脂多糖對破骨細胞生成及骨吸收功能作用及其機制研究_《中國修復重建外科雜志》

作者：

曾立 ¹ , 徐永明 ² ,  邢更彥 ²

1. 錦州醫科大學武警總醫院研究生培養基地（北京 ?100039）;
2. 武警總醫院骨科（北京 100039）;

關鍵詞：

破骨細胞骨髓源巨噬細胞脂多糖縫隙連接蛋白 43 小鼠

DOI：

10.7507/1002-1892.201712044

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的探討脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對破骨細胞生成及其骨吸收功能的作用及機制。方法取雄性 C57BL/6 小鼠股骨及脛骨骨髓，分離培養骨髓源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs），并行流式細胞儀鑒定。取 BMMs 采用不同濃度 LPS（0、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL）培養后，以細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）檢測不同濃度 LPS 對細胞活性影響。為探討 LPS 對破骨細胞生成的影響，取 BMMs 分為巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）組、M-CSF+核因子 κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）組、M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS 組、M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS 組，對應培養后行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色觀察，計算破骨細胞面積百分比。為探討 LPS 對 Connexin43 蛋白及基因表達影響，將 BMMs 分別分為對照組（M-CSF+RANKL）、LPS 組（M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS）以及對照組（M-CSF+RANKL）、50 ng/mL LPS 組（M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS）、100 ng/mL LPS 組（M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS）培養后，行 Western blot 以及實時熒光定量 PCR 檢測。為探討 LPS 對破骨細胞骨吸收能力的影響，將 BMMs 分為 M-CSF 組、M-CSF+RANKL 組、M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS 組、M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS 組對應培養后，采用骨吸收實驗檢測骨吸收面積百分比。結果流式細胞儀鑒定培養細胞為 BMMs。CCK-8 法檢測顯示與其他濃度相比，100 ng/mL LPS 明顯促進 BMMs 活性（P<0.05）。TRAP 染色示，M-CSF 組未見破骨細胞生成；與 M-CSF+RANKL 組相比，M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS 組、M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS 組破骨細胞體積更大、細胞核更多，其中后者最顯著，3 組破骨細胞面積百分比差異均有統計學意義（P<0.05）。Western blot 檢測，LPS 組 Connexin43 蛋白相對表達量較對照組明顯提高（P<0.05）；實時熒光定量 PCR 檢測示，對照組、50 ng/mL LPS 組以及 100 ng/mL LPS 組 Connexin43 基因相對表達量逐漸增加，比較差異有統計學意義（P<0.05）。骨吸收實驗示，M-CSF 組未形成破骨細胞骨吸收；M-CSF+RANKL 組、M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS 組、M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS 組骨吸收面積百分比逐漸增加，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。結論100 ng/mL LPS 能夠促進 Connexin43 的表達，從而使破骨細胞生成增多，骨吸收功能加強。

引用本文： 曾立, 徐永明, 邢更彥. 脂多糖對破骨細胞生成及骨吸收功能作用及其機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(5): 568-574. doi: 10.7507/1002-1892.201712044 復制

骨是處于動態平衡中的器官^[1]。骨穩態由成骨細胞和破骨細胞共同維持^[2]，對維持骨骼系統正常功能具有重要意義^[3]。骨穩態打破后會導致許多疾病，例如破骨細胞生成增多會導致骨質疏松^[4]。破骨細胞是體內唯一能夠降解骨基質的終末細胞^[5]。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）與核因子 κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）是兩種重要的細胞因子，它們在誘導小鼠骨髓源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）分化為破骨細胞的過程中發揮不可替代的作用^[6]。M-CSF 可由許多類型細胞生成，但 RANKL 僅由幾種細胞生成，例如成骨細胞、骨細胞、成纖維細胞等^[7]。M-CSF 不僅能促進破骨細胞前體細胞的增殖與分化^[8]，還能促進骨髓祖細胞上 RANKL 的受體 RANK 的表達^[9]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分，可引起炎癥性骨損失^[10]。研究發現，小鼠成骨細胞和骨髓來源造血干細胞共培養時，LPS 能促進破骨細胞分化^[11]。然而 LPS 促進破骨細胞生成的分子機制目前尚未明確。本研究通過采用不同濃度 LPS 培養 BMMs，分析 LPS 對破骨細胞生成、縫隙連接蛋白 43（Connexin43）表達以及骨吸收功能的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

4～6 周齡雄性 C57BL/6 小鼠 4 只，體質量（15±3）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。α-MEM 培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；M-CSF、RANKL（R&D 公司，美國）；Connexin43 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒、LPS（Sigma 公司，美國）；CD11b 單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；BCA 試劑盒、紅細胞裂解液、胰蛋白酶（上海碧云天生物技術有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo Laboratories 公司，日本）；TRIzol 試劑（Life Technologies 公司，美國）；ReverTra Ace^? qPCR 試劑盒（Toyobo 公司，日本）。離心機、細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；流式細胞儀（America BD 公司，美國）；光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）。

1.2 BMMs 分離、培養及鑒定

1.2.1 BMMs 分離及培養

根據文獻[12-14]方法分離培養 BMMs。取 C57BL/6 小鼠頸椎脫臼處死后，取雙側股骨、脛骨，PBS 液沖洗骨髓腔 3 次，收集液體，用紅細胞裂解液室溫裂解 15 min，然后采用完全培養基（含 10% FBS、1% 青霉素、1% 鏈霉素的 α-MEM 培養基）于 37℃、5% CO₂ 條件下培養。培養 3 d 后，貼壁細胞即為 BMMs。采用胰蛋白酶消化細胞，根據實驗目的，將其接種于不同細胞培養板進行后續實驗。

1.2.2 BMMs 鑒定

棄培養基，細胞用 PBS 清洗 3 遍，胰蛋白酶消化，200 μL 1% 牛血清白蛋白重懸細胞，收集于 1.5 mL tube 管中；分別加入 CD11b 熒光抗體或其同型對照，避光孵育 20 min；加入 PBS，以離心半徑 3 cm、3 000 r/min 離心 5min；1% 牛血清白蛋白重懸。流式細胞儀檢測 BMMs 表面標志物 CD11b 的表達。

1.3 不同濃度 LPS 對細胞活性的影響

將 BMMs 接種于 96 孔板，每孔 1×10⁴ 個細胞，采用含 30 ng/mL M-CSF 的完全培養基培養。過夜細胞貼壁后，采用含不同濃度 LPS（0、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL）和 30 ng/mL M-CSF 的完全培養基，于 37℃、5% CO₂ 條件下培養。培養后 24、48 h，各濃度組分別取 3 孔，棄培養基，PBS 清洗 3 次。每孔加入含 10% CCK-8 溶液的完全培養基，37℃ 下孵育 4 h，酶標儀 450 nm 波長處檢測吸光度（A）值。

1.4 LPS 誘導破骨細胞生成觀察

1.4.1 細胞分組及方法

將 BMMs 接種于 96 孔板，每孔 5×10³ 個細胞，過夜細胞貼壁后隨機分為 4 組。M-CSF 組：采用含 30 ng/mL M-CSF 的完全培養基培養 5 d；M-CSF+RANKL 組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 5 d；M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS 組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 3 d 后，更換為含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL+50 ng/mL LPS 的完全培養基繼續培養 2 d；M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS 組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 3 d 后，更換為含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL+100 ng/mL LPS 的完全培養基繼續培養 2 d。培養期間每 2 天更換 1 次培養基。

1.4.2 TRAP 染色觀察

取各組細胞，棄培養基，PBS 清洗 3 次；3.7% 多聚甲醛溶液室溫處理 15 min 后，0.1% Triton X-100 處理 10 min。37℃、避光條件下，參照試劑盒說明書 TRAP 染色 40 min。光鏡下觀察，TRAP 陽性細胞呈酒紅色，TRAP 染色陽性且細胞核超過 3 個者為破骨細胞。于 4 倍鏡下，隨機選取 5 個視野，采用 Image J 軟件計算破骨細胞面積百分比（破骨細胞面積/視野面積×100%）。

1.5 LPS 對 Connexin43 表達的影響觀察

1.5.1 對 Connexin43 蛋白表達的影響

將 BMMs 接種于 6 孔板，每孔 1×10⁵ 個細胞，過夜細胞貼壁后隨機分為 2 組。對照組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 4 d；LPS 組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 3 d 后，更換為含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL+100 ng/mL LPS 的完全培養基繼續培養 1 d。培養期間每 2 天更換培養基。

取 2 組細胞，RIPA 冰上裂解 20 min，收集液體于 4℃，離心半徑 3 cm、12 000 r/min 離心 5 min。收集上清，根據 BCA 試劑盒測定蛋白濃度。SDS 聚丙烯酰胺凝膠每孔上樣 20 μg 蛋白，電泳后轉膜至聚偏氟乙烯膜。5% 脫脂牛奶封閉 1 h，加入 Connexin43 一抗，4℃ 搖床輕搖過夜。二抗室溫孵育 1 h。GAPDH 用作內參。以與 GAPDH 灰度值比值，作為 Connexin43 蛋白相對表達量。

1.5.2 對 Connexin43 基因表達的影響

將 BMMs 接種于 6 孔板，每孔 1×10⁵ 個細胞，過夜貼壁后隨機分為 3 組。對照組；采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 4 d；50 ng/mL LPS 組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 3 d 后，更換為含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL+50 ng/mL LPS 的完全培養基繼續培養 1 d；100 ng/mL LPS 組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 3 d 后，更換為含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL+100 ng/mL LPS 的完全培養基繼續培養 1 d。培養期間每 2 天更換培養基。

取 3 組細胞用 TRIzol 試劑提取細胞總的 RNA，參照 ReverTra Ace^? qPCR 試劑盒說明書合成 cDNA。引物序列如下：Connexin43，上游 5'-AAGTGAAAGAGAGGTGCCCA-3'，下游 5'- ACAGCGAAAGGCAGACTGTT-3'；GAPDH，上游 5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3'，下游 5'-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3'。用 2^–△△Ct法計算目的基因相關表達量。

1.6 LPS 對破骨細胞骨吸收能力的影響

1.6.1 細胞分組及方法

將 BMMs 接種于 24 孔培養板，每孔 2×10⁴ 個細胞，過夜貼壁后隨機分為 4 組。M-CSF 組：采用含 30 ng/mL M-CSF 的完全培養基培養 5 d；M-CSF+RANKL 組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 5 d；M-CSF+RANKL+50 ng/mL LPS 組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 3 d 后，更換為含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL+50 ng/mL LPS 的完全培養基繼續培養 2 d；M-CSF+RANKL+100 ng/mL LPS 組：采用含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL 的完全培養基培養 3 d 后，更換為含 30 ng/mL M-CSF+20 ng/mL RANKL+100 ng/mL LPS 的完全培養基繼續培養 2 d。培養期間每 2 天更換培養基。

1.6.2 破骨細胞骨吸收瘢痕觀察

取 4 組細胞，用 10% 次氯酸鈉洗去破骨細胞，再用去離子水清洗 3 次。室溫晾干后，于 4 倍鏡下采集圖片。淺色的不規則區域為破骨細胞骨吸收所形成的吸收瘢痕，用 Image J 軟件測算骨吸收面積百分比（骨吸收瘢痕面積/視野面積×100%）。

1.7 統計學方法

采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 法；檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 BMMs 形態觀察及鑒定

鏡下觀察 BMMs 呈長梭形，偽足細長（圖 1a）。流式細胞儀鑒定示 CD11b 陽性細胞達 98.6%，提示培養的細胞為 BMMs（圖 1b）。

圖1 BMMs 形態觀察及 CD11b 鑒定

a. BMMs 細胞形態觀察（×4）；b. 流式細胞儀鑒定表面特異性抗原 CD11b

Figure1. BMMs morphological observation and identification of CD11b

a. Observation of BMMs morphology(×4); b. Identification of surface specific antigen CD11b by flow cytometry

圖選項

1.	Karsenty G. The complexities of skeletal biology. Nature, 2003, 423(6937): 316-318.
2.	Zeng XZ, He LG, Wang S, et al. Aconine inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation in RAW264.7 cells by suppressing NF-κB and NFATc1 activation and DC-STAMP expression. Acta Pharmacol Sin, 2016, 37(2): 255-263.
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4.	Zhao N, Tsuda H, Murofushi T, et al. Chaetocin inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation through reduction of Blimp1 in Raw264.7 cells. Life Sci, 2015, 143: 1-7.
5.	Choe JY, Kim SK. Melittin inhibits osteoclast formation through the downregulation of the RANKL-RANK signaling pathway and the inhibition of interleukin-1β in murine macrophages. Int J Mol Med, 2017, 39(3): 539-548.
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《中國修復重建外科雜志》

脂多糖對破骨細胞生成及骨吸收功能作用及其機制研究

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

1.2 BMMs 分離、培養及鑒定

1.2.1 BMMs 分離及培養

1.2.2 BMMs 鑒定

1.3 不同濃度 LPS 對細胞活性的影響

1.4 LPS 誘導破骨細胞生成觀察

1.4.1 細胞分組及方法

1.4.2 TRAP 染色觀察

1.5 LPS 對 Connexin43 表達的影響觀察

1.5.1 對 Connexin43 蛋白表達的影響

1.5.2 對 Connexin43 基因表達的影響

1.6 LPS 對破骨細胞骨吸收能力的影響

1.6.1 細胞分組及方法

1.6.2 破骨細胞骨吸收瘢痕觀察

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 BMMs 形態觀察及鑒定

2.2 不同濃度 LPS 對細胞活性的影響

2.3 LPS 誘導破骨細胞生成觀察

2.4 LPS 對 Connexin43 表達的影響觀察

2.5 LPS 對破骨細胞骨吸收能力的影響

3 討論

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

1.2 BMMs 分離、培養及鑒定

1.2.1 BMMs 分離及培養

1.2.2 BMMs 鑒定

1.3 不同濃度 LPS 對細胞活性的影響

1.4 LPS 誘導破骨細胞生成觀察

1.4.1 細胞分組及方法

1.4.2 TRAP 染色觀察

1.5 LPS 對 Connexin43 表達的影響觀察

1.5.1 對 Connexin43 蛋白表達的影響

1.5.2 對 Connexin43 基因表達的影響

1.6 LPS 對破骨細胞骨吸收能力的影響

1.6.1 細胞分組及方法

1.6.2 破骨細胞骨吸收瘢痕觀察

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 BMMs 形態觀察及鑒定

2.2 不同濃度 LPS 對細胞活性的影響

2.3 LPS 誘導破骨細胞生成觀察

2.4 LPS 對 Connexin43 表達的影響觀察

2.5 LPS 對破骨細胞骨吸收能力的影響

3 討論

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