引用本文： 沈潔, 葉曉健. “手風琴”技術在牽張成骨區新生骨礦化中的作用. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(5): 558-567. doi: 10.7507/1002-1892.201712094 復制
目前，牽張成骨技術是臨床上用于治療先天骨畸形、長骨缺損、創傷后骨感染或骨不連、畸形愈合等的主要手段[1]。該技術在外固定支架提供穩定機械力作用下，通過既定節律（0.75～1.00 mm/d）進行緩慢牽張，發揮自體長骨內在的成骨活性，逐漸完成新骨重建[2-3]。然而，對于長段骨缺損或需行大段骨延長的患者而言，牽張區成骨緩慢，患者攜帶外固定支架時間久，從而導致的釘道松動感染、礦化不良、再骨折等并發癥日益突出，成為該技術進一步發展的瓶頸。盡管在基礎研究中應用較多方法，包括局部或全身運用生物因子、BMP 等，以促進新骨形成，但大部分因價格昂貴、運用方法難度大、效果不確切等原因，現階段尚不能在臨床中應用[4]。
文獻報道[5]在絕對穩定固定的前提下，骨折修復或牽張成骨過程中，骨斷端的軸向微動有利于新生骨愈合，如靜態加壓、負重或軸向的動態力學刺激可有效促進骨不連愈合。但這些方法的應用都是對骨愈合不良的補救措施，而在初期成骨過程中通過適當機械刺激加速成骨，尚缺乏有效的實驗數據。臨床上有學者嘗試在牽張成骨初期行牽張-壓縮-再牽張的物理刺激方法，稱為“手風琴”技術，獲得一定療效[1]。有文獻報道了該技術對于加速礦化的有效性，但對于采用“手風琴”技術的時機、具體操作方法尚缺乏統一標準，相關的作用機制也值得進一步探討[5-6]。因此，本研究擬在大鼠牽張成骨模型中初步探索單循環“手風琴”技術對牽張區骨再生的作用、刺激時機以及可能機制，為臨床正確有效運用該技術奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12 周齡雄性 SD 大鼠 54 只，體質量 400～450 g，由第二軍醫大學長征醫院動物房提供。
甲醛丙烯酸甲酯（methl methacrylate，MMA）、成骨相關轉錄因子（osterix，OSX）、3% 戊巴比妥鈉（Abcam 公司，美國）；骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN；Santa Cruz 公司，美國）；VEGF（Novus Biologicals 公司，美國）。MX-20 數字 X 攝片機（Faxitron X-Ray Corp 公司，美國）；Micro-CT（Scanco Medical 公司，瑞士）；H25KS 生物力學檢測儀（Hounsfield Test Equipment 公司，英國）；RM2155 硬組織切片機（Leica 公司，德國）；HM 355S 石蠟切片機（Thermo Fisher Scientific 公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
取 54 只 SD 大鼠以 3% 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，備皮消毒后，沿右側小腿行 1.5 cm 縱切口，分離至脛骨后于近端和遠端使用螺紋鉆預先鉆孔，隨后將兩組直徑 1.0 mm 半釘小心擰入，并于脛骨中段進行橫向郵票截骨，同時截斷腓骨，安裝單邊外固定支架進行固定，縫合皮膚和皮下組織。經過 5 d 潛伏期后，對大鼠進行連續 7 d 的機械牽張，速率為 1 mm/d，每天分 2 次完成，隨后進入為期 6 周的礦化期[7-8]。根據在礦化期實施“手風琴”操作的時間不同，將大鼠隨機分為 4 組，其中對照組和早期組各 18 只，中期組 12 只，晚期組 6 只。對照組為觀察組，不行“手風琴”操作；早期組、中期組及晚期組分別于礦化第 1、3、5 周行“手風琴”操作，操作時間為 7 d，其中 3.5 d 壓縮、3.5 d 牽張，速率仍為 1 mm/d，每天分 2 次完成。對照組和早期組分別于礦化第 2、4、6 周結束時，中期組于礦化第 4、6 周結束時，晚期組于礦化第 6 周結束時，各取 6 只大鼠處死，取雙側脛骨進行相關觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 影像學觀測
① X 線片觀察：礦化期間每周對各組大鼠右側脛骨攝正側位 X 線片，觀察骨再生與礦化進展。② Micro-CT 觀察：各組每次取材時對大鼠右側脛骨行 Micro-CT 掃描，使用三維重建系統生成礦化區新生骨三維形態，評估牽張區新生骨結構改變。同時，為了消除正常骨質對新生骨的干擾，自延長中心向遠、近端分別選取 110 層作為有效區間進行分析。根據文獻報道，設定 158 閾值為最低閾值，代表尚未礦化的新生骨痂；211 閾值為中間閾值，代表礦化明顯的新生骨痂；1 000 閾值為最高閾值，代表正常骨質[7-8]。運用 Micro-CT 自帶軟件記錄礦化第 6 周時 158～211、211～1 000 及 158～1 000 閾值范圍的各組骨體積（bone volume，BV）和組織體積（tissue volume，TV），計算兩者比值 BV/TV，同時計算骨密度（bone mineral density，BMD）。
1.3.2 生物力學檢測
對礦化第 6 周所取的各組標本行四點彎曲生物力學檢測。將脛骨置于生物力學檢測儀上，設置最大壓力為 250 N，對脛骨逐漸加壓（5 mm/min）。采用檢測儀裝載的軟件收集并計算以下數據：最大壓力（脛骨折斷時最大壓力）、彈性模量、折斷能量（折斷損耗的能量）。為避免個體差異，以正常側脛骨作為對照，取延長側脛骨與正常側脛骨百分比進行統計學分析。
1.3.3 組織學觀察
各組各時間點取部分脛骨標本，經梯度乙醇、二甲苯脫水后，用 MMA 包埋，沿標本長軸縱行切開，用硬組織切片機行 5 μm 厚切片，常規行 Von Kossa 染色和番紅 O 染色觀察骨組織形態。取部分標本置于 10% 甲醛固定 24 h 后，10%EDTA 脫鈣，每 2 天更換 1 次，3 周后沿標本縱軸一切為二，石蠟包埋、成形后用石蠟切片機行 5 μm 厚切片，常規行 HE 染色觀察骨組織結構。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
各組各時間點取部分脛骨標本（n=3），二甲苯浸泡取出石蠟后逐級水化，使用 0.3% 雙氧水常溫避光孵育 20 min，淬滅內生性過氧化物酶活性；用檸檬酸緩沖液（pH=6）行抗原修復，5% 山羊血清封閉，加入一抗 OSX（1∶100）、OCN（1∶100）、VEGF（1∶100）孵育 4℃ 過夜，加入相應二抗常溫孵育 1 h。通過辣根過氧化物酶標記的抗生蛋白鏈菌素顯色，蘇木素復染，光鏡下觀察。每個標本取 2 個不同視野計算陽性細胞百分比。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 影像學觀測
2.1.1 牽張成骨區 X 線片觀察
礦化初期（0 周時），各組牽張區均無明顯骨痂形成；第 1 周早期組行“手風琴”操作后，骨痂無明顯增加；第 3 周行“手風琴”操作后，與其他各組相比，中期組骨痂最多，礦化最快；第 5 周行“手風琴”操作后，晚期組新生骨礦化速度并未明顯加快；第 6 周各組比較，可見中期組牽張區骨痂密度最高，連續性最佳。且早、中、晚期組骨痂變化情況比較發現，中期組行“手風琴”操作對骨再生促進作用更明顯。見圖 1。
2.1.2 Micro-CT 觀測
三維重建觀察示，礦化第 2 周，早期組和對照組牽張區骨痂含量少，皮質骨不連續，中央有明顯缺損，兩組無顯著差異；第 4、6 周，中期組新生骨質量明顯優于其余各組，尤其在第 6 周時，中期組髓腔基本完成重建，晚期組重建相對較慢，牽張區中央仍有間隙。見圖 2。
礦化第 6 周，158～211 閾值范圍時各組 BV/TV 比較差異均無統計學意義（P>0.05）。158～1 000 和 211～1 000 閾值范圍時，中期組和晚期組 BV/TV 顯著高于對照組（P<0.05），早期組僅在 211～1 000 閾值范圍的 BV/TV 顯著高于對照組（P<0.05）；早、中、晚期組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。早、中、晚期組 BMD 均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；早、中、晚期組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
2.2 生物力學檢測
礦化第 6 周，中期組脛骨標本的最大壓力、彈性模量、折斷能量均顯著高于其余 3 組，差異有統計學意義（P<0.05）；早期組和晚期組彈性模量和最大壓力顯著高于對照組（P<0.05），但折斷能量與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；早期組和晚期組間各指標比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
礦化第 6 周各組各觀察指標比較（n=6，
）
Table1.
Comparison of different parameters of the distraction regenerates between groups at 6 weeks after distraction (n=6,
)
2.3 組織學觀察
Von Kossa 染色示：礦化第 2 周，對照組和早期組牽張區均有明顯骨缺損。第 4 周，對照組和早期組牽張區中央仍有明顯非礦化組織，周圍皮質不連續；與之相比，中期組有更多礦化骨痂形成。第 6 周，對照組和早期組牽張區皮質未完全連接，早期組缺損明顯；晚期組周圍皮質有少許缺失，髓腔骨痂仍在礦化；而中期組皮質已連續，髓腔再通。見圖 3。
番紅 O 染色示：礦化第 2 周，對照組和早期組牽張區中央主要為纖維組織。第 4 周，對照組、早期組牽張區有較多軟骨；中期組有軟骨，但含量較少，大部分已轉化為骨組織。第 6 周，早期組牽張區仍有軟骨，其余 3 組牽張區中央已無軟骨細胞殘留。見圖 4。
HE 染色示：礦化第 2 周，對照組和早期組牽張區均有明顯的透亮條帶，以纖維組織為主，含有少量軟骨細胞；第 4 周，對照組和早期組中央透亮區以軟骨為主，中期組已開始形成骨基質；第 6 周，中期組髓腔基本完成重建，其余 3 組仍有明顯的中央透亮帶。見圖 5。
2.4 免疫組織化學染色觀察
在同一時間點與其他各組相比，中期組在礦化第 4 周有更多 OSX、OCN 及 VEGF 陽性表達，晚期組在礦化第 6 周有更多 OSX、OCN 和 VEGF 陽性表達。見圖 6～8。
定量分析顯示，礦化第 2 周，對照組 OSX 陽性細胞百分比顯著多于早期組（P<0.05）；第 4 周，中期組 OSX 陽性細胞百分比顯著多于對照組和早期組（P<0.05），早期組和對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；第 6 周，除中期組 OSX 陽性細胞百分比顯著低于其余 3 組，對照組顯著低于晚期組（P<0.05）外，其余各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 9a。
礦化第 2 周，對照組和早期組 OCN 陽性細胞百分比差異無統計學意義（P>0.05）；第 4 周，除中期組 OCN 陽性細胞百分比高于對照組（P<0.05）外，其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；第 6 周，除中期組 OCN 陽性細胞百分比顯著低于其余 3 組，對照組顯著低于晚期組（P<0.05）外，其余各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 9b。
礦化第 2 周，對照組 VEGF 陽性細胞百分比顯著少于早期組（P<0.05）；第 4 周，對照組、早期組、中期組間 VEGF 陽性細胞百分比比較差異均有統計學意義（P<0.05）；第 6 周，中期組 VEGF 陽性細胞百分比顯著低于其余 3 組（P<0.05），其余 3 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 9c。
圖1
各組大鼠牽張成骨區新生骨礦化 X 線片觀察
從左至右依次為礦化第 0、1、2、3、4、5、6 周 a. 對照組；b. 早期組；c. 中期組；d. 晚期組
Figure1. X-ray images of distraction regenerates in each groupFrom left to right for 0, 1, 2, 3, 4, 5, and 6 weeks after distraction, respectively a. Control group; b. Early-phase group; c. Mid-phase group; d. Late-phase group
圖2
礦化各時間點各組牽張成骨區新生骨 Micro-CT 三維重建觀察
a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure2. Micro-CT three-dimensional reconstruction images of distraction regenerates in each group during consolidation phasea. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group;d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖3
礦化各時間點各組 Von Kossa 染色觀察（×25）
a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure3. Von Kossa staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×25)a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖4
礦化各時間點各組番紅 O 染色觀察（×25）
a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure4. Safranin O staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×25)a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖5
礦化各時間點各組 HE 染色觀察（×25）
a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure5. HE staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×25)a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖6
礦化各時間點各組 OSX 免疫組織化學染色觀察（×100）
箭頭示陽性細胞 a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure6. OSX immunohistochemical staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×100)Arrow indicated the positive cells a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖7
礦化各時間點各組 OCN 免疫組織化學染色觀察（×100）
箭頭示陽性細胞 a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure7. OCN immunohistochemical staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×100)Arrow indicated the positive cells a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖8
礦化各時間點各組 VEGF 免疫組織化學染色觀察（×100）
箭頭示陽性細胞 a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure8. VEGF immunohistochemical staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×100)Arrow indicated the positive cells a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖9
礦化各時間點各組免疫組織化學染色陽性細胞百分比比較
a. OSX；b. OCN；c. VEGF
Figure9. Positive cells of distraction regenerates in each group during consolidation phasea. OSX; b. OCN; c. VEGF
3 討論
根據 Ilizarov 提出的張力-應力法則，牽張成骨區新生骨礦化的速度和質量與成骨區的生物力學環境密切相關[3]。良好的生物力學環境能夠促進局部干細胞成骨分化，新生血管形成[9]。臨床工作中，對于運用外固定行骨搬運或骨延長的患者，除了局部堅強固定外，盡早適當負重訓練是促進骨礦化的重要步驟，也有文獻進一步報道了在臨床病例中運用“手風琴”技術對骨愈合的作用[5, 10]。在基礎研究中，有學者通過動物實驗證實在牽張過程中進行反復高頻率的壓縮-牽張，對新生骨礦化無有效刺激作用[11]；而另一組實驗卻提出在牽張早期進行壓縮-牽拉有利于骨痂形成[12]。本研究在大鼠牽張成骨模型中，通過在礦化不同時期實施牽張-壓縮-再牽張的“手風琴”技術，明確了其對骨礦化的促進作用和運用時機。
與其他方法相比，“手風琴”操作是一個無需注射任何藥物、蛋白及生長因子的無創方法，截骨后兩骨段之間的成骨活性被外固定支架提供的牽張-壓縮-牽張應力所激活。目前與“手風琴”技術相關的臨床文獻中，大部分僅呈現了一個陽性結果，對于該技術的操作時機和具體尚未明確[5, 10]。本研究中，我們從動物實驗出發，在礦化的不同時期，如礦化第 1、3、5 周，分別代表礦化的早、中、晚期，對牽張區新生骨進行為期 1 周的“手風琴”操作，包括 3.5 d 的緩慢壓縮和 3.5 d 的緩慢牽張，速度與最初牽張速度（0.5 mm/12 h）一致，評估牽張區新生骨的質量、形態及生物力學性能。結果提示，礦化中期行“手風琴”操作最有利于新生骨的形成，該結果與本研究團隊既往報道的結果一致[13]。不僅如此，本研究進一步通過組織學檢測發現，與其他各組相比，礦化中期“手風琴”操作干預后，礦化第 6 周骨皮質已連續，髓腔完成重建；且成骨指標 OCN 和 OSX 陽性細胞百分比自礦化中期“手風琴”操作結束后升高最明顯，提示干細胞向成骨方向進行轉化。
根據文獻報道[14-15]，VEGF 對 BMSCs 或成骨細胞的成骨分化及礦化至關重要。本研究中，我們發現在礦化中期行“手風琴”操作能夠刺激內源性 VEGF 水平的升高。牽張成骨是一個從無到有的骨組織再生過程，血管及血流量在礦化早期是匱乏的，整個牽張區是一個乏氧或低氧環境，“手風琴”式的機械操作可能進一步刺激成骨細胞內低氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）水平升高，HIF-1α 與 HIF-1β 結合形成異質二聚體，促進了下游 VEGF 表達[11, 16]。值得注意的是，礦化早期因血管網剛開始重建，相對比較脆弱，此時行“手風琴”技術可能對血管網的再生形成人為破壞。所以在我們實驗中，早期組的 VEGF 水平與對照組無區別；而到了晚期，新生血管網已大致形成，再行“手風琴”操作對牽張區的氧環境無顯著改變，不能明顯提升 VEGF 的水平。因此，礦化中期是一個能夠誘導低氧環境的最佳時期。免疫組織化學染色結果也表明，礦化中期 VEGF 水平表達在“手風琴”操作后顯著升高，隨著血管與骨的進一步再生，在礦化晚期逐漸下降。
綜上述，本研究以大鼠脛骨牽張成骨為模型，表明了“手風琴”操作能夠有效促進新生骨的再生與礦化。其中，在礦化中期運用“手風琴”技術最為有效，相關機制可能與局部低氧環境形成，VEGF 水平上調有關。本實驗的成功實施為臨床運用“手風琴”技術治療大段骨缺損提供了實驗依據。但本研究也存在一些缺陷：首先，大鼠脛骨牽張后的礦化期是我們根據對外固定的理解劃分成早、中、晚期，并未進一步檢測其他時間點進行“手風琴”操作對礦化的影響；另外，一些臨床研究和基礎實驗提出，礦化期間行多次手風琴操作有利于骨礦化，雖然我們實驗僅采用一次循環，也說明了對新生骨再生的有利作用，但還需要進一步臨床驗證；最后，對于“手風琴”操作促進骨再生的機制，還需要進一步實驗進行論證。
目前，牽張成骨技術是臨床上用于治療先天骨畸形、長骨缺損、創傷后骨感染或骨不連、畸形愈合等的主要手段[1]。該技術在外固定支架提供穩定機械力作用下，通過既定節律（0.75～1.00 mm/d）進行緩慢牽張，發揮自體長骨內在的成骨活性，逐漸完成新骨重建[2-3]。然而，對于長段骨缺損或需行大段骨延長的患者而言，牽張區成骨緩慢，患者攜帶外固定支架時間久，從而導致的釘道松動感染、礦化不良、再骨折等并發癥日益突出，成為該技術進一步發展的瓶頸。盡管在基礎研究中應用較多方法，包括局部或全身運用生物因子、BMP 等，以促進新骨形成，但大部分因價格昂貴、運用方法難度大、效果不確切等原因，現階段尚不能在臨床中應用[4]。
文獻報道[5]在絕對穩定固定的前提下，骨折修復或牽張成骨過程中，骨斷端的軸向微動有利于新生骨愈合，如靜態加壓、負重或軸向的動態力學刺激可有效促進骨不連愈合。但這些方法的應用都是對骨愈合不良的補救措施，而在初期成骨過程中通過適當機械刺激加速成骨，尚缺乏有效的實驗數據。臨床上有學者嘗試在牽張成骨初期行牽張-壓縮-再牽張的物理刺激方法，稱為“手風琴”技術，獲得一定療效[1]。有文獻報道了該技術對于加速礦化的有效性，但對于采用“手風琴”技術的時機、具體操作方法尚缺乏統一標準，相關的作用機制也值得進一步探討[5-6]。因此，本研究擬在大鼠牽張成骨模型中初步探索單循環“手風琴”技術對牽張區骨再生的作用、刺激時機以及可能機制，為臨床正確有效運用該技術奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12 周齡雄性 SD 大鼠 54 只，體質量 400～450 g，由第二軍醫大學長征醫院動物房提供。
甲醛丙烯酸甲酯（methl methacrylate，MMA）、成骨相關轉錄因子（osterix，OSX）、3% 戊巴比妥鈉（Abcam 公司，美國）；骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN；Santa Cruz 公司，美國）；VEGF（Novus Biologicals 公司，美國）。MX-20 數字 X 攝片機（Faxitron X-Ray Corp 公司，美國）；Micro-CT（Scanco Medical 公司，瑞士）；H25KS 生物力學檢測儀（Hounsfield Test Equipment 公司，英國）；RM2155 硬組織切片機（Leica 公司，德國）；HM 355S 石蠟切片機（Thermo Fisher Scientific 公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
取 54 只 SD 大鼠以 3% 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，備皮消毒后，沿右側小腿行 1.5 cm 縱切口，分離至脛骨后于近端和遠端使用螺紋鉆預先鉆孔，隨后將兩組直徑 1.0 mm 半釘小心擰入，并于脛骨中段進行橫向郵票截骨，同時截斷腓骨，安裝單邊外固定支架進行固定，縫合皮膚和皮下組織。經過 5 d 潛伏期后，對大鼠進行連續 7 d 的機械牽張，速率為 1 mm/d，每天分 2 次完成，隨后進入為期 6 周的礦化期[7-8]。根據在礦化期實施“手風琴”操作的時間不同，將大鼠隨機分為 4 組，其中對照組和早期組各 18 只，中期組 12 只，晚期組 6 只。對照組為觀察組，不行“手風琴”操作；早期組、中期組及晚期組分別于礦化第 1、3、5 周行“手風琴”操作，操作時間為 7 d，其中 3.5 d 壓縮、3.5 d 牽張，速率仍為 1 mm/d，每天分 2 次完成。對照組和早期組分別于礦化第 2、4、6 周結束時，中期組于礦化第 4、6 周結束時，晚期組于礦化第 6 周結束時，各取 6 只大鼠處死，取雙側脛骨進行相關觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 影像學觀測
① X 線片觀察：礦化期間每周對各組大鼠右側脛骨攝正側位 X 線片，觀察骨再生與礦化進展。② Micro-CT 觀察：各組每次取材時對大鼠右側脛骨行 Micro-CT 掃描，使用三維重建系統生成礦化區新生骨三維形態，評估牽張區新生骨結構改變。同時，為了消除正常骨質對新生骨的干擾，自延長中心向遠、近端分別選取 110 層作為有效區間進行分析。根據文獻報道，設定 158 閾值為最低閾值，代表尚未礦化的新生骨痂；211 閾值為中間閾值，代表礦化明顯的新生骨痂；1 000 閾值為最高閾值，代表正常骨質[7-8]。運用 Micro-CT 自帶軟件記錄礦化第 6 周時 158～211、211～1 000 及 158～1 000 閾值范圍的各組骨體積（bone volume，BV）和組織體積（tissue volume，TV），計算兩者比值 BV/TV，同時計算骨密度（bone mineral density，BMD）。
1.3.2 生物力學檢測
對礦化第 6 周所取的各組標本行四點彎曲生物力學檢測。將脛骨置于生物力學檢測儀上，設置最大壓力為 250 N，對脛骨逐漸加壓（5 mm/min）。采用檢測儀裝載的軟件收集并計算以下數據：最大壓力（脛骨折斷時最大壓力）、彈性模量、折斷能量（折斷損耗的能量）。為避免個體差異，以正常側脛骨作為對照，取延長側脛骨與正常側脛骨百分比進行統計學分析。
1.3.3 組織學觀察
各組各時間點取部分脛骨標本，經梯度乙醇、二甲苯脫水后，用 MMA 包埋，沿標本長軸縱行切開，用硬組織切片機行 5 μm 厚切片，常規行 Von Kossa 染色和番紅 O 染色觀察骨組織形態。取部分標本置于 10% 甲醛固定 24 h 后，10%EDTA 脫鈣，每 2 天更換 1 次，3 周后沿標本縱軸一切為二，石蠟包埋、成形后用石蠟切片機行 5 μm 厚切片，常規行 HE 染色觀察骨組織結構。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
各組各時間點取部分脛骨標本（n=3），二甲苯浸泡取出石蠟后逐級水化，使用 0.3% 雙氧水常溫避光孵育 20 min，淬滅內生性過氧化物酶活性；用檸檬酸緩沖液（pH=6）行抗原修復，5% 山羊血清封閉，加入一抗 OSX（1∶100）、OCN（1∶100）、VEGF（1∶100）孵育 4℃ 過夜，加入相應二抗常溫孵育 1 h。通過辣根過氧化物酶標記的抗生蛋白鏈菌素顯色，蘇木素復染，光鏡下觀察。每個標本取 2 個不同視野計算陽性細胞百分比。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 影像學觀測
2.1.1 牽張成骨區 X 線片觀察
礦化初期（0 周時），各組牽張區均無明顯骨痂形成；第 1 周早期組行“手風琴”操作后，骨痂無明顯增加；第 3 周行“手風琴”操作后，與其他各組相比，中期組骨痂最多，礦化最快；第 5 周行“手風琴”操作后，晚期組新生骨礦化速度并未明顯加快；第 6 周各組比較，可見中期組牽張區骨痂密度最高，連續性最佳。且早、中、晚期組骨痂變化情況比較發現，中期組行“手風琴”操作對骨再生促進作用更明顯。見圖 1。
2.1.2 Micro-CT 觀測
三維重建觀察示，礦化第 2 周，早期組和對照組牽張區骨痂含量少，皮質骨不連續，中央有明顯缺損，兩組無顯著差異；第 4、6 周，中期組新生骨質量明顯優于其余各組，尤其在第 6 周時，中期組髓腔基本完成重建，晚期組重建相對較慢，牽張區中央仍有間隙。見圖 2。
礦化第 6 周，158～211 閾值范圍時各組 BV/TV 比較差異均無統計學意義（P>0.05）。158～1 000 和 211～1 000 閾值范圍時，中期組和晚期組 BV/TV 顯著高于對照組（P<0.05），早期組僅在 211～1 000 閾值范圍的 BV/TV 顯著高于對照組（P<0.05）；早、中、晚期組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。早、中、晚期組 BMD 均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；早、中、晚期組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
2.2 生物力學檢測
礦化第 6 周，中期組脛骨標本的最大壓力、彈性模量、折斷能量均顯著高于其余 3 組，差異有統計學意義（P<0.05）；早期組和晚期組彈性模量和最大壓力顯著高于對照組（P<0.05），但折斷能量與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；早期組和晚期組間各指標比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
礦化第 6 周各組各觀察指標比較（n=6，
）
Table1.
Comparison of different parameters of the distraction regenerates between groups at 6 weeks after distraction (n=6,
)
2.3 組織學觀察
Von Kossa 染色示：礦化第 2 周，對照組和早期組牽張區均有明顯骨缺損。第 4 周，對照組和早期組牽張區中央仍有明顯非礦化組織，周圍皮質不連續；與之相比，中期組有更多礦化骨痂形成。第 6 周，對照組和早期組牽張區皮質未完全連接，早期組缺損明顯；晚期組周圍皮質有少許缺失，髓腔骨痂仍在礦化；而中期組皮質已連續，髓腔再通。見圖 3。
番紅 O 染色示：礦化第 2 周，對照組和早期組牽張區中央主要為纖維組織。第 4 周，對照組、早期組牽張區有較多軟骨；中期組有軟骨，但含量較少，大部分已轉化為骨組織。第 6 周，早期組牽張區仍有軟骨，其余 3 組牽張區中央已無軟骨細胞殘留。見圖 4。
HE 染色示：礦化第 2 周，對照組和早期組牽張區均有明顯的透亮條帶，以纖維組織為主，含有少量軟骨細胞；第 4 周，對照組和早期組中央透亮區以軟骨為主，中期組已開始形成骨基質；第 6 周，中期組髓腔基本完成重建，其余 3 組仍有明顯的中央透亮帶。見圖 5。
2.4 免疫組織化學染色觀察
在同一時間點與其他各組相比，中期組在礦化第 4 周有更多 OSX、OCN 及 VEGF 陽性表達，晚期組在礦化第 6 周有更多 OSX、OCN 和 VEGF 陽性表達。見圖 6～8。
定量分析顯示，礦化第 2 周，對照組 OSX 陽性細胞百分比顯著多于早期組（P<0.05）；第 4 周，中期組 OSX 陽性細胞百分比顯著多于對照組和早期組（P<0.05），早期組和對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；第 6 周，除中期組 OSX 陽性細胞百分比顯著低于其余 3 組，對照組顯著低于晚期組（P<0.05）外，其余各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 9a。
礦化第 2 周，對照組和早期組 OCN 陽性細胞百分比差異無統計學意義（P>0.05）；第 4 周，除中期組 OCN 陽性細胞百分比高于對照組（P<0.05）外，其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；第 6 周，除中期組 OCN 陽性細胞百分比顯著低于其余 3 組，對照組顯著低于晚期組（P<0.05）外，其余各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 9b。
礦化第 2 周，對照組 VEGF 陽性細胞百分比顯著少于早期組（P<0.05）；第 4 周，對照組、早期組、中期組間 VEGF 陽性細胞百分比比較差異均有統計學意義（P<0.05）；第 6 周，中期組 VEGF 陽性細胞百分比顯著低于其余 3 組（P<0.05），其余 3 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 9c。
圖1
各組大鼠牽張成骨區新生骨礦化 X 線片觀察
從左至右依次為礦化第 0、1、2、3、4、5、6 周 a. 對照組；b. 早期組；c. 中期組；d. 晚期組
Figure1. X-ray images of distraction regenerates in each groupFrom left to right for 0, 1, 2, 3, 4, 5, and 6 weeks after distraction, respectively a. Control group; b. Early-phase group; c. Mid-phase group; d. Late-phase group
圖2
礦化各時間點各組牽張成骨區新生骨 Micro-CT 三維重建觀察
a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure2. Micro-CT three-dimensional reconstruction images of distraction regenerates in each group during consolidation phasea. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group;d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖3
礦化各時間點各組 Von Kossa 染色觀察（×25）
a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure3. Von Kossa staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×25)a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖4
礦化各時間點各組番紅 O 染色觀察（×25）
a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure4. Safranin O staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×25)a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖5
礦化各時間點各組 HE 染色觀察（×25）
a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure5. HE staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×25)a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖6
礦化各時間點各組 OSX 免疫組織化學染色觀察（×100）
箭頭示陽性細胞 a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第 6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure6. OSX immunohistochemical staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×100)Arrow indicated the positive cells a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖7
礦化各時間點各組 OCN 免疫組織化學染色觀察（×100）
箭頭示陽性細胞 a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure7. OCN immunohistochemical staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×100)Arrow indicated the positive cells a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖8
礦化各時間點各組 VEGF 免疫組織化學染色觀察（×100）
箭頭示陽性細胞 a. 對照組礦化第 2 周；b. 早期組礦化第 2 周；c. 對照組礦化第 4 周；d. 早期組礦化第 4 周；e. 中期組礦化第 4 周；f. 對照組礦化第 6 周；g. 早期組礦化第 6 周；h. 中期組礦化第6 周；i. 晚期組礦化第 6 周
Figure8. VEGF immunohistochemical staining of distraction regenerates in each group during consolidation phase (×100)Arrow indicated the positive cells a. At 2 weeks after distraction in control group; b. At 2 weeks after distraction in early-phase group; c. At 4 weeks after distraction in control group; d. At 4 weeks after distraction in early-phase group; e. At 4 weeks after distraction in mid-phase group; f. At 6 weeks after distraction in control group; g. At 6 weeks after distraction in early-phase group; h. At 6 weeks after distraction in mid-phase group; i. At 6 weeks after distraction in late-phase group
圖9
礦化各時間點各組免疫組織化學染色陽性細胞百分比比較
a. OSX；b. OCN；c. VEGF
Figure9. Positive cells of distraction regenerates in each group during consolidation phasea. OSX; b. OCN; c. VEGF
3 討論
根據 Ilizarov 提出的張力-應力法則，牽張成骨區新生骨礦化的速度和質量與成骨區的生物力學環境密切相關[3]。良好的生物力學環境能夠促進局部干細胞成骨分化，新生血管形成[9]。臨床工作中，對于運用外固定行骨搬運或骨延長的患者，除了局部堅強固定外，盡早適當負重訓練是促進骨礦化的重要步驟，也有文獻進一步報道了在臨床病例中運用“手風琴”技術對骨愈合的作用[5, 10]。在基礎研究中，有學者通過動物實驗證實在牽張過程中進行反復高頻率的壓縮-牽張，對新生骨礦化無有效刺激作用[11]；而另一組實驗卻提出在牽張早期進行壓縮-牽拉有利于骨痂形成[12]。本研究在大鼠牽張成骨模型中，通過在礦化不同時期實施牽張-壓縮-再牽張的“手風琴”技術，明確了其對骨礦化的促進作用和運用時機。
與其他方法相比，“手風琴”操作是一個無需注射任何藥物、蛋白及生長因子的無創方法，截骨后兩骨段之間的成骨活性被外固定支架提供的牽張-壓縮-牽張應力所激活。目前與“手風琴”技術相關的臨床文獻中，大部分僅呈現了一個陽性結果，對于該技術的操作時機和具體尚未明確[5, 10]。本研究中，我們從動物實驗出發，在礦化的不同時期，如礦化第 1、3、5 周，分別代表礦化的早、中、晚期，對牽張區新生骨進行為期 1 周的“手風琴”操作，包括 3.5 d 的緩慢壓縮和 3.5 d 的緩慢牽張，速度與最初牽張速度（0.5 mm/12 h）一致，評估牽張區新生骨的質量、形態及生物力學性能。結果提示，礦化中期行“手風琴”操作最有利于新生骨的形成，該結果與本研究團隊既往報道的結果一致[13]。不僅如此，本研究進一步通過組織學檢測發現，與其他各組相比，礦化中期“手風琴”操作干預后，礦化第 6 周骨皮質已連續，髓腔完成重建；且成骨指標 OCN 和 OSX 陽性細胞百分比自礦化中期“手風琴”操作結束后升高最明顯，提示干細胞向成骨方向進行轉化。
根據文獻報道[14-15]，VEGF 對 BMSCs 或成骨細胞的成骨分化及礦化至關重要。本研究中，我們發現在礦化中期行“手風琴”操作能夠刺激內源性 VEGF 水平的升高。牽張成骨是一個從無到有的骨組織再生過程，血管及血流量在礦化早期是匱乏的，整個牽張區是一個乏氧或低氧環境，“手風琴”式的機械操作可能進一步刺激成骨細胞內低氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）水平升高，HIF-1α 與 HIF-1β 結合形成異質二聚體，促進了下游 VEGF 表達[11, 16]。值得注意的是，礦化早期因血管網剛開始重建，相對比較脆弱，此時行“手風琴”技術可能對血管網的再生形成人為破壞。所以在我們實驗中，早期組的 VEGF 水平與對照組無區別；而到了晚期，新生血管網已大致形成，再行“手風琴”操作對牽張區的氧環境無顯著改變，不能明顯提升 VEGF 的水平。因此，礦化中期是一個能夠誘導低氧環境的最佳時期。免疫組織化學染色結果也表明，礦化中期 VEGF 水平表達在“手風琴”操作后顯著升高，隨著血管與骨的進一步再生，在礦化晚期逐漸下降。
綜上述，本研究以大鼠脛骨牽張成骨為模型，表明了“手風琴”操作能夠有效促進新生骨的再生與礦化。其中，在礦化中期運用“手風琴”技術最為有效，相關機制可能與局部低氧環境形成，VEGF 水平上調有關。本實驗的成功實施為臨床運用“手風琴”技術治療大段骨缺損提供了實驗依據。但本研究也存在一些缺陷：首先，大鼠脛骨牽張后的礦化期是我們根據對外固定的理解劃分成早、中、晚期，并未進一步檢測其他時間點進行“手風琴”操作對礦化的影響；另外，一些臨床研究和基礎實驗提出，礦化期間行多次手風琴操作有利于骨礦化，雖然我們實驗僅采用一次循環，也說明了對新生骨再生的有利作用，但還需要進一步臨床驗證；最后，對于“手風琴”操作促進骨再生的機制，還需要進一步實驗進行論證。
