引用本文： 王林楠, 汪雷, 宋躍明, 劉立岷, 楊曦, 豐干均, 周春光. 慢病毒介導 NEP1-40 及 NT-3 雙基因轉染神經干細胞的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(4): 420-427. doi: 10.7507/1002-1892.201710079 復制
神經干細胞（neural stem cells，NSCs）移植作為脊髓損傷的治療方式，具有廣闊前景[1]。相關研究已證實，NSCs 移植在一定程度上能促進神經功能的修復[2-3]。然而，單純 NSCs 移植也存在諸多限制，如移植細胞存活率低下、局部微環境中 Nogo 蛋白使軸突形成受抑制等[4-5]。研究表明 NEP1-40（Nogo extracellular peptide residues 1-40）多肽可競爭性與 Nogo 受體結合，從而拮抗 Nogo-66 對軸突生長的抑制作用[6]，但對于 NSCs 移植后的分化無明顯誘導作用，且對于軸突的生長缺乏必要的營養作用。而神經營養因子 3（neurotrophin 3，NT-3）能夠促進固有神經元的存活和分化，對于再生的神經元和突觸的生長和分化也有促進作用[7-8]。NT-3 基因的以上優勢正好彌補了 NEP1-40 基因的不足。本實驗擬從基因工程方面，將 NT-3 基因和 NEP1-40 基因通過慢病毒載體同時導入 NSCs，檢測轉染率及目的基因表達情況，為基因干細胞移植治療研究提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
NSCs 培養基（NeuroCult? NS-A Basal Medium）、EGF、bFGF（StemCell 公司，美國）；Power SYBRTM Green Cells-to-CTTM試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；Western blot ECL 化學發光檢測試劑盒（上海索萊寶生物科技有限公司）；NEP1-40 基因慢病毒表達載體及 NT-3 基因慢病毒表達載體為本實驗室前期構建[9]；NSCs 為本實驗室前期采用改良培養法成功培養的 SD 大鼠室管膜區腦源性 NSCs[9]。CO2 細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；無菌操作臺（蘇州凈化設備有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI）及收樣時間確定
取生長狀態良好的第 3 代 NSCs 單細胞懸液，以每孔 1.5×105個/mL 密度接種至 24 孔板內，以含 20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF 的 NSCs 培養基進行培養。實驗分為 5 組，分別為 A 組［空載慢病毒轉染組，帶增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）綠色熒光標簽和 mCherry 紅色熒光標簽］、B 組［NEP1-40 慢病毒轉染組，帶 EGFP 綠色熒光標簽］、C 組（NT-3 慢病毒轉染組，帶 mCherry 紅色熒光標簽）、D 組（NEP1-40 和 NT-3 慢病毒共轉染組，帶 EGFP 和 mCherry 兩種熒光標簽）及 E 組（未轉染組）。細胞于 37℃、5%CO2 培養箱培養 4 h 后，各組孔內分別按 MOI 值為 5、10、15 加入不同慢病毒稀釋液 100 μL。10 h 后更換新鮮培養液，24 h 后重復轉染 1 次。分別于 24、48、72 h 后于熒光顯微鏡下觀察各組病毒轉染后的熒光細胞表達情況，確定最佳 MOI 及最佳收樣時間。
1.2.2 實時熒光定量 PCR 檢測轉染后 NSCs 中 NEP1-40 和 NT-3 mRNA 表達
取第 3 代 NSCs，用 NSCs 培養基重懸細胞，以每孔 1.2×106個/mL 密度接種至 6 孔板，37℃、5%CO2 培養箱中以含 20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF 的 NSCs 培養基進行培養。實驗分組同 1.2.1 的 A～D 組方法，細胞培養 4 h 后，各組孔內分別按最佳 MOI 值加入不同慢病毒稀釋液 100 μL；10 h 后半量換液，以后每 24 小時半量換液 1 次，于最佳收樣時間收集細胞。采用實時熒光定量 PCR 方法檢測各組 NEP1-40 和 NT-3 mRNA 表達情況。引物序列：NEP1-40 上游 5'-CTGCCCTATGCTCTGCACCT-3'，下游 5'-AAGAGCCACAGGGTGAGCAG-3'； NT-3 上游 5'-CGTGGCCATTGAACACAGCA-3'，下游 5'-CCCACTGGCGGGTAAGGAAA-3'。PCR 擴增后，實時熒光定量 PCR 儀自動分析結果，根據陰性對照調整閾值和基線以確定各標本的 Ct 值，并根據熔解曲線確定該 Ct 值是否有效。將結果導出，采用 2–ΔΔCt法分析目的基因相對表達量。
1.2.3 Western blot 檢測轉染后 NSCs 中 NEP1-40 和 NT-3 蛋白表達
細胞培養及實驗分組同 1.2.2。于最佳收樣時間收集各組 NSCs，以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 5 min 后，一方面取沉淀做超聲破碎處理，提取總蛋白；另一方面獲取細胞上清，三氯乙酸沉淀濃縮上清蛋白。配置 PAGE 凝膠，取每孔上樣量為 20 μg 蛋白進行電泳，當染料到達膠底部時停止電泳，進行轉膜。將蛋白移至聚偏二氟乙烯膜上，5% 牛血清白蛋白室溫封閉；將 NEP1-40（1∶1 000）、NT-3（1∶4 000）抗體（一抗）加入封閉液中稀釋至所需濃度，與膜 4℃ 孵育過夜；孵育一抗的膜用 TBST 洗滌 5 min×3 次；室溫下按照 1∶5 000 稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，與膜 37℃ 孵育 1 h，用 TBST 洗滌 5 min×3 次，采用化學發光儀進行掃描成像并行蛋白相對表達量定量分析。
1.3 統計學方法
用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 最佳 MOI 值及收樣時間確定
E 組在相同培養條件下未見明顯熒光；MOI 為 15 時，各組細胞狀態均很差，細胞死亡較多。MOI 為 5 和 10 時，A 組病毒轉染的熒光強度均高于 MOI 為 15 時；而 B、C、D 組在 MOI 為 10 時病毒轉染的熒光強度均明顯高于 MOI 為 5 或 15 時。因此確定 MOI=10 作為最佳 MOI 值。病毒轉染后 3 個時間點觀察發現，各組在轉染 48 h 時熒光強度相對高且細胞狀態較好，因此確定 48 h 作為最佳收樣時間。見圖 1～6。
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測轉染后 NSCs 中 NEP1-40 和 NT-3 mRNA 表達
A、B、C、D 組 NEP1-40 mRNA 相對表達量分別為 1.007±0.152、1 133.773±165.971、1.000±0.260、1 291.000±53.676。B、D 組 NEP1-40 mRNA 相對表達量顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
A、B、C、D 組 NT-3 mRNA 相對表達量分別為 1.004±0.114、1.151±0.138、3.226±0.262、3.159±0.350。C、D 組 NT-3 mRNA 相對表達量顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間及 C、D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3 Western blot 檢測轉染后 NEP1-40 和 NT-3 蛋白表達
各組均有熒光蛋白表達，說明基因轉染成功，并且可表達蛋白產物。B、D 組細胞及培養基中 NEP1-40 蛋白相對表達量均顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。C、D 組細胞及培養基中 NT-3 蛋白相對表達量均顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間及 C、D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 7，表 1。
表1
Western blot 檢測轉染后 48 h 各組 NEP1-40 和 NT-3 蛋白相對表達量
Table1.
Comparison of relative expressions of NEP1-40 and NT-3 proteins among 4 groups by Western blot detection
圖1
A 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 mCherry 紅色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure1. Expression of different MOI transduction cells in group A after mCherry red fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖2
A 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 EGFP 綠色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure2. Expression of different MOI transduction cells in group A after EGFP green fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖3
B 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 EGFP 綠色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure3. Expression of different MOI transduction cells in group B after EGFP green fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖4
C 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 mCherry 紅色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure4. Expression of different MOI transduction cells in group C after mCherry red fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖5
D 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 mCherry 紅色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure5. Expression of different MOI transduction cells in group D after mCherry red fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖6
D 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 EGFP 綠色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure6. Expression of different MOI transduction cells in group A after EGFP green fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖7
Western blot 檢測轉染后 48 h 各組 NEP1-40 和 NT-3 蛋白表達
1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 a. 細胞中 NEP1-40 表達；b. 細胞中 NT-3 蛋白表達；c. 培養基中 NEP1-40 蛋白表達；d. 培養基中 NT-3 蛋白表達
Figure7. NEP1-40 and NT-3 protein expressions of each group by Western blot detection at 48 hours after transduction1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D a. Intracellular NEP1-40 expression; b. Intracellular NT-3 expression; c. NEP1-40 expression in cell supernatant; d. NT-3 expression in cell supernatant
3 討論
研究顯示，NSCs 移植局部微環境中存在對軸突形成受抑制的因素[10]。相關抑制因素主要為以下 3 種：Nogo 蛋白、髓鞘相關性糖蛋白和硫酸軟骨蛋白多糖 versian 蛋白。自 2000 年 Nogo 基因序列被報道以來，Nogo 分子逐漸成為神經再生領域中研究的焦點[11]。Nogo 基因共有 3 個 mRNA 轉錄本，其所編碼蛋白質分別稱為 Nogo-A、Nogo-B 和 Nogo-C，這 3 種蛋白質在其羧基端存在一個由 66 個氨基酸殘基組成的結構完全相同的袢狀結構，被稱作 Nogo-66[12]。Nogo-66 與其下游受體分子信號復合物 NgR/P75NTR/Lingo-1 或 gR/Troy/Lingo-1 結合，啟動 Rho 信號傳導途徑可抑制中樞神經再生[13]。Atalay 等[6]通過研究顯示，合成的 NEP1-40 多肽可以拮抗 Nogo-66 對軸突生長的抑制作用；同時，相關研究在腦損傷及脊髓損傷動物模型中進行驗證，結果顯示 NEP1-40 能夠顯著促進神經再生和功能恢復[14-15]。由于上述研究中所使用的 NEP1-40 都是經化學合成，其成本較高，且很難通過血腦屏障、血脊屏障等結構，故我們設計將攜帶 NEP1-40 基因修飾的 NSCs 移植入脊髓損傷區域，以達到拮抗 Nogo 蛋白對軸突生長的移植作用。
我們的前期研究通過慢病毒載體將 NEP1-40 基因轉入 NSCs 內表達，結果證實其成功轉染 NSCs，并在 NSCs 內穩定表達[16]。前期動物實驗也證實 NEP1-40 基因修飾的 NSCs 在大鼠脊髓半切模型中促進軸突生長及修復受損脊髓的效果優于單純 NSCs 移植[9]。但是也發現 NEP1-40 基因對于 NSCs 移植后的分化無明顯誘導作用，并不能提高分化產物中神經元及少突膠質細胞的比例[17]，同時其對于軸突的生長缺乏必要的營養作用。
20 世紀神經營養因子的發現為神經再生研究帶來了革命性進展。許多體外細胞實驗及動物體內實驗都表明，神經營養因子能夠增加軸突的再生活性。直接或間接注射神經營養因子、病毒介導的轉導或移植分泌神經營養因子的細胞都能取得一定效果，神經營養因子的使用還能明顯提高其他脊髓損傷治療方法的療效[18-19]。神經營養因子中運用最成功的是 NT-3，對于外周神經系統和中樞神經系統的神經元都有營養作用，它對于中樞神經系統的神經元營養作用十分明顯[20]。研究已證明 NT-3 的受體主要分布于脊髓的皮質脊髓束和大感覺神經元的軸突上，將 NT-3 作用于受損脊髓中能誘導明顯的皮質脊髓束軸突再生，增強皮質脊髓束的解剖可塑性，促進脊髓損傷后行為功能的恢復[7-8]。此外，NT-3 還能加強神經系統內其他細胞（如少突膠質細胞前體細胞）的存活和增殖，并能促進少突膠質細胞髓鞘化[21]。由于內源性 NT-3 在脊髓損傷后上調程度有限，而外源性 NT-3 半衰期短，且不易于通過血腦屏障和血脊屏障，無法在脊髓損傷區域達到有效濃度[22]。針對這一情況，有學者用神經營養因子基因轉染干細胞，使其持續分泌，提高干細胞存活并參與誘導分化。Zhang 等[23]利用 NT-3 基因轉染 NSCs 治療大鼠脊髓損傷模型，結果顯示損傷區域檢測到大量 NT-3 表達載體，大鼠運動功能也有部分恢復。
NT-3 基因的優勢很大程度上彌補了 NEP1-40 基因的不足，將 NT-3 基因和 NEP1-40 基因這兩個目的基因通過病毒載體同時導入 NSCs 內并移植至動物脊髓損傷區域，產生的 NT-3 和 NEP1-40 同時發揮作用，一方面可阻斷外源性的軸突再生抑制因素；另一方面能促進更多神經元生成并髓鞘化，更好地促進神經功能修復。既往研究已證實了兩種基因分別轉染 NSCs 的可行性，本實驗主要目的在于驗證兩種目的基因共同轉染 NSCs 的表達情況。首先在熒光顯微鏡下觀察兩種目的基因轉染 NSCs 后熒光表達情況，結果顯示各實驗組在不同 MOI 值情況下均有熒光顯示，提示轉染成功；攜帶兩種目的基因的慢病毒轉染 NSCs 的最佳 MOI 值為 10，48 h 為最佳收樣時間。
為進一步驗證轉染成功，本研究分別在核酸水平和蛋白質表達水平進行了實驗。實時熒光定量 PCR 結果表明，NEP1-40 和 NT-3 基因共轉染組兩種目的基因 mRNA 表達水平與單基因轉染組基本一致，說明兩種目的基因均成功轉染入 NSCs 內，兩種目的基因間無拮抗作用和相互促進作用。此外，通過 Western blot 檢測蛋白質表達和分泌水平，結果顯示，NSCs 能表達兩種目的基因編碼的蛋白，且在蛋白表達和分泌情況上，兩種基因無相互拮抗或促進作用。
綜上述，本實驗成功將 NEP1-40 和 NT-3 雙基因轉染入大鼠 NSCs 內，為 NSCs 體內實驗奠定了基礎，為臨床治療脊髓損傷提供了新的思路和實驗依據。但 NEP1-40 和 NT-3 基因轉染入細胞內后，其基因產物可能受到細胞內環境影響，因此其生物活性仍需進一步驗證。
神經干細胞（neural stem cells，NSCs）移植作為脊髓損傷的治療方式，具有廣闊前景[1]。相關研究已證實，NSCs 移植在一定程度上能促進神經功能的修復[2-3]。然而，單純 NSCs 移植也存在諸多限制，如移植細胞存活率低下、局部微環境中 Nogo 蛋白使軸突形成受抑制等[4-5]。研究表明 NEP1-40（Nogo extracellular peptide residues 1-40）多肽可競爭性與 Nogo 受體結合，從而拮抗 Nogo-66 對軸突生長的抑制作用[6]，但對于 NSCs 移植后的分化無明顯誘導作用，且對于軸突的生長缺乏必要的營養作用。而神經營養因子 3（neurotrophin 3，NT-3）能夠促進固有神經元的存活和分化，對于再生的神經元和突觸的生長和分化也有促進作用[7-8]。NT-3 基因的以上優勢正好彌補了 NEP1-40 基因的不足。本實驗擬從基因工程方面，將 NT-3 基因和 NEP1-40 基因通過慢病毒載體同時導入 NSCs，檢測轉染率及目的基因表達情況，為基因干細胞移植治療研究提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
NSCs 培養基（NeuroCult? NS-A Basal Medium）、EGF、bFGF（StemCell 公司，美國）；Power SYBRTM Green Cells-to-CTTM試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；Western blot ECL 化學發光檢測試劑盒（上海索萊寶生物科技有限公司）；NEP1-40 基因慢病毒表達載體及 NT-3 基因慢病毒表達載體為本實驗室前期構建[9]；NSCs 為本實驗室前期采用改良培養法成功培養的 SD 大鼠室管膜區腦源性 NSCs[9]。CO2 細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；無菌操作臺（蘇州凈化設備有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI）及收樣時間確定
取生長狀態良好的第 3 代 NSCs 單細胞懸液，以每孔 1.5×105個/mL 密度接種至 24 孔板內，以含 20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF 的 NSCs 培養基進行培養。實驗分為 5 組，分別為 A 組［空載慢病毒轉染組，帶增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）綠色熒光標簽和 mCherry 紅色熒光標簽］、B 組［NEP1-40 慢病毒轉染組，帶 EGFP 綠色熒光標簽］、C 組（NT-3 慢病毒轉染組，帶 mCherry 紅色熒光標簽）、D 組（NEP1-40 和 NT-3 慢病毒共轉染組，帶 EGFP 和 mCherry 兩種熒光標簽）及 E 組（未轉染組）。細胞于 37℃、5%CO2 培養箱培養 4 h 后，各組孔內分別按 MOI 值為 5、10、15 加入不同慢病毒稀釋液 100 μL。10 h 后更換新鮮培養液，24 h 后重復轉染 1 次。分別于 24、48、72 h 后于熒光顯微鏡下觀察各組病毒轉染后的熒光細胞表達情況，確定最佳 MOI 及最佳收樣時間。
1.2.2 實時熒光定量 PCR 檢測轉染后 NSCs 中 NEP1-40 和 NT-3 mRNA 表達
取第 3 代 NSCs，用 NSCs 培養基重懸細胞，以每孔 1.2×106個/mL 密度接種至 6 孔板，37℃、5%CO2 培養箱中以含 20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF 的 NSCs 培養基進行培養。實驗分組同 1.2.1 的 A～D 組方法，細胞培養 4 h 后，各組孔內分別按最佳 MOI 值加入不同慢病毒稀釋液 100 μL；10 h 后半量換液，以后每 24 小時半量換液 1 次，于最佳收樣時間收集細胞。采用實時熒光定量 PCR 方法檢測各組 NEP1-40 和 NT-3 mRNA 表達情況。引物序列：NEP1-40 上游 5'-CTGCCCTATGCTCTGCACCT-3'，下游 5'-AAGAGCCACAGGGTGAGCAG-3'； NT-3 上游 5'-CGTGGCCATTGAACACAGCA-3'，下游 5'-CCCACTGGCGGGTAAGGAAA-3'。PCR 擴增后，實時熒光定量 PCR 儀自動分析結果，根據陰性對照調整閾值和基線以確定各標本的 Ct 值，并根據熔解曲線確定該 Ct 值是否有效。將結果導出，采用 2–ΔΔCt法分析目的基因相對表達量。
1.2.3 Western blot 檢測轉染后 NSCs 中 NEP1-40 和 NT-3 蛋白表達
細胞培養及實驗分組同 1.2.2。于最佳收樣時間收集各組 NSCs，以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 5 min 后，一方面取沉淀做超聲破碎處理，提取總蛋白；另一方面獲取細胞上清，三氯乙酸沉淀濃縮上清蛋白。配置 PAGE 凝膠，取每孔上樣量為 20 μg 蛋白進行電泳，當染料到達膠底部時停止電泳，進行轉膜。將蛋白移至聚偏二氟乙烯膜上，5% 牛血清白蛋白室溫封閉；將 NEP1-40（1∶1 000）、NT-3（1∶4 000）抗體（一抗）加入封閉液中稀釋至所需濃度，與膜 4℃ 孵育過夜；孵育一抗的膜用 TBST 洗滌 5 min×3 次；室溫下按照 1∶5 000 稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，與膜 37℃ 孵育 1 h，用 TBST 洗滌 5 min×3 次，采用化學發光儀進行掃描成像并行蛋白相對表達量定量分析。
1.3 統計學方法
用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 最佳 MOI 值及收樣時間確定
E 組在相同培養條件下未見明顯熒光；MOI 為 15 時，各組細胞狀態均很差，細胞死亡較多。MOI 為 5 和 10 時，A 組病毒轉染的熒光強度均高于 MOI 為 15 時；而 B、C、D 組在 MOI 為 10 時病毒轉染的熒光強度均明顯高于 MOI 為 5 或 15 時。因此確定 MOI=10 作為最佳 MOI 值。病毒轉染后 3 個時間點觀察發現，各組在轉染 48 h 時熒光強度相對高且細胞狀態較好，因此確定 48 h 作為最佳收樣時間。見圖 1～6。
2.2 實時熒光定量 PCR 檢測轉染后 NSCs 中 NEP1-40 和 NT-3 mRNA 表達
A、B、C、D 組 NEP1-40 mRNA 相對表達量分別為 1.007±0.152、1 133.773±165.971、1.000±0.260、1 291.000±53.676。B、D 組 NEP1-40 mRNA 相對表達量顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
A、B、C、D 組 NT-3 mRNA 相對表達量分別為 1.004±0.114、1.151±0.138、3.226±0.262、3.159±0.350。C、D 組 NT-3 mRNA 相對表達量顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間及 C、D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3 Western blot 檢測轉染后 NEP1-40 和 NT-3 蛋白表達
各組均有熒光蛋白表達，說明基因轉染成功，并且可表達蛋白產物。B、D 組細胞及培養基中 NEP1-40 蛋白相對表達量均顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。C、D 組細胞及培養基中 NT-3 蛋白相對表達量均顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間及 C、D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 7，表 1。
表1
Western blot 檢測轉染后 48 h 各組 NEP1-40 和 NT-3 蛋白相對表達量
Table1.
Comparison of relative expressions of NEP1-40 and NT-3 proteins among 4 groups by Western blot detection
圖1
A 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 mCherry 紅色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure1. Expression of different MOI transduction cells in group A after mCherry red fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖2
A 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 EGFP 綠色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure2. Expression of different MOI transduction cells in group A after EGFP green fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖3
B 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 EGFP 綠色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure3. Expression of different MOI transduction cells in group B after EGFP green fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖4
C 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 mCherry 紅色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure4. Expression of different MOI transduction cells in group C after mCherry red fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖5
D 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 mCherry 紅色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure5. Expression of different MOI transduction cells in group D after mCherry red fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖6
D 組細胞各 MOI 值轉染后各時間點 EGFP 綠色熒光表達（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 MOI=5、10、15 a. 24 h；b. 48 h；c. 72 h
Figure6. Expression of different MOI transduction cells in group A after EGFP green fluorescent staining at different time points (Fluorescent microscope×100)From left to right for MOI=5, 10, 15 a. At 24 hours; b. At 48 hours; c. At 72 hours
圖7
Western blot 檢測轉染后 48 h 各組 NEP1-40 和 NT-3 蛋白表達
1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 a. 細胞中 NEP1-40 表達；b. 細胞中 NT-3 蛋白表達；c. 培養基中 NEP1-40 蛋白表達；d. 培養基中 NT-3 蛋白表達
Figure7. NEP1-40 and NT-3 protein expressions of each group by Western blot detection at 48 hours after transduction1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D a. Intracellular NEP1-40 expression; b. Intracellular NT-3 expression; c. NEP1-40 expression in cell supernatant; d. NT-3 expression in cell supernatant
3 討論
研究顯示，NSCs 移植局部微環境中存在對軸突形成受抑制的因素[10]。相關抑制因素主要為以下 3 種：Nogo 蛋白、髓鞘相關性糖蛋白和硫酸軟骨蛋白多糖 versian 蛋白。自 2000 年 Nogo 基因序列被報道以來，Nogo 分子逐漸成為神經再生領域中研究的焦點[11]。Nogo 基因共有 3 個 mRNA 轉錄本，其所編碼蛋白質分別稱為 Nogo-A、Nogo-B 和 Nogo-C，這 3 種蛋白質在其羧基端存在一個由 66 個氨基酸殘基組成的結構完全相同的袢狀結構，被稱作 Nogo-66[12]。Nogo-66 與其下游受體分子信號復合物 NgR/P75NTR/Lingo-1 或 gR/Troy/Lingo-1 結合，啟動 Rho 信號傳導途徑可抑制中樞神經再生[13]。Atalay 等[6]通過研究顯示，合成的 NEP1-40 多肽可以拮抗 Nogo-66 對軸突生長的抑制作用；同時，相關研究在腦損傷及脊髓損傷動物模型中進行驗證，結果顯示 NEP1-40 能夠顯著促進神經再生和功能恢復[14-15]。由于上述研究中所使用的 NEP1-40 都是經化學合成，其成本較高，且很難通過血腦屏障、血脊屏障等結構，故我們設計將攜帶 NEP1-40 基因修飾的 NSCs 移植入脊髓損傷區域，以達到拮抗 Nogo 蛋白對軸突生長的移植作用。
我們的前期研究通過慢病毒載體將 NEP1-40 基因轉入 NSCs 內表達，結果證實其成功轉染 NSCs，并在 NSCs 內穩定表達[16]。前期動物實驗也證實 NEP1-40 基因修飾的 NSCs 在大鼠脊髓半切模型中促進軸突生長及修復受損脊髓的效果優于單純 NSCs 移植[9]。但是也發現 NEP1-40 基因對于 NSCs 移植后的分化無明顯誘導作用，并不能提高分化產物中神經元及少突膠質細胞的比例[17]，同時其對于軸突的生長缺乏必要的營養作用。
20 世紀神經營養因子的發現為神經再生研究帶來了革命性進展。許多體外細胞實驗及動物體內實驗都表明，神經營養因子能夠增加軸突的再生活性。直接或間接注射神經營養因子、病毒介導的轉導或移植分泌神經營養因子的細胞都能取得一定效果，神經營養因子的使用還能明顯提高其他脊髓損傷治療方法的療效[18-19]。神經營養因子中運用最成功的是 NT-3，對于外周神經系統和中樞神經系統的神經元都有營養作用，它對于中樞神經系統的神經元營養作用十分明顯[20]。研究已證明 NT-3 的受體主要分布于脊髓的皮質脊髓束和大感覺神經元的軸突上，將 NT-3 作用于受損脊髓中能誘導明顯的皮質脊髓束軸突再生，增強皮質脊髓束的解剖可塑性，促進脊髓損傷后行為功能的恢復[7-8]。此外，NT-3 還能加強神經系統內其他細胞（如少突膠質細胞前體細胞）的存活和增殖，并能促進少突膠質細胞髓鞘化[21]。由于內源性 NT-3 在脊髓損傷后上調程度有限，而外源性 NT-3 半衰期短，且不易于通過血腦屏障和血脊屏障，無法在脊髓損傷區域達到有效濃度[22]。針對這一情況，有學者用神經營養因子基因轉染干細胞，使其持續分泌，提高干細胞存活并參與誘導分化。Zhang 等[23]利用 NT-3 基因轉染 NSCs 治療大鼠脊髓損傷模型，結果顯示損傷區域檢測到大量 NT-3 表達載體，大鼠運動功能也有部分恢復。
NT-3 基因的優勢很大程度上彌補了 NEP1-40 基因的不足，將 NT-3 基因和 NEP1-40 基因這兩個目的基因通過病毒載體同時導入 NSCs 內并移植至動物脊髓損傷區域，產生的 NT-3 和 NEP1-40 同時發揮作用，一方面可阻斷外源性的軸突再生抑制因素；另一方面能促進更多神經元生成并髓鞘化，更好地促進神經功能修復。既往研究已證實了兩種基因分別轉染 NSCs 的可行性，本實驗主要目的在于驗證兩種目的基因共同轉染 NSCs 的表達情況。首先在熒光顯微鏡下觀察兩種目的基因轉染 NSCs 后熒光表達情況，結果顯示各實驗組在不同 MOI 值情況下均有熒光顯示，提示轉染成功；攜帶兩種目的基因的慢病毒轉染 NSCs 的最佳 MOI 值為 10，48 h 為最佳收樣時間。
為進一步驗證轉染成功，本研究分別在核酸水平和蛋白質表達水平進行了實驗。實時熒光定量 PCR 結果表明，NEP1-40 和 NT-3 基因共轉染組兩種目的基因 mRNA 表達水平與單基因轉染組基本一致，說明兩種目的基因均成功轉染入 NSCs 內，兩種目的基因間無拮抗作用和相互促進作用。此外，通過 Western blot 檢測蛋白質表達和分泌水平，結果顯示，NSCs 能表達兩種目的基因編碼的蛋白，且在蛋白表達和分泌情況上，兩種基因無相互拮抗或促進作用。
綜上述，本實驗成功將 NEP1-40 和 NT-3 雙基因轉染入大鼠 NSCs 內，為 NSCs 體內實驗奠定了基礎，為臨床治療脊髓損傷提供了新的思路和實驗依據。但 NEP1-40 和 NT-3 基因轉染入細胞內后，其基因產物可能受到細胞內環境影響，因此其生物活性仍需進一步驗證。
