引用本文： 陳家磊, 劉明, 段鑫, 黃富國, 項舟. BMP-7/聚乳酸-羥基乙酸共聚物緩釋微球對兔 BMSCs 增殖和成軟骨分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(4): 428-433. doi: 10.7507/1002-1892.201711093 復制
關節疾病主要表現在軟骨的病變，由于關節軟骨的營養主要靠關節液滲透供給，所以軟骨損傷很難自身痊愈[1]。組織工程技術利用干細胞經體外培養，在含有生長因子的營養環境下被種植到具有生物相容性的三維支架上，再將細胞-支架復合體移植到體內，在生長因子的促進下，干細胞擴增并向軟骨細胞分化，最終形成新的軟骨結構，從而修復軟骨缺損[2]。但單純生長因子在體內半衰期短，容易被蛋白酶降解，對于較大骨缺損，生長因子不能持續發揮作用，即在有效時間內無法作用于更多靶細胞，從而影響其體內功效[3]。解決方案之一是緩釋微球載負生長因子，持續釋放生長因子促使種子細胞分化。但是，目前研究微球緩釋的生長因子大多作用于成骨細胞或成軟骨細胞，而對于緩釋微球對上述細胞的前體細胞，如 BMSCs 的影響缺乏相應研究。因此，本實驗通過體外實驗探討載負 BMP-7 的聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］緩釋微球對兔 BMSCs 增殖和向軟骨細胞方向分化的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～5 日齡新西蘭乳兔 4 只，雌雄不限，體質量 150～200 g，由四川大學華西醫院動物實驗中心提供。
PLGA（85∶15；上海博泰生物科技有限公司）；軟骨分化培養基［含 0.001% 地塞米松、0.03% 抗壞血酸、1%ITS（胰島素-轉鐵蛋白-硒）、0.01% 丙酮酸鈉、0.01% 脯氨酸、1%TGF-β3 的 H-DMEM 培養基；Cyagen 公司，美國］；番紅 O 試劑盒、甲苯胺藍試劑盒、Ⅱ型膠原免疫組織化學試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；生物技術級牛血清白蛋白（Biotoped 公司，美國）；鼠抗兔Ⅱ型膠原抗體（Merck 公司，德國）；二氯甲烷、丙酮（天津富宇精細化工有限公司）。5702 型離心機（Eppendorf 公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；冷凍干燥機（Labconco 公司，美國）；酶標儀（Tecan 公司，奧地利）；超聲波破碎儀（Dr. Hielscher 公司，德國）。
1.2 BMP-7/PLGA 緩釋微球的制備
參照文獻［4］介紹的復乳化-液中干燥法制備 BMP-7/PLGA 緩釋微球。具體方法：將 10 μg BMP-7 加入 20 mL 生理鹽水中，4℃ 下溶解，抽取 0.1 mL 上述液體加入生理鹽水至 1 mL，加入 100 mg 牛血清白蛋白作為內水相；室溫條件下將 100 mg PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷∶丙酮混合溶液（體積比為 3∶1）中作為油相；1% 聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）水溶液作為外水相。將 100 μL 內水相逐滴滴入油相中，超聲乳化 25 s（強度 30%）形成初乳；將初乳逐滴滴入 25 mL 外水相中，4℃ 磁力攪拌揮發 4 h 形成復乳；將復乳倒入離心管中，以離心半徑 25 cm、3 500 r/min 離心 5 min，去離子水洗滌后再次離心，反復操作 4 遍，直至清除多余 PVA。將樣品–20℃ 冷凍保存 48 h，冷凍干燥 24 h，收集緩釋微球粉末待用。
1.3 BMP-7/PLGA 緩釋微球體外釋放液的制備
分析天平稱取 10 份 10 mg BMP-7/PLGA 緩釋微球粉末，分別置于 10 個 5 mL 玻璃瓶中，無菌膜包裹后立即經 60Co γ 射線輻照滅菌（劑量 20 kGy，時間 9.5 h）后，加入至 20 mL 軟骨分化培養基中，置于 37℃ 恒溫搖床中以 50 r/min 振蕩，分別于第 1、3、7、14、21 天收集上清液作為體外釋放液（記為體外釋放液 a、b、c、d、e），–20℃ 保存備用。
1.4 BMSCs 分離培養及實驗分組
取 3～5 日齡新西蘭乳兔雙側股骨及脛骨，按照文獻［5］方法進行 BMSCs 的分離、傳代、培養。取第 3 代 BMSCs 以 1×104個/孔密度接種于 96 孔板，每孔 200 μL，在含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基中培養 24 h 后分為微球組和對照組。微球組在每 2～3 天換液過程中更換為 200 μL 不同時間點的 BMP-7/PLGA 緩釋微球體外釋放液，對照組使用等體積軟骨分化培養基。其中，微球組培養 1 d 時使用體外釋放液 a，3、5 d 時使用體外釋放液 b，7、9、11 d 時使用體外釋放液 c，14、16、19 d 時使用體外釋放液 d，21 d 時使用體外釋放液 e。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞增殖能力測定
采用 MTT 法檢測兩組細胞增殖能力。分別于培養 1、3、7、14、21 d 后加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，37℃、5%CO2、95% 濕度培養箱連續孵育 4 h；終止培養后棄除孔內上清液，加入 DMSO 150 μL，振蕩 10 min 使結晶物充分溶解；酶標儀上測定各孔 490 nm 波長處吸光度（A）值。
1.5.2 成軟骨細胞分化能力測定
① 組織學及免疫組織化學染色觀察：培養 21 d 后取出兩組細胞，常規行番紅 O 染色、甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，倒置相差顯微鏡下觀察。② 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量檢測：分別取兩組細胞在 1、3、7、14、21 d 換液時的培養液 100 μL，加入至含 1.5 mL 1.5% 阿利新藍染液的試管內，室溫放置 10 min，酶標儀在 490 nm 波長下進行比色，測其 A 值。以硫酸軟骨素制作標準對照曲線，計算出兩組各時間點培養液內 GAG 含量。
1.6 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞增殖能力測定
培養 1、3、7 d，兩組細胞均迅速增殖；7 d 后對照組增殖速度變緩，微球組仍呈持續快速增殖。培養 1、3、7 d 兩組 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）；14、21 d 微球組A 值顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
2.2 成軟骨細胞分化能力測定
2.2.1 組織學及免疫組織化學染色
培養 21 d，番紅 O 染色示，微球組幾乎所有細胞核被染成紅色，而對照組僅有部分細胞核為紅色。甲苯胺藍染色示，微球組幾乎所有細胞核出現異染性紫紅色，部分細胞核甚至出現藍色；而對照組僅有部分細胞核異染，極少數細胞核為藍色。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，微球組絕大多數細胞核呈黃色或棕黃色，Ⅱ型膠原表達為強陽性，部分細胞周圍也可見弱陽性表達；而對照組僅有部分細胞為弱陽性表達，細胞周圍也無陽性表達。見圖 2。
2.2.2 GAG 含量檢測
培養各時間點兩組細胞 GAG 含量均呈持續增高趨勢，7 d 后對照組增高趨勢減緩，微球組仍呈持續高分泌狀態。培養 1、3、7 d 兩組 GAG 含量比較差異無統計學意義（P>0.05）；14、21 d 微球組 GAG 含量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖1
MTT 法檢測兩組細胞增殖情況
Figure1.
The cell proliferation of 2 groups detected by MTT assay
圖2
培養 21 d 兩組細胞組織學和免疫組織化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 微球組番紅 O 染色；b. 對照組番紅 O 染色；c. 微球組甲苯胺藍染色；d. 對照組甲苯胺藍染色；e. 微球組Ⅱ型膠原免疫組織化學染色；f. 對照組Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
Figure2. Histological and immunohistological staining of chondro inducted BMSCs in 2 groups (Inverted phase contrast microscope×100)a. Safranine O staining in microsphere group; b. Safranine O staining in control group; c. Toluidine blue staining in microsphere group; d. Toluidine blue staining in control group; e. Collagen type Ⅱ immunohistological staining in microsphere group; f. Collagen type Ⅱ immunohistological staining in control group
圖3
培養各時間點兩組細胞 GAG 含量比較
Figure3.
Comparison of GAG content between 2 groups at diffe rent time points
3 討論
研究發現單純生長因子在體內半衰期短，容易被蛋白酶降解，對于較大的骨缺損，生長因子在有效時間內無法作用于更多靶細胞，從而限制了臨床應用[6-7]。因此需要研究在現有支架基礎上引入生長因子緩釋系統。目前主要思路有 2 點：① 生長因子基因轉染種子細胞使其不斷分泌有活性的生長因子，進而促使種子細胞分化[6]；② 緩釋微球載負生長因子，持續釋放生長因子促使種子細胞分化[8-9]。對于第 2 種方式，學者們展開了深入研究。微球是指直徑 10～40 μm 的微小顆粒，這一概念由 van Wezel 于 1967 年提出[10]。我們的前期實驗利用復乳化-液中干燥法制備 BMP-7/PLGA 緩釋微球，結果顯示成球良好，球體表面光滑致密，粒徑為（14.45±5.97）μm，符合微球的定義。所以在體外采用復乳化-液中干燥法制備緩釋微球是可行的。
微球在軟骨組織工程中的應用具備眾多優勢。第一，細胞擴增是組織工程中必不可少的組成部分[11]。本研究 MTT 檢測發現微球組的兔 BMSCs 持續快速增殖，在培養 7 d 內不僅保持較高增長率，同時在培養 14、21 d 后 A 值顯著高于對照組，提示微球組中培養細胞所使用的體外釋放液比對照組中所使用的軟骨分化培養基能更好地促進細胞增殖。本實驗不足之一是未研究該微球體外釋放液的成分，故而促進細胞增殖的原理尚不清楚。但根據預實驗中我們采用檢測牛血清白蛋白含量以間接評估 BMP-7/PLGA 緩釋微球載藥量及包封率，并計算累積釋藥百分數、繪制釋放曲線顯示，緩釋微球系統細胞增殖的促進作用可能與緩釋微球不斷釋放的 BMP-7 有關，這需要將來進一步設計實驗來證實。第二，微球可制備成支架，為細胞提供快速擴增所需的接近自然生長環境的三維空間，同時還能保持細胞的形態和功能[12-13]。Abdel-Fattah 等[14]使用熱力燒結法使 PLGA 和殼聚糖成為完整的微球支架，其中 PLGA 微球支架呈多孔狀，其孔徑大小、孔隙率甚至機械性質都類似于松質骨。第三，微球可以作為分散相植入連續相中，如固態聚合物或水凝膠中，可通過載負生物活性因子、改變孔隙率、機械強度或載細胞作用等，改善該合成物的理化性質和生物特性。有研究報道在聚氨酯支架中植入載負 BMP-2 的 PLGA 微球后，支架 BMP-2 的突釋率較無微球支架降低，BMP-2 釋放持續而穩定[15]。第四，作為載體的微球也可對生長因子的釋放實現準確控制，這一點對骨與軟骨的修復至關重要[16]。方法是通過對微球理化特性的修飾而改變微球的降解率，這樣就可以控制不同生長因子的緩釋曲線，從而實現不同生長因子的順序控釋。Richardson 等[17]使用不同修飾的 PLGA 微球分別載負 VEGF 和 PDGF，實現了兩種生長因子的順序控釋。另一方面，也有研究通過使用不同微球達到上述目的。Basmanav 等[18]分別利用聚（4-乙烯基嘧啶）微球和藻酸鹽微球載負 BMP-2 和 BMP-7，以實現這兩種生物活性因子的順序控釋。
目前研究微球控釋的生長因子大多作用于成骨細胞或成軟骨細胞。如 Niu 等[19]制備載負 BMP-2 的殼聚糖微球，并研究其緩釋效應及成骨活性，結果證實微球支架釋放良好并可使成骨細胞 ALP 活性明顯升高。Lee 等[20]用乳化交聯法制備 TGF-β/殼聚糖微球后使其與軟骨細胞共培養，結果表明軟骨細胞分泌黏多糖含量明顯增高。但是，目前軟骨再生的流行策略之一是植入無細胞的工程化支架，將軟骨下骨中的 BMSCs 作為種子細胞，通過生長因子誘導分化為軟骨細胞[21]。目前對于控釋微球對 BMSCs 向成骨、成軟骨、成脂方向分化的影響缺乏相應研究。本研究對兩組兔 BMSCs 成軟骨細胞分化能力進行測定，培養 21 d 后番紅 O 染色顯示，微球組幾乎所有細胞核被染成紅色，而對照組僅有部分細胞核為紅色。甲苯胺藍染色示，微球組幾乎所有細胞核出現異染性紫紅色，部分細胞核甚至出現藍色；而對照組僅有部分細胞核異染，極少數細胞核為藍色。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，微球組絕大多數細胞核呈黃色或棕黃色，Ⅱ型膠原表達為強陽性，部分細胞周圍也可見弱陽性表達；而對照組僅有部分細胞為弱陽性表達，細胞周圍也無陽性表達。說明與對照組相比，微球組中 BMSCs 分泌Ⅱ型膠原和糖胺多糖等軟骨細胞特異蛋白的能力更持續，BMSCs 向軟骨細胞分化的趨勢更明顯，BMP-7/PLGA 緩釋微球的促軟骨細胞分化作用更好。另一方面，與其促細胞增殖作用類似，通過本實驗 BMP-7/PLGA 緩釋微球的促軟骨細胞分化作用是否由緩釋微球中不斷釋放的 BMP-7 所致，結論尚不明確，仍需進一步設計實驗來證實。
綜上述，復乳化-液中干燥法制備的 BMP-7/PLGA 緩釋微球在體外可更好地促進兔 BMSCs 增殖，同時也更好地促使兔 BMSCs 持續分泌Ⅱ型膠原和糖胺多糖等軟骨細胞特異蛋白，具有促進兔 BMSCs 向軟骨細胞分化的能力，可作為生長因子的載體用于進一步研究中。
關節疾病主要表現在軟骨的病變，由于關節軟骨的營養主要靠關節液滲透供給，所以軟骨損傷很難自身痊愈[1]。組織工程技術利用干細胞經體外培養，在含有生長因子的營養環境下被種植到具有生物相容性的三維支架上，再將細胞-支架復合體移植到體內，在生長因子的促進下，干細胞擴增并向軟骨細胞分化，最終形成新的軟骨結構，從而修復軟骨缺損[2]。但單純生長因子在體內半衰期短，容易被蛋白酶降解，對于較大骨缺損，生長因子不能持續發揮作用，即在有效時間內無法作用于更多靶細胞，從而影響其體內功效[3]。解決方案之一是緩釋微球載負生長因子，持續釋放生長因子促使種子細胞分化。但是，目前研究微球緩釋的生長因子大多作用于成骨細胞或成軟骨細胞，而對于緩釋微球對上述細胞的前體細胞，如 BMSCs 的影響缺乏相應研究。因此，本實驗通過體外實驗探討載負 BMP-7 的聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］緩釋微球對兔 BMSCs 增殖和向軟骨細胞方向分化的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～5 日齡新西蘭乳兔 4 只，雌雄不限，體質量 150～200 g，由四川大學華西醫院動物實驗中心提供。
PLGA（85∶15；上海博泰生物科技有限公司）；軟骨分化培養基［含 0.001% 地塞米松、0.03% 抗壞血酸、1%ITS（胰島素-轉鐵蛋白-硒）、0.01% 丙酮酸鈉、0.01% 脯氨酸、1%TGF-β3 的 H-DMEM 培養基；Cyagen 公司，美國］；番紅 O 試劑盒、甲苯胺藍試劑盒、Ⅱ型膠原免疫組織化學試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；生物技術級牛血清白蛋白（Biotoped 公司，美國）；鼠抗兔Ⅱ型膠原抗體（Merck 公司，德國）；二氯甲烷、丙酮（天津富宇精細化工有限公司）。5702 型離心機（Eppendorf 公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；冷凍干燥機（Labconco 公司，美國）；酶標儀（Tecan 公司，奧地利）；超聲波破碎儀（Dr. Hielscher 公司，德國）。
1.2 BMP-7/PLGA 緩釋微球的制備
參照文獻［4］介紹的復乳化-液中干燥法制備 BMP-7/PLGA 緩釋微球。具體方法：將 10 μg BMP-7 加入 20 mL 生理鹽水中，4℃ 下溶解，抽取 0.1 mL 上述液體加入生理鹽水至 1 mL，加入 100 mg 牛血清白蛋白作為內水相；室溫條件下將 100 mg PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷∶丙酮混合溶液（體積比為 3∶1）中作為油相；1% 聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）水溶液作為外水相。將 100 μL 內水相逐滴滴入油相中，超聲乳化 25 s（強度 30%）形成初乳；將初乳逐滴滴入 25 mL 外水相中，4℃ 磁力攪拌揮發 4 h 形成復乳；將復乳倒入離心管中，以離心半徑 25 cm、3 500 r/min 離心 5 min，去離子水洗滌后再次離心，反復操作 4 遍，直至清除多余 PVA。將樣品–20℃ 冷凍保存 48 h，冷凍干燥 24 h，收集緩釋微球粉末待用。
1.3 BMP-7/PLGA 緩釋微球體外釋放液的制備
分析天平稱取 10 份 10 mg BMP-7/PLGA 緩釋微球粉末，分別置于 10 個 5 mL 玻璃瓶中，無菌膜包裹后立即經 60Co γ 射線輻照滅菌（劑量 20 kGy，時間 9.5 h）后，加入至 20 mL 軟骨分化培養基中，置于 37℃ 恒溫搖床中以 50 r/min 振蕩，分別于第 1、3、7、14、21 天收集上清液作為體外釋放液（記為體外釋放液 a、b、c、d、e），–20℃ 保存備用。
1.4 BMSCs 分離培養及實驗分組
取 3～5 日齡新西蘭乳兔雙側股骨及脛骨，按照文獻［5］方法進行 BMSCs 的分離、傳代、培養。取第 3 代 BMSCs 以 1×104個/孔密度接種于 96 孔板，每孔 200 μL，在含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基中培養 24 h 后分為微球組和對照組。微球組在每 2～3 天換液過程中更換為 200 μL 不同時間點的 BMP-7/PLGA 緩釋微球體外釋放液，對照組使用等體積軟骨分化培養基。其中，微球組培養 1 d 時使用體外釋放液 a，3、5 d 時使用體外釋放液 b，7、9、11 d 時使用體外釋放液 c，14、16、19 d 時使用體外釋放液 d，21 d 時使用體外釋放液 e。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞增殖能力測定
采用 MTT 法檢測兩組細胞增殖能力。分別于培養 1、3、7、14、21 d 后加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，37℃、5%CO2、95% 濕度培養箱連續孵育 4 h；終止培養后棄除孔內上清液，加入 DMSO 150 μL，振蕩 10 min 使結晶物充分溶解；酶標儀上測定各孔 490 nm 波長處吸光度（A）值。
1.5.2 成軟骨細胞分化能力測定
① 組織學及免疫組織化學染色觀察：培養 21 d 后取出兩組細胞，常規行番紅 O 染色、甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，倒置相差顯微鏡下觀察。② 糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量檢測：分別取兩組細胞在 1、3、7、14、21 d 換液時的培養液 100 μL，加入至含 1.5 mL 1.5% 阿利新藍染液的試管內，室溫放置 10 min，酶標儀在 490 nm 波長下進行比色，測其 A 值。以硫酸軟骨素制作標準對照曲線，計算出兩組各時間點培養液內 GAG 含量。
1.6 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞增殖能力測定
培養 1、3、7 d，兩組細胞均迅速增殖；7 d 后對照組增殖速度變緩，微球組仍呈持續快速增殖。培養 1、3、7 d 兩組 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）；14、21 d 微球組A 值顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
2.2 成軟骨細胞分化能力測定
2.2.1 組織學及免疫組織化學染色
培養 21 d，番紅 O 染色示，微球組幾乎所有細胞核被染成紅色，而對照組僅有部分細胞核為紅色。甲苯胺藍染色示，微球組幾乎所有細胞核出現異染性紫紅色，部分細胞核甚至出現藍色；而對照組僅有部分細胞核異染，極少數細胞核為藍色。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，微球組絕大多數細胞核呈黃色或棕黃色，Ⅱ型膠原表達為強陽性，部分細胞周圍也可見弱陽性表達；而對照組僅有部分細胞為弱陽性表達，細胞周圍也無陽性表達。見圖 2。
2.2.2 GAG 含量檢測
培養各時間點兩組細胞 GAG 含量均呈持續增高趨勢，7 d 后對照組增高趨勢減緩，微球組仍呈持續高分泌狀態。培養 1、3、7 d 兩組 GAG 含量比較差異無統計學意義（P>0.05）；14、21 d 微球組 GAG 含量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖1
MTT 法檢測兩組細胞增殖情況
Figure1.
The cell proliferation of 2 groups detected by MTT assay
圖2
培養 21 d 兩組細胞組織學和免疫組織化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 微球組番紅 O 染色；b. 對照組番紅 O 染色；c. 微球組甲苯胺藍染色；d. 對照組甲苯胺藍染色；e. 微球組Ⅱ型膠原免疫組織化學染色；f. 對照組Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
Figure2. Histological and immunohistological staining of chondro inducted BMSCs in 2 groups (Inverted phase contrast microscope×100)a. Safranine O staining in microsphere group; b. Safranine O staining in control group; c. Toluidine blue staining in microsphere group; d. Toluidine blue staining in control group; e. Collagen type Ⅱ immunohistological staining in microsphere group; f. Collagen type Ⅱ immunohistological staining in control group
圖3
培養各時間點兩組細胞 GAG 含量比較
Figure3.
Comparison of GAG content between 2 groups at diffe rent time points
3 討論
研究發現單純生長因子在體內半衰期短，容易被蛋白酶降解，對于較大的骨缺損，生長因子在有效時間內無法作用于更多靶細胞，從而限制了臨床應用[6-7]。因此需要研究在現有支架基礎上引入生長因子緩釋系統。目前主要思路有 2 點：① 生長因子基因轉染種子細胞使其不斷分泌有活性的生長因子，進而促使種子細胞分化[6]；② 緩釋微球載負生長因子，持續釋放生長因子促使種子細胞分化[8-9]。對于第 2 種方式，學者們展開了深入研究。微球是指直徑 10～40 μm 的微小顆粒，這一概念由 van Wezel 于 1967 年提出[10]。我們的前期實驗利用復乳化-液中干燥法制備 BMP-7/PLGA 緩釋微球，結果顯示成球良好，球體表面光滑致密，粒徑為（14.45±5.97）μm，符合微球的定義。所以在體外采用復乳化-液中干燥法制備緩釋微球是可行的。
微球在軟骨組織工程中的應用具備眾多優勢。第一，細胞擴增是組織工程中必不可少的組成部分[11]。本研究 MTT 檢測發現微球組的兔 BMSCs 持續快速增殖，在培養 7 d 內不僅保持較高增長率，同時在培養 14、21 d 后 A 值顯著高于對照組，提示微球組中培養細胞所使用的體外釋放液比對照組中所使用的軟骨分化培養基能更好地促進細胞增殖。本實驗不足之一是未研究該微球體外釋放液的成分，故而促進細胞增殖的原理尚不清楚。但根據預實驗中我們采用檢測牛血清白蛋白含量以間接評估 BMP-7/PLGA 緩釋微球載藥量及包封率，并計算累積釋藥百分數、繪制釋放曲線顯示，緩釋微球系統細胞增殖的促進作用可能與緩釋微球不斷釋放的 BMP-7 有關，這需要將來進一步設計實驗來證實。第二，微球可制備成支架，為細胞提供快速擴增所需的接近自然生長環境的三維空間，同時還能保持細胞的形態和功能[12-13]。Abdel-Fattah 等[14]使用熱力燒結法使 PLGA 和殼聚糖成為完整的微球支架，其中 PLGA 微球支架呈多孔狀，其孔徑大小、孔隙率甚至機械性質都類似于松質骨。第三，微球可以作為分散相植入連續相中，如固態聚合物或水凝膠中，可通過載負生物活性因子、改變孔隙率、機械強度或載細胞作用等，改善該合成物的理化性質和生物特性。有研究報道在聚氨酯支架中植入載負 BMP-2 的 PLGA 微球后，支架 BMP-2 的突釋率較無微球支架降低，BMP-2 釋放持續而穩定[15]。第四，作為載體的微球也可對生長因子的釋放實現準確控制，這一點對骨與軟骨的修復至關重要[16]。方法是通過對微球理化特性的修飾而改變微球的降解率，這樣就可以控制不同生長因子的緩釋曲線，從而實現不同生長因子的順序控釋。Richardson 等[17]使用不同修飾的 PLGA 微球分別載負 VEGF 和 PDGF，實現了兩種生長因子的順序控釋。另一方面，也有研究通過使用不同微球達到上述目的。Basmanav 等[18]分別利用聚（4-乙烯基嘧啶）微球和藻酸鹽微球載負 BMP-2 和 BMP-7，以實現這兩種生物活性因子的順序控釋。
目前研究微球控釋的生長因子大多作用于成骨細胞或成軟骨細胞。如 Niu 等[19]制備載負 BMP-2 的殼聚糖微球，并研究其緩釋效應及成骨活性，結果證實微球支架釋放良好并可使成骨細胞 ALP 活性明顯升高。Lee 等[20]用乳化交聯法制備 TGF-β/殼聚糖微球后使其與軟骨細胞共培養，結果表明軟骨細胞分泌黏多糖含量明顯增高。但是，目前軟骨再生的流行策略之一是植入無細胞的工程化支架，將軟骨下骨中的 BMSCs 作為種子細胞，通過生長因子誘導分化為軟骨細胞[21]。目前對于控釋微球對 BMSCs 向成骨、成軟骨、成脂方向分化的影響缺乏相應研究。本研究對兩組兔 BMSCs 成軟骨細胞分化能力進行測定，培養 21 d 后番紅 O 染色顯示，微球組幾乎所有細胞核被染成紅色，而對照組僅有部分細胞核為紅色。甲苯胺藍染色示，微球組幾乎所有細胞核出現異染性紫紅色，部分細胞核甚至出現藍色；而對照組僅有部分細胞核異染，極少數細胞核為藍色。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，微球組絕大多數細胞核呈黃色或棕黃色，Ⅱ型膠原表達為強陽性，部分細胞周圍也可見弱陽性表達；而對照組僅有部分細胞為弱陽性表達，細胞周圍也無陽性表達。說明與對照組相比，微球組中 BMSCs 分泌Ⅱ型膠原和糖胺多糖等軟骨細胞特異蛋白的能力更持續，BMSCs 向軟骨細胞分化的趨勢更明顯，BMP-7/PLGA 緩釋微球的促軟骨細胞分化作用更好。另一方面，與其促細胞增殖作用類似，通過本實驗 BMP-7/PLGA 緩釋微球的促軟骨細胞分化作用是否由緩釋微球中不斷釋放的 BMP-7 所致，結論尚不明確，仍需進一步設計實驗來證實。
綜上述，復乳化-液中干燥法制備的 BMP-7/PLGA 緩釋微球在體外可更好地促進兔 BMSCs 增殖，同時也更好地促使兔 BMSCs 持續分泌Ⅱ型膠原和糖胺多糖等軟骨細胞特異蛋白，具有促進兔 BMSCs 向軟骨細胞分化的能力，可作為生長因子的載體用于進一步研究中。
