1002-1892.201712127 復制
蝦青素是一種類胡蘿卜素，廣泛存在于生物界，是一種強效抗氧化劑，具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、預防心腦血管疾病和免疫調節作用[1-4]。近年研究表明，蝦青素能明顯減輕腦創傷、腦缺血性損傷、腦缺血再灌注損傷、帕金森綜合征、Alzheimer 綜合征等中樞神經系統損傷后的細胞凋亡，發揮神經保護作用[5-9]。但蝦青素對脊髓損傷后的細胞凋亡是否有影響尚不清楚。為此，本研究旨在觀察蝦青素對大鼠脊髓損傷后細胞凋亡的影響，同時觀察損傷脊髓組織超微結構改變及脊髓損傷大鼠的運動功能改變。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年清潔級 SD 大鼠 144 只，雌雄不限，體質量（280±20）g，由吉林大學動物實驗中心提供。蝦青素（Sigma 公司，美國），臨用前溶于橄欖油中。丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統（廈門麥克奧迪實業集團有限公司）；JEM-1200EX 透射電鏡（電子株式會社，日本）；LKB-5 型超薄切片機（LKB 公司，瑞典）。
1.2 實驗分組及方法
將 144 只 SD 大鼠按隨機數字表法分為實驗組、對照組及假手術組 3 組，每組 48 只。將大鼠以 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥并固定于鼠板手術臺上，頸背部備毛、消毒鋪巾后，以 T10 棘突為中心取背部后正中約 5 cm 長縱切口，依次切開皮膚、皮下組織，剝離椎旁肌肉，顯露棘突及椎板。咬除 T10 棘突及全椎板至椎弓根部，部分咬除 T9 和 T11 椎板擴大椎管。假手術組直接縫合切口。實驗組和對照組暴露約 20 mm 長脊髓，采用改良 Allen 法制作脊髓重物打擊損傷模型。用自制的改良 Allen 打擊裝置以致傷能量 50 g·cm（沖擊量為 5 g 重物從 10 cm 高度自由落下）造成大鼠脊髓損傷；造模成功標準：損傷處脊髓外觀出血、水腫，大鼠尾巴痙攣性擺動、雙下肢及軀體回縮撲動后，雙下肢癱；脊髓損傷造模成功后，逐層縫合切口。
術后即刻實驗組給予蝦青素（75 mg/kg[10]）灌胃，對照組和假手術組給予等量橄欖油灌胃，每日 2 次，連續灌胃至實驗結束。給予 12 h∶12 h 的白天/夜間光照周期，自由進食粉狀飼料及飲用自來水（不限飲水及進食），室溫 25～27℃，每日 3 次人工膀胱排尿，直至形成反射性膀胱。
1.3 觀測指標
1.3.1 運動功能評價
術后 1 d 及 1、2、3、4 周每組各取 6 只大鼠，進行 BBB 評分。由熟悉該評分標準的 2 名實驗人員進行雙盲法評分。
1.3.2 MDA 含量和 SOD 活性測定
術后 24 h 各組分別取 6 只大鼠麻醉后處死，取損傷段脊髓，以損傷點為中心切取脊髓組織 10 mm，稱重后制備脊髓組織勻漿。采用硫代巴比妥酸法，根據 MDA 檢測試劑盒說明方法測定 MDA 含量；采用黃嘌呤氧化酶法，根據 SOD 檢測試劑盒說明方法測定 SOD 活性。
1.3.3 細胞凋亡檢測
術后 6、24、48 h 各組分別取 6 只大鼠，麻醉后剖胸、心臟插管、灌流固定，以損傷點為中心切取脊髓組織 10 mm，修剪后石蠟包埋連續切片，片厚 5 μm，嚴格按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，光鏡下觀察。凋亡細胞在原位末端標記后呈棕黃色，每張切片隨機取 1 個高倍視野，按以下公式計算凋亡指數（apoptosis index，AI）：（凋亡細胞數/鏡下細胞總數）×100%。以上觀察由 2 名病理學專業人員根據雙盲原則統計。
1.3.4 脊髓組織水腫評價
用干濕重法測定脊髓組織含水量，評估脊髓組織水腫程度。術后 48 h 各組分別取 6 只大鼠麻醉后處死，取損傷段脊髓，以損傷點為中心低溫切取 10 mm 脊髓組織凍存，稱濕重（W）；然后于 80℃ 烤箱干燥 48 h，稱干重（D）；重復 3 次后，取均值，按以下公式計算脊髓組織含水量：［（W–D）/W］×100%，數值大小與脊髓水腫程度成正相關。
1.3.5 脊髓損傷面積測定
術后 48 h 各組分別取 6 只大鼠麻醉后處死，以損傷點為中心取損傷段脊髓，按光鏡標本制作要求分步驟進行標本處理后，25 μm 厚切片，行常規 HE 染色，采用 Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統，測量損傷處像素與脊髓橫截面總像素，計算二者的比值作為脊髓損傷面積比。
1.3.6 超微結構觀察及評分
術后 48 h 各組分別取 6 只大鼠麻醉后處死，按透射電鏡標本制作要求分步驟進行標本處理后，用 LKB-5 型超薄切片機切片，片厚 50～60 nm，用枸櫞酸鉛進行染色，JEM-1200EX 透射電鏡觀察。采用 Kaptanoglu 評分法[11]在 5 000 倍放大率下，對透射電鏡標本進行超微結構評分，每個樣本分別評估 20 個神經細胞、20 個軸突、20 個線粒體的超微結構改變，計算各組細胞質內水腫、細胞核損傷、軸突變性、髓鞘分解和線粒體損傷的評分。數值大小與脊髓損傷嚴重程度成正相關。由 2 名實驗人員進行雙盲法評分。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 運動功能評價
術后各時間點對照組和實驗組大鼠 BBB 評分均顯著低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 1～4 周實驗組大鼠 BBB 評分均顯著高于對照組，差異亦有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組大鼠 BBB 評分比較（n=6，
）
Table1.
Comparison of BBB score of rats in each group at each time point after operation (n=6,
)
2.2 MDA 含量和 SOD 活性測定
術后 24 h，假手術組、對照組、實驗組脊髓組織中 MDA 含量分別為（2.82±0.24）、（10.12±0.64）、（6.21±0.36）nmol/mg，對照組和實驗組 MDA 含量顯著高于假手術組，實驗組 MDA 含量顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。假手術組、對照組、實驗組脊髓組織中 SOD 活性分別為（35.63 ±1.76）、（17.83±1.21）、（31.56±1.46）U/mg，對照組和實驗組 SOD 活性顯著低于假手術組，實驗組 SOD 活性顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 細胞凋亡檢測
術后各時間點假手術組均未見 TUNEL 標記陽性細胞；對照組可見較多 TUNEL 標記陽性細胞，累及灰質和白質，大小不一，分布不均勻；實驗組可見較少 TUNEL 標記陽性細胞，見圖 1。術后各時間點對照組和實驗組脊髓組織中 AI 顯著高于假手術組，實驗組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表 2。
表2
術后各時間點各組 AI 比較（n=6，%，
）
Table2.
Comparison of AI of rats in each group at each time point after operation (n=6, %,
)
2.4 脊髓組織水腫評價
術后 48 h，假手術組、對照組、實驗組脊髓組織含水量分別為 55.21%±1.89%、88.11%±4.12% 和 64.84%±3.06%，對照組和實驗組脊髓組織含水量顯著高于假手術組，實驗組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.5 脊髓損傷面積測定
術后 48 h，假手術組、對照組、實驗組的脊髓損傷面積比分別為 0、0.52±0.08 和 0.28±0.05，對照組和實驗組脊髓損傷面積比顯著高于假手術組，實驗組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.6 超微結構觀察及評分
術后 48 h 透射電鏡觀察示，假手術組脊髓組織無出血、水腫，表現為正常的脊髓灰質和白質，神經細胞、膠質細胞、神經纖維、膜性細胞器、軸突及髓鞘均呈現正常的超微結構。對照組脊髓組織明顯出血、水腫；灰質內神經細胞的細胞核和胞質細胞器顯著變性；白質內有髓神經纖維出現髓鞘分裂和軸突細胞器變化；毛細血管周圍水腫，毛細血管內皮細胞呈現細胞器改變。實驗組脊髓組織內部分區域可見間質水腫和出血，但較對照組程度輕；灰質內部分神經細胞胞膜細胞器空泡化，脂褐素顆粒聚集，膠質細胞結構基本正常；白質內部分有髓神經纖維髓鞘板層部分分離，大多數神經纖維呈現正常的超微結構；部分毛細血管周圍水腫，但毛細血管內皮細胞結構正常。見圖 2。
假手術組、對照組和實驗組的超微結構評分分別為 0、8.68±0.32 和 3.12±0.16，對照組和實驗組超微結構評分顯著高于假手術組，實驗組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖1
術后 48 h 各組 TUNEL 染色觀察（×200）
a. 假手術組；b. 對照組；c. 實驗組
Figure1. TUNEL staining in each group at 48 hours after operation (×200)a. Sham group; b. Control group; c. Experimental group
圖2
術后 48 h 各組透射電鏡觀察（×5 000）
a、b. 假手術組脊髓灰質和白質；c. 對照組脊髓白質；d. 實驗組脊髓白質
Figure2. Transmission electron microscope observation at 48 hours after operation (×5 000)a, b. The gray matter and white matter of spinal cord in the sham group; c. The white matter of spinal cord in the control group; d. The white matter of spinal cord in the experimental group
3 討論
脊髓損傷分為原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷是指脊髓受到暴力破壞后，神經細胞破碎、軸索斷裂，細胞質膜破裂，內溶酶釋放致細胞直接死亡。繼發性損傷是在原發性損傷基礎上發生的多種因素參與的序列性組織自毀性破壞過程。細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是一種固有的自然生理過程，它通過清除死亡細胞和代謝產物維持人體各系統組織的穩定。大量研究已證實了細胞凋亡是繼發性脊髓損傷的重要組成部分，不管是人還是動物，繼發性損傷中出現的神經元和神經膠質細胞死亡都是繼發細胞凋亡的結果。1996 年 Li 等[12]首先證實了脊髓損傷后存在細胞凋亡，作者在壓迫性脊髓損傷模型中，運用原位末端標記法（TUNEL 法），發現于損傷后 4 h 開始損傷頭尾側脊髓白質內數量較多的陽性細胞，標記細胞高峰出現在損傷后 1 周，損傷后 3 周陽性細胞仍可見。同樣，Yong 等[13]也觀察到大鼠脊髓嚴重挫傷后誘發的細胞凋亡現象，并發現其凋亡細胞以神經元、星形細胞、少突神經膠質細胞和小膠質細胞為主。有學者對大鼠脊髓挫傷后 5 min～30 d 不同時間段進行了連續觀察研究[14]，脊髓損傷后 5 min 就出現中央損傷區，但無凋亡細胞；4 h 后損傷區內神經元中發現凋亡細胞，8 h 達到高峰。神經膠質細胞中的凋亡細胞在傷后 4 h 出現，24 h 達到高峰。損傷后 1 周內，最初的損傷區進行性擴大，并出現空洞，同時有更多神經元和神經膠質細胞相繼死亡。Liu 等[14]認為這種病理現象過程可能與殘存軸突脫髓鞘改變有關。Crowe 等[15]研究表明，中樞神經系統損傷后，細胞調亡與壞死并存，共同加重中樞神經系統的損害。本實驗結果顯示，對照組各時間點脊髓組織 AI 均顯著高于假手術組（P<0.05），表明脊髓損傷后發生了嚴重的細胞凋亡。同時，本研究發現對照組脊髓組織中 MDA 含量顯著高于假手術組（P<0.05），SOD 活性顯著低于假手術組（P<0.05），表明脊髓損傷降低了機體抗氧化酶的抗氧化能力，誘發氧自由基過度生成和嚴重的脂質過氧化。對照組脊髓組織含水量、脊髓損傷面積比及超微結構評分顯著高于假手術組（P<0.05），大鼠 BBB 評分顯著低于假手術組（P<0.05），表明脊髓損傷誘發了脊髓水腫、脊髓組織病理學損傷、超微結構損傷，以及大鼠的運動功能障礙。
蝦青素又名蝦黃質、龍蝦殼色素，是一種呈深粉紅色類胡蘿卜素，化學結構類似于 β-胡蘿卜素，也是類胡蘿卜素合成的最高級別產物。大量研究已證實蝦青素是一種具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用的強效抗氧化劑[1-2]。近期研究證實蝦青素能夠有效抑制腦損傷后的細胞凋亡，改善神經功能，發揮神經保護作用[7]。Wu 等[5]在實驗性蛛網膜下腔出血模型研究中證實，蝦青素可以激活核因子相關因子 2 和抗氧化反應元件通路，減輕氧化損傷，減輕腦水腫、血腦屏障的破壞，抑制細胞凋亡，改善神經功能，改善腦損傷。Zhang 等[6]研究發現，在大鼠蛛網膜下腔出血模型中，蝦青素可顯著升高大腦皮質中磷酸化 Akt 和 Bad 水平，顯著降低 Caspase-3 水平，減少神經元凋亡，減少腦水腫、減輕血腦屏障破壞，改善神經功能障礙，減輕繼發性腦損傷，對大鼠蛛網膜下腔出血后早期腦損傷具有保護作用。Wang 等[7]在異氟烷誘導的腦損傷模型中證實，蝦青素能顯著上調磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B 信號通路，降低 Caspase-3 活性，減少細胞凋亡，促進細胞生長，抑制異氟醚誘導的神經元凋亡。Zhang 等[8]在體外培養的星形膠質細胞牽張損傷模型中發現，蝦青素能抑制 NF-κB 核轉位，降低促炎性細胞因子的表達，抑制鈉離子、鉀離子、氯離子共轉運體的表達，降低 Bax 水平，升高 Bcl-2 水平，降低 Caspase-3 活性，減少星形膠質細胞凋亡，發揮神經保護作用。Pan 等[9]研究表明，蝦青素能夠提高大鼠腦缺血模型中機體的抗氧化能力，激活抗氧化防御通路，抑制活性氧，抑制細胞凋亡，促進神經再生，減少腦梗死體積，改善神經功能，發揮神經保護作用。本研究發現，實驗組各時間點脊髓組織細胞 AI 均顯著低于對照組（P<0.05），表明蝦青素抑制了脊髓損傷后的細胞凋亡。實驗組脊髓組織中 SOD 活性顯著高于對照組（P<0.05），MDA 含量顯著低于對照組（P<0.05），表明蝦青素增強了機體的抗氧化酶活性，抑制了脊髓損傷誘發的自由基過度生成和脂質過氧化。實驗組脊髓組織含水量、脊髓損傷面積比及超微結構評分顯著低于對照組（P<0.05），大鼠 BBB 評分顯著高于對照組（P<0.05），表明蝦青素能夠明顯減輕脊髓水腫，減輕脊髓組織病理學損傷、超微結構損傷，改善脊髓損傷大鼠的運動功能，有效地保護脊髓組織，具有明顯的神經保護作用。
綜上述，本研究結果提示了蝦青素能夠抑制脊髓損傷后的脂質過氧化，減輕脊髓損傷后的細胞凋亡，減輕脊髓水腫，減少脊髓損傷面積，減輕脊髓組織病理學損傷及超微結構損傷，促進脊髓損傷后的運動功能的恢復，有效地保護脊髓組織，具有良好的神經保護作用。本實驗為蝦青素臨床治療脊髓損傷提供了初步理論依據，但實驗組各項指標與假手術組比較差異均有統計學意義，因此蝦青素對脊髓損傷的神經保護作用仍需進一步深入研究。
蝦青素是一種類胡蘿卜素，廣泛存在于生物界，是一種強效抗氧化劑，具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、預防心腦血管疾病和免疫調節作用[1-4]。近年研究表明，蝦青素能明顯減輕腦創傷、腦缺血性損傷、腦缺血再灌注損傷、帕金森綜合征、Alzheimer 綜合征等中樞神經系統損傷后的細胞凋亡，發揮神經保護作用[5-9]。但蝦青素對脊髓損傷后的細胞凋亡是否有影響尚不清楚。為此，本研究旨在觀察蝦青素對大鼠脊髓損傷后細胞凋亡的影響，同時觀察損傷脊髓組織超微結構改變及脊髓損傷大鼠的運動功能改變。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年清潔級 SD 大鼠 144 只，雌雄不限，體質量（280±20）g，由吉林大學動物實驗中心提供。蝦青素（Sigma 公司，美國），臨用前溶于橄欖油中。丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統（廈門麥克奧迪實業集團有限公司）；JEM-1200EX 透射電鏡（電子株式會社，日本）；LKB-5 型超薄切片機（LKB 公司，瑞典）。
1.2 實驗分組及方法
將 144 只 SD 大鼠按隨機數字表法分為實驗組、對照組及假手術組 3 組，每組 48 只。將大鼠以 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥并固定于鼠板手術臺上，頸背部備毛、消毒鋪巾后，以 T10 棘突為中心取背部后正中約 5 cm 長縱切口，依次切開皮膚、皮下組織，剝離椎旁肌肉，顯露棘突及椎板。咬除 T10 棘突及全椎板至椎弓根部，部分咬除 T9 和 T11 椎板擴大椎管。假手術組直接縫合切口。實驗組和對照組暴露約 20 mm 長脊髓，采用改良 Allen 法制作脊髓重物打擊損傷模型。用自制的改良 Allen 打擊裝置以致傷能量 50 g·cm（沖擊量為 5 g 重物從 10 cm 高度自由落下）造成大鼠脊髓損傷；造模成功標準：損傷處脊髓外觀出血、水腫，大鼠尾巴痙攣性擺動、雙下肢及軀體回縮撲動后，雙下肢癱；脊髓損傷造模成功后，逐層縫合切口。
術后即刻實驗組給予蝦青素（75 mg/kg[10]）灌胃，對照組和假手術組給予等量橄欖油灌胃，每日 2 次，連續灌胃至實驗結束。給予 12 h∶12 h 的白天/夜間光照周期，自由進食粉狀飼料及飲用自來水（不限飲水及進食），室溫 25～27℃，每日 3 次人工膀胱排尿，直至形成反射性膀胱。
1.3 觀測指標
1.3.1 運動功能評價
術后 1 d 及 1、2、3、4 周每組各取 6 只大鼠，進行 BBB 評分。由熟悉該評分標準的 2 名實驗人員進行雙盲法評分。
1.3.2 MDA 含量和 SOD 活性測定
術后 24 h 各組分別取 6 只大鼠麻醉后處死，取損傷段脊髓，以損傷點為中心切取脊髓組織 10 mm，稱重后制備脊髓組織勻漿。采用硫代巴比妥酸法，根據 MDA 檢測試劑盒說明方法測定 MDA 含量；采用黃嘌呤氧化酶法，根據 SOD 檢測試劑盒說明方法測定 SOD 活性。
1.3.3 細胞凋亡檢測
術后 6、24、48 h 各組分別取 6 只大鼠，麻醉后剖胸、心臟插管、灌流固定，以損傷點為中心切取脊髓組織 10 mm，修剪后石蠟包埋連續切片，片厚 5 μm，嚴格按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，光鏡下觀察。凋亡細胞在原位末端標記后呈棕黃色，每張切片隨機取 1 個高倍視野，按以下公式計算凋亡指數（apoptosis index，AI）：（凋亡細胞數/鏡下細胞總數）×100%。以上觀察由 2 名病理學專業人員根據雙盲原則統計。
1.3.4 脊髓組織水腫評價
用干濕重法測定脊髓組織含水量，評估脊髓組織水腫程度。術后 48 h 各組分別取 6 只大鼠麻醉后處死，取損傷段脊髓，以損傷點為中心低溫切取 10 mm 脊髓組織凍存，稱濕重（W）；然后于 80℃ 烤箱干燥 48 h，稱干重（D）；重復 3 次后，取均值，按以下公式計算脊髓組織含水量：［（W–D）/W］×100%，數值大小與脊髓水腫程度成正相關。
1.3.5 脊髓損傷面積測定
術后 48 h 各組分別取 6 只大鼠麻醉后處死，以損傷點為中心取損傷段脊髓，按光鏡標本制作要求分步驟進行標本處理后，25 μm 厚切片，行常規 HE 染色，采用 Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統，測量損傷處像素與脊髓橫截面總像素，計算二者的比值作為脊髓損傷面積比。
1.3.6 超微結構觀察及評分
術后 48 h 各組分別取 6 只大鼠麻醉后處死，按透射電鏡標本制作要求分步驟進行標本處理后，用 LKB-5 型超薄切片機切片，片厚 50～60 nm，用枸櫞酸鉛進行染色，JEM-1200EX 透射電鏡觀察。采用 Kaptanoglu 評分法[11]在 5 000 倍放大率下，對透射電鏡標本進行超微結構評分，每個樣本分別評估 20 個神經細胞、20 個軸突、20 個線粒體的超微結構改變，計算各組細胞質內水腫、細胞核損傷、軸突變性、髓鞘分解和線粒體損傷的評分。數值大小與脊髓損傷嚴重程度成正相關。由 2 名實驗人員進行雙盲法評分。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 運動功能評價
術后各時間點對照組和實驗組大鼠 BBB 評分均顯著低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）；術后 1～4 周實驗組大鼠 BBB 評分均顯著高于對照組，差異亦有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組大鼠 BBB 評分比較（n=6，
）
Table1.
Comparison of BBB score of rats in each group at each time point after operation (n=6,
)
2.2 MDA 含量和 SOD 活性測定
術后 24 h，假手術組、對照組、實驗組脊髓組織中 MDA 含量分別為（2.82±0.24）、（10.12±0.64）、（6.21±0.36）nmol/mg，對照組和實驗組 MDA 含量顯著高于假手術組，實驗組 MDA 含量顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。假手術組、對照組、實驗組脊髓組織中 SOD 活性分別為（35.63 ±1.76）、（17.83±1.21）、（31.56±1.46）U/mg，對照組和實驗組 SOD 活性顯著低于假手術組，實驗組 SOD 活性顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 細胞凋亡檢測
術后各時間點假手術組均未見 TUNEL 標記陽性細胞；對照組可見較多 TUNEL 標記陽性細胞，累及灰質和白質，大小不一，分布不均勻；實驗組可見較少 TUNEL 標記陽性細胞，見圖 1。術后各時間點對照組和實驗組脊髓組織中 AI 顯著高于假手術組，實驗組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表 2。
表2
術后各時間點各組 AI 比較（n=6，%，
）
Table2.
Comparison of AI of rats in each group at each time point after operation (n=6, %,
)
2.4 脊髓組織水腫評價
術后 48 h，假手術組、對照組、實驗組脊髓組織含水量分別為 55.21%±1.89%、88.11%±4.12% 和 64.84%±3.06%，對照組和實驗組脊髓組織含水量顯著高于假手術組，實驗組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.5 脊髓損傷面積測定
術后 48 h，假手術組、對照組、實驗組的脊髓損傷面積比分別為 0、0.52±0.08 和 0.28±0.05，對照組和實驗組脊髓損傷面積比顯著高于假手術組，實驗組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.6 超微結構觀察及評分
術后 48 h 透射電鏡觀察示，假手術組脊髓組織無出血、水腫，表現為正常的脊髓灰質和白質，神經細胞、膠質細胞、神經纖維、膜性細胞器、軸突及髓鞘均呈現正常的超微結構。對照組脊髓組織明顯出血、水腫；灰質內神經細胞的細胞核和胞質細胞器顯著變性；白質內有髓神經纖維出現髓鞘分裂和軸突細胞器變化；毛細血管周圍水腫，毛細血管內皮細胞呈現細胞器改變。實驗組脊髓組織內部分區域可見間質水腫和出血，但較對照組程度輕；灰質內部分神經細胞胞膜細胞器空泡化，脂褐素顆粒聚集，膠質細胞結構基本正常；白質內部分有髓神經纖維髓鞘板層部分分離，大多數神經纖維呈現正常的超微結構；部分毛細血管周圍水腫，但毛細血管內皮細胞結構正常。見圖 2。
假手術組、對照組和實驗組的超微結構評分分別為 0、8.68±0.32 和 3.12±0.16，對照組和實驗組超微結構評分顯著高于假手術組，實驗組顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖1
術后 48 h 各組 TUNEL 染色觀察（×200）
a. 假手術組；b. 對照組；c. 實驗組
Figure1. TUNEL staining in each group at 48 hours after operation (×200)a. Sham group; b. Control group; c. Experimental group
圖2
術后 48 h 各組透射電鏡觀察（×5 000）
a、b. 假手術組脊髓灰質和白質；c. 對照組脊髓白質；d. 實驗組脊髓白質
Figure2. Transmission electron microscope observation at 48 hours after operation (×5 000)a, b. The gray matter and white matter of spinal cord in the sham group; c. The white matter of spinal cord in the control group; d. The white matter of spinal cord in the experimental group
3 討論
脊髓損傷分為原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷是指脊髓受到暴力破壞后，神經細胞破碎、軸索斷裂，細胞質膜破裂，內溶酶釋放致細胞直接死亡。繼發性損傷是在原發性損傷基礎上發生的多種因素參與的序列性組織自毀性破壞過程。細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是一種固有的自然生理過程，它通過清除死亡細胞和代謝產物維持人體各系統組織的穩定。大量研究已證實了細胞凋亡是繼發性脊髓損傷的重要組成部分，不管是人還是動物，繼發性損傷中出現的神經元和神經膠質細胞死亡都是繼發細胞凋亡的結果。1996 年 Li 等[12]首先證實了脊髓損傷后存在細胞凋亡，作者在壓迫性脊髓損傷模型中，運用原位末端標記法（TUNEL 法），發現于損傷后 4 h 開始損傷頭尾側脊髓白質內數量較多的陽性細胞，標記細胞高峰出現在損傷后 1 周，損傷后 3 周陽性細胞仍可見。同樣，Yong 等[13]也觀察到大鼠脊髓嚴重挫傷后誘發的細胞凋亡現象，并發現其凋亡細胞以神經元、星形細胞、少突神經膠質細胞和小膠質細胞為主。有學者對大鼠脊髓挫傷后 5 min～30 d 不同時間段進行了連續觀察研究[14]，脊髓損傷后 5 min 就出現中央損傷區，但無凋亡細胞；4 h 后損傷區內神經元中發現凋亡細胞，8 h 達到高峰。神經膠質細胞中的凋亡細胞在傷后 4 h 出現，24 h 達到高峰。損傷后 1 周內，最初的損傷區進行性擴大，并出現空洞，同時有更多神經元和神經膠質細胞相繼死亡。Liu 等[14]認為這種病理現象過程可能與殘存軸突脫髓鞘改變有關。Crowe 等[15]研究表明，中樞神經系統損傷后，細胞調亡與壞死并存，共同加重中樞神經系統的損害。本實驗結果顯示，對照組各時間點脊髓組織 AI 均顯著高于假手術組（P<0.05），表明脊髓損傷后發生了嚴重的細胞凋亡。同時，本研究發現對照組脊髓組織中 MDA 含量顯著高于假手術組（P<0.05），SOD 活性顯著低于假手術組（P<0.05），表明脊髓損傷降低了機體抗氧化酶的抗氧化能力，誘發氧自由基過度生成和嚴重的脂質過氧化。對照組脊髓組織含水量、脊髓損傷面積比及超微結構評分顯著高于假手術組（P<0.05），大鼠 BBB 評分顯著低于假手術組（P<0.05），表明脊髓損傷誘發了脊髓水腫、脊髓組織病理學損傷、超微結構損傷，以及大鼠的運動功能障礙。
蝦青素又名蝦黃質、龍蝦殼色素，是一種呈深粉紅色類胡蘿卜素，化學結構類似于 β-胡蘿卜素，也是類胡蘿卜素合成的最高級別產物。大量研究已證實蝦青素是一種具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用的強效抗氧化劑[1-2]。近期研究證實蝦青素能夠有效抑制腦損傷后的細胞凋亡，改善神經功能，發揮神經保護作用[7]。Wu 等[5]在實驗性蛛網膜下腔出血模型研究中證實，蝦青素可以激活核因子相關因子 2 和抗氧化反應元件通路，減輕氧化損傷，減輕腦水腫、血腦屏障的破壞，抑制細胞凋亡，改善神經功能，改善腦損傷。Zhang 等[6]研究發現，在大鼠蛛網膜下腔出血模型中，蝦青素可顯著升高大腦皮質中磷酸化 Akt 和 Bad 水平，顯著降低 Caspase-3 水平，減少神經元凋亡，減少腦水腫、減輕血腦屏障破壞，改善神經功能障礙，減輕繼發性腦損傷，對大鼠蛛網膜下腔出血后早期腦損傷具有保護作用。Wang 等[7]在異氟烷誘導的腦損傷模型中證實，蝦青素能顯著上調磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B 信號通路，降低 Caspase-3 活性，減少細胞凋亡，促進細胞生長，抑制異氟醚誘導的神經元凋亡。Zhang 等[8]在體外培養的星形膠質細胞牽張損傷模型中發現，蝦青素能抑制 NF-κB 核轉位，降低促炎性細胞因子的表達，抑制鈉離子、鉀離子、氯離子共轉運體的表達，降低 Bax 水平，升高 Bcl-2 水平，降低 Caspase-3 活性，減少星形膠質細胞凋亡，發揮神經保護作用。Pan 等[9]研究表明，蝦青素能夠提高大鼠腦缺血模型中機體的抗氧化能力，激活抗氧化防御通路，抑制活性氧，抑制細胞凋亡，促進神經再生，減少腦梗死體積，改善神經功能，發揮神經保護作用。本研究發現，實驗組各時間點脊髓組織細胞 AI 均顯著低于對照組（P<0.05），表明蝦青素抑制了脊髓損傷后的細胞凋亡。實驗組脊髓組織中 SOD 活性顯著高于對照組（P<0.05），MDA 含量顯著低于對照組（P<0.05），表明蝦青素增強了機體的抗氧化酶活性，抑制了脊髓損傷誘發的自由基過度生成和脂質過氧化。實驗組脊髓組織含水量、脊髓損傷面積比及超微結構評分顯著低于對照組（P<0.05），大鼠 BBB 評分顯著高于對照組（P<0.05），表明蝦青素能夠明顯減輕脊髓水腫，減輕脊髓組織病理學損傷、超微結構損傷，改善脊髓損傷大鼠的運動功能，有效地保護脊髓組織，具有明顯的神經保護作用。
綜上述，本研究結果提示了蝦青素能夠抑制脊髓損傷后的脂質過氧化，減輕脊髓損傷后的細胞凋亡，減輕脊髓水腫，減少脊髓損傷面積，減輕脊髓組織病理學損傷及超微結構損傷，促進脊髓損傷后的運動功能的恢復，有效地保護脊髓組織，具有良好的神經保護作用。本實驗為蝦青素臨床治療脊髓損傷提供了初步理論依據，但實驗組各項指標與假手術組比較差異均有統計學意義，因此蝦青素對脊髓損傷的神經保護作用仍需進一步深入研究。
