引用本文： 邵隴龍, 甄平, 馬永海, 鞏棟, 王云龍. 不同濃度耐甲氧西林金黃色葡萄球菌制備慢性骨髓炎模型對比研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(4): 412-419. doi: 10.7507/1002-1892.201711082 復制
慢性骨髓炎是急性化膿骨髓炎的延續，由于治療時清創不徹底、引流不暢導致病情反復發作，因伴隨不同程度長時間感染，抗生素耐藥，死骨形成，導致骨不連或骨不愈合，成為骨科臨床難題之一[1-3]。目前治療慢性骨髓炎的主要方法有手術清創、病灶切除、封閉式負壓引流及抗生素灌注等[4-6]，但療效欠佳，常需要多次手術及長期運用抗生素，甚至部分患者需要截肢治療，造成巨大身心及經濟負擔[7-8]。因此尋找一個有效治療慢性骨髓炎的方案相當必要。
建立穩定、高效的慢性骨髓炎動物模型，是對慢性骨髓炎實驗研究的重要保障[9]。臨床常見的慢性骨髓炎致病菌以金黃色葡萄球菌為主，但隨著抗生素的廣泛運用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）所致慢性骨髓炎發生率逐步上升[10]，故本實驗采用 MRSA 作為致病菌。在造模動物選擇上，因兔能較好地模擬人慢性骨髓炎發生過程，且手術操作較容易[11]，故本實驗選擇兔制備慢性骨髓炎動物模型。目前文獻報道使用的菌量不一致，細菌濃度過高容易導致動物死亡，過低達不到造模效果[12-14]。鑒于此，本實驗通過對兔股骨注射不同濃度 MRSA，評價其感染指標，為確定兔股骨慢性骨髓炎模型的最佳致病菌濃度提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
成年普通級新西蘭大白兔 48 只，雌雄不限，體質量 2.5～3.0 kg，由蘭州軍區總醫院實驗動物科提供。排除先天畸形、營養不良等疾病，自由飲水，標準飲食 ，于濕度 30%、室溫 25℃ 的清潔級實驗室單籠適應性飼養 2 周后進行實驗。
MRSA（由蘭州軍區總醫院檢驗科提供）；采用 DENSIMAT 比濁儀（BIOMERIEUX 公司，法國）將 MRSA 定量制備成濃度為 1×109 CFU/mL 的菌液，無菌生理鹽水分別稀釋為 1×108、1×107、1×106、1×105 CFU/mL 濃度的菌液，備用（4 h 內用完，防止細菌增殖及凋亡造成濃度差異過大）。
水合氯醛（天津光復精細化工研究所）；魚肝油酸鈉注射液（上海信誼金朱藥業股份有限公司）；兔 C 反應蛋白酶聯反應測定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。常規手術器械一套（江蘇施強醫療器械有限公司）；1 mL 注射器（山東威高集團高分子有限公司）；醫用電鉆（天津宇通醫療器械有限公司）；骨蠟（上海三友醫療器械有限公司）；X 線機（GE 公司，美國）；CT（Philip 公司，荷蘭）。
1.2 實驗分組及方法
將 48 只新西蘭大白兔隨機分為 6 組，每組 8 只；A 組注射無菌生理鹽水作為對照，B、C、D、E、F 組分別注射 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105 CFU/mL MRSA。所有動物以 10% 水合氯醛（2.5 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉后，仰臥位固定于手術實驗臺上；暴露左側股骨，于股骨髁上 2 cm 處為起點縱向切開皮膚，分離肌肉、筋膜，暴露股骨后用 2 mm 克氏針鉆孔，打通骨髓腔，1 mL 注射器抽取骨髓后骨蠟封閉孔隙，再通過骨蠟緩慢注射 0.1 mL 魚肝油酸鈉閉塞血管使之硬化。1 min 后 A 組注入無菌生理鹽水 0.1 mL，B～F 組根據分組向髓腔注射 0.1 mL 不同濃度 MRSA；再次用骨蠟封閉注射器形成孔隙，防止菌液外漏。最后逐層縫合軟組織及皮膚，切口以聚維酮碘消毒無菌紗布覆蓋，按照統一標準單籠飼養。
1.3 觀測指標
1.3.1 動物大體觀察
術后 4 周觀察切口愈合情況，皮溫，有無紅腫、流膿、竇道形成。根據唐輝等[15]的標準行大體觀察評分：0 分，無感染征象；1 分，皮溫增高，切口表面有紅斑；2 分，切口處紅腫，股骨增粗，竇道形成；3 分，骨質破壞嚴重，侵犯關節，有膿腫。
1.3.2 細菌學檢查
術后 4 周用無菌棉簽沾取傷口分泌物，生理鹽水浸泡棉簽后在瓊脂培養基涂板，確定感染細菌種類。
1.3.3 血清 C 反應蛋白含量檢測
術前及術后 2、4 周采取兔耳緣靜脈血 2 mL，以離心半徑 10 cm、3 000 r/min 離心 15 min 后，取上層血清，30 min 內用兔 C 反應蛋白酶聯反應測定試劑盒測定 C 反應蛋白含量。
1.3.4 影像學觀察
術后 4 周行 X 線片和 CT 檢查觀察股骨變化及缺損閉合情況，采用 Norden 評分[16]進行影像學評分，包括 4 個指標：① 死骨形成：有，3 分；可疑，1.5 分；無，0 分。② 骨質破壞：有，2 分；可疑，1 分；無，0 分。③ 骨質增生：有，1 分；可疑，0.5 分；無，0 分。④ 軟組織包塊影：有，1 分；可疑，0.5 分；無，0 分。
1.3.5 標本大體觀察及組織學觀察
術后 4 周采用兔耳緣靜脈空氣栓塞處死動物，取出股骨標本，采用 Ambrose 標準[17]進行標本大體觀察評分：3 分，顯著膿腫；2 分，中等量膿腫；1 分，少量膿腫；0 分，無膿腫。將標本以甲醛固定 48 h，10%EDTA 脫鈣液脫鈣，每周換液 1 次，共 4 周；脫鈣后行石蠟包埋，5 μm 厚組織切片，常規 HE 染色，光鏡下觀察骨內炎癥情況。采用 Ambrose 標準進行組織學評分：① 炎癥情況：3 分，嚴重炎癥、纖維化、膿腫；2 分，中等炎癥、纖維化；1 分，少量炎癥、纖維化；0 分，無炎癥僅纖維化。② 新骨形成比例：3 分，<25%；2 分，25%～50%；1 分，50%～75%；0 分，75%～100%。將兩種評分取均值評價骨髓炎的嚴重程度。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 動物大體觀察
術后 4 周內 A 組無動物死亡，切口愈合良好，皮溫可，無紅腫、膿腫、滲出及竇道形成。B 組術后 3 d 和 5 d 因感染過重分別死亡 2 只和 3 只動物；余 3 只感染侵犯至關節，膿腫形成，大量骨質破壞，死骨形成。C 組術后 7 d 因感染過重死亡 2 只動物；余 6 只中，2 只切口感染侵犯至關節，程度輕于 B 組；4 只切口紅腫，股骨增粗，竇道形成。D、E、F 組無動物死亡。D 組 7 只兔切口紅腫，股骨增粗，竇道形成；1 只兔切口紅腫，但未形成竇道。E 組 6 只兔切口紅腫，股骨略微增粗，尚未形成竇道；2 只兔切口皮溫增高，紅腫形成，尚未形成竇道。F 組 4 只切口紅腫，皮溫增高，尚未形成竇道；4 只切口皮溫高，無紅腫，皮膚處有紅斑。見圖 1。
A、B、C、D、E、F 組大體觀察評分分別為 0、（3.00±0.00）、（2.33±0.52）、（1.88±0.35）、（1.75±0.46）、（1.50±0.53）分，A 組評分顯著低于其余各組，B 組顯著高于其余各組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C 組評分高于 D、E、F 組，D 組高于 E、F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；E、F 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 細菌學檢查
A 組無切口紅腫滲出，E 組 2 只、F 組 8 只切口未破潰形成竇道，因此未進行細菌學培養測定。B 組 3 只、C 組 6 只、D 組 8 只、E 組 6 只細菌培養結果陽性，確定為 MRSA。
2.3 血清 C 反應蛋白含量檢測
術前各組間比較 C 反應蛋白含量差異均無統計學意義（P>0.05）。術后 2 周，B～F 組 C 反應蛋白含量均顯著高于 A 組，B、C 組高于 D、E、F 組，D、E 組顯著高于 F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間及 D、E 組間差異無統計學意義（P>0.05）。術后 4 周，各組間差異均有統計學意義（P<0.05）。A 組術后 2、4 周 C 反應蛋白含量與術前比較差異無統計學意義（P>0.05），B～F 組術后 2、4 周顯著高于術前（P<0.05）；A、F 組術后 2、4 周間比較差異無統計學意義（P>0.05），B～E 組術后 4 周顯著高于術后 2 周（P<0.05）。見表 1。
表1
各組各時間點血清 C 反應蛋白含量比較（mg/mL，
）
Table1.
Comparison of serum C-reactive protein content at each time point of each group (mg/mL,
)
2.4 影像學觀察
X 線片示：A 組軟組織無腫脹，骨質無破壞，無死骨形成。B～F 組均見不同程度骨質破壞，死骨形成，其中 B 組軟組織腫脹明顯，侵犯至關節；C 組中 2 只侵犯至關節，但侵犯程度不及 B 組；D、E 組均可見死骨形成，股骨破壞腫脹，腫脹程度不及 B 組；F 組可見骨質破壞，骨質增生，破壞程度不及 D、E 組。見圖 2。
CT 三維重建示：A 組可見股骨三維重建結構良好，無明顯骨質破壞，股骨干平滑完整。B 組可見股骨結構破壞，關節處骨質破壞嚴重，大量死骨形成，骨質增生，股骨干顯著增粗。C 組中有 2 只侵犯至膝關節，侵犯程度不及 B 組；其余可見股骨干增粗，股骨髁上骨質破壞嚴重，骨質增生，死骨形成。D、E 組可見股骨髁上骨質破壞，破壞程度不及 C 組，少量死骨形成。F 組可見股骨髁上骨質少許破壞，破壞程度不及 E 組。見圖 3。
橫斷面 CT 示：A 組可見股骨干平滑完整，無死骨、骨質破壞及軟組織腫脹。B 組可見股骨干靠近膝關節處嚴重破壞，大量死骨形成，骨質增生，軟組織腫脹嚴重。C 組 2 只侵犯至膝關節，嚴重程度不及 B 組；其余可見股骨干增粗，局部死骨形成，骨質增生，軟組織腫脹。D、E 組均可見股骨髁上股骨增粗，骨質破壞，死骨形成，軟組織腫脹程度不及 C 組。F 組可見少量骨質破壞，部分實驗動物可疑骨質增生，軟組織未見明顯腫脹。見圖 4。
A、B、C、D、E、F 組 Norden 評分分別為 0、（6.50±0.86）、（5.92±0.86）、（5.12±0.69）、（4.75±0.80）、（3.69±0.26）分。B～F 組評分顯著高于 A 組，B、C 組顯著高于 D、E、F 組，D、E 組顯著高于 F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間及 D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.5 組織學觀察
A、B、C、D、E、F 組標本大體觀察評分分別為 0、（3.00±0.00）、（2.33±0.52）、（1.75±0.46）、（1.62±0.52）、（1.37±0.52）分，B～F 組顯著高于 A 組，B、C 組顯著高于 D、E、F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E、F 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
HE 染色示：A 組未見明顯異常，骨小梁結構清晰可見，排列整齊完整，未見明顯炎性細胞浸潤；B 組可見大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，骨小梁破壞，骨細胞壞死，部分區域膿腫伴機化；C 組可見大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，骨小梁破壞程度不及 B 組，嗜伊紅組織膿腫形成；D、E 組可見中等量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，骨小梁破壞程度不及 C 組，部分區域膿腫形成；F 組可見少量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，骨小梁結構未見明顯破壞。見圖 5。A、B、C、D、E、F 組組織學評分分別為（0.13±0.35）、（2.67±0.58）、（1.67±0.82）、（1.38±0.52）、（1.13±0.35）、（0.75±0.71）分，B～F 組顯著高于 A 組，B 組顯著高于 C～F 組，C、D 組顯著高于 F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D、E 組間以及 E、F 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
圖1
術后 4 周各組兔大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure1. General observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖2
術后 4 周各組 X 線片觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure2. X-ray film observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖3
術后 4 周各組 CT 三維重建觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure3. CT three-dimensional observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖4
術后 4 周各組橫斷面 CT 觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure4. Cross section CT observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖5
術后 4 周各組 HE 染色觀察（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure5. HE staining observation of rabbits at 4 weeks after operation in each group (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
3 討論
慢性骨髓炎是骨科常見且嚴重的并發癥。隨著組織工程的發展，各種植入型器械在骨科應用越來越多，慢性骨髓炎是導致植入器械失敗的重要原因之一；最終傷口遷延不愈，致病菌長期存在，抗生素耐藥，死骨形成，竇道存在，病程時長，反復發作。隨著抗生素的廣泛使用，MRSA 已成為骨髓炎常見的致病菌。臨床一旦確診為 MRSA 所形成的慢性骨髓炎，需要更長住院時間及更多抗生素使用，給患者帶來巨大的心理和生理負擔[18]。
合適的動物模型在骨髓炎治療研究中起著至關重要的作用。骨髓炎造模動物不同，實驗所施加的干預措施也不同。常用的實驗動物有犬、豬、兔、大鼠、小鼠等，由于兔經濟實惠、占用飼養面積小、股骨大利于操作，故本實驗采用兔股骨作為實驗對象與部位。國內外報道的骨髓炎模型制備的菌液濃度不一致[19-20]，制備的細菌種類也不同[21-23]，且臨床因 MRSA 形成的骨髓炎發生率逐漸上升，因此本實驗選用 MRSA 為造模實驗菌屬。菌液濃度是制備骨髓炎模型的關鍵因素，菌液濃度高會造成較高的死亡率。本實驗中，當注射菌液濃度為 1×109 CFU/mL 時，動物存活率僅 37.5%（3/8），且存活的模型感染程度均較重。但濃度太低，造模結果也不盡如人意。根據文獻報道[18]，研究者使用金黃色葡萄球菌造模濃度至少在 1×105 CFU/mL 以上才可能有較高的感染率。MRSA 與金黃色葡萄球菌類似，故我們選用濃度為 1×105～1×109 CFU/mL 的 MRSA 進行篩選。本研究結果發現，適宜的造模濃度為 1×106～1×107 CFU/mL，大于文獻報道的 1×105 CFU/mL，可能與既往文獻未使用硬化劑及骨蠟封閉，造成菌液外溢，外部軟組織為細菌提供了良好的生存環境有關。
在制備過程中，硬化劑的選擇也較為關鍵。本實驗的預實驗中發現，未注射硬化劑可造成兔死亡只數增加，可能是因菌液進入血液循環導致死亡。本研究選用 5% 魚肝油酸鈉[24-25]，它可以使骨局部微循環栓塞，阻斷微循環，使得菌液進入血液的量減少，防止膿毒血癥的發生，也為細菌生長提供了良好環境。這種方法簡單易操作，是骨髓炎造模中較合適的方法。
綜上述，在兔股骨慢性骨髓炎模型制備過程中，硬化劑的選用及合適濃度的 MRSA 是造模關鍵。本實驗結果提示，制備 MRSA 所形成的兔股骨慢性骨髓炎適宜的菌液濃度為 1×106～1×107 CFU/mL，該方法重復性高，制備模型較統一。
慢性骨髓炎是急性化膿骨髓炎的延續，由于治療時清創不徹底、引流不暢導致病情反復發作，因伴隨不同程度長時間感染，抗生素耐藥，死骨形成，導致骨不連或骨不愈合，成為骨科臨床難題之一[1-3]。目前治療慢性骨髓炎的主要方法有手術清創、病灶切除、封閉式負壓引流及抗生素灌注等[4-6]，但療效欠佳，常需要多次手術及長期運用抗生素，甚至部分患者需要截肢治療，造成巨大身心及經濟負擔[7-8]。因此尋找一個有效治療慢性骨髓炎的方案相當必要。
建立穩定、高效的慢性骨髓炎動物模型，是對慢性骨髓炎實驗研究的重要保障[9]。臨床常見的慢性骨髓炎致病菌以金黃色葡萄球菌為主，但隨著抗生素的廣泛運用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）所致慢性骨髓炎發生率逐步上升[10]，故本實驗采用 MRSA 作為致病菌。在造模動物選擇上，因兔能較好地模擬人慢性骨髓炎發生過程，且手術操作較容易[11]，故本實驗選擇兔制備慢性骨髓炎動物模型。目前文獻報道使用的菌量不一致，細菌濃度過高容易導致動物死亡，過低達不到造模效果[12-14]。鑒于此，本實驗通過對兔股骨注射不同濃度 MRSA，評價其感染指標，為確定兔股骨慢性骨髓炎模型的最佳致病菌濃度提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
成年普通級新西蘭大白兔 48 只，雌雄不限，體質量 2.5～3.0 kg，由蘭州軍區總醫院實驗動物科提供。排除先天畸形、營養不良等疾病，自由飲水，標準飲食 ，于濕度 30%、室溫 25℃ 的清潔級實驗室單籠適應性飼養 2 周后進行實驗。
MRSA（由蘭州軍區總醫院檢驗科提供）；采用 DENSIMAT 比濁儀（BIOMERIEUX 公司，法國）將 MRSA 定量制備成濃度為 1×109 CFU/mL 的菌液，無菌生理鹽水分別稀釋為 1×108、1×107、1×106、1×105 CFU/mL 濃度的菌液，備用（4 h 內用完，防止細菌增殖及凋亡造成濃度差異過大）。
水合氯醛（天津光復精細化工研究所）；魚肝油酸鈉注射液（上海信誼金朱藥業股份有限公司）；兔 C 反應蛋白酶聯反應測定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。常規手術器械一套（江蘇施強醫療器械有限公司）；1 mL 注射器（山東威高集團高分子有限公司）；醫用電鉆（天津宇通醫療器械有限公司）；骨蠟（上海三友醫療器械有限公司）；X 線機（GE 公司，美國）；CT（Philip 公司，荷蘭）。
1.2 實驗分組及方法
將 48 只新西蘭大白兔隨機分為 6 組，每組 8 只；A 組注射無菌生理鹽水作為對照，B、C、D、E、F 組分別注射 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105 CFU/mL MRSA。所有動物以 10% 水合氯醛（2.5 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉后，仰臥位固定于手術實驗臺上；暴露左側股骨，于股骨髁上 2 cm 處為起點縱向切開皮膚，分離肌肉、筋膜，暴露股骨后用 2 mm 克氏針鉆孔，打通骨髓腔，1 mL 注射器抽取骨髓后骨蠟封閉孔隙，再通過骨蠟緩慢注射 0.1 mL 魚肝油酸鈉閉塞血管使之硬化。1 min 后 A 組注入無菌生理鹽水 0.1 mL，B～F 組根據分組向髓腔注射 0.1 mL 不同濃度 MRSA；再次用骨蠟封閉注射器形成孔隙，防止菌液外漏。最后逐層縫合軟組織及皮膚，切口以聚維酮碘消毒無菌紗布覆蓋，按照統一標準單籠飼養。
1.3 觀測指標
1.3.1 動物大體觀察
術后 4 周觀察切口愈合情況，皮溫，有無紅腫、流膿、竇道形成。根據唐輝等[15]的標準行大體觀察評分：0 分，無感染征象；1 分，皮溫增高，切口表面有紅斑；2 分，切口處紅腫，股骨增粗，竇道形成；3 分，骨質破壞嚴重，侵犯關節，有膿腫。
1.3.2 細菌學檢查
術后 4 周用無菌棉簽沾取傷口分泌物，生理鹽水浸泡棉簽后在瓊脂培養基涂板，確定感染細菌種類。
1.3.3 血清 C 反應蛋白含量檢測
術前及術后 2、4 周采取兔耳緣靜脈血 2 mL，以離心半徑 10 cm、3 000 r/min 離心 15 min 后，取上層血清，30 min 內用兔 C 反應蛋白酶聯反應測定試劑盒測定 C 反應蛋白含量。
1.3.4 影像學觀察
術后 4 周行 X 線片和 CT 檢查觀察股骨變化及缺損閉合情況，采用 Norden 評分[16]進行影像學評分，包括 4 個指標：① 死骨形成：有，3 分；可疑，1.5 分；無，0 分。② 骨質破壞：有，2 分；可疑，1 分；無，0 分。③ 骨質增生：有，1 分；可疑，0.5 分；無，0 分。④ 軟組織包塊影：有，1 分；可疑，0.5 分；無，0 分。
1.3.5 標本大體觀察及組織學觀察
術后 4 周采用兔耳緣靜脈空氣栓塞處死動物，取出股骨標本，采用 Ambrose 標準[17]進行標本大體觀察評分：3 分，顯著膿腫；2 分，中等量膿腫；1 分，少量膿腫；0 分，無膿腫。將標本以甲醛固定 48 h，10%EDTA 脫鈣液脫鈣，每周換液 1 次，共 4 周；脫鈣后行石蠟包埋，5 μm 厚組織切片，常規 HE 染色，光鏡下觀察骨內炎癥情況。采用 Ambrose 標準進行組織學評分：① 炎癥情況：3 分，嚴重炎癥、纖維化、膿腫；2 分，中等炎癥、纖維化；1 分，少量炎癥、纖維化；0 分，無炎癥僅纖維化。② 新骨形成比例：3 分，<25%；2 分，25%～50%；1 分，50%～75%；0 分，75%～100%。將兩種評分取均值評價骨髓炎的嚴重程度。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 動物大體觀察
術后 4 周內 A 組無動物死亡，切口愈合良好，皮溫可，無紅腫、膿腫、滲出及竇道形成。B 組術后 3 d 和 5 d 因感染過重分別死亡 2 只和 3 只動物；余 3 只感染侵犯至關節，膿腫形成，大量骨質破壞，死骨形成。C 組術后 7 d 因感染過重死亡 2 只動物；余 6 只中，2 只切口感染侵犯至關節，程度輕于 B 組；4 只切口紅腫，股骨增粗，竇道形成。D、E、F 組無動物死亡。D 組 7 只兔切口紅腫，股骨增粗，竇道形成；1 只兔切口紅腫，但未形成竇道。E 組 6 只兔切口紅腫，股骨略微增粗，尚未形成竇道；2 只兔切口皮溫增高，紅腫形成，尚未形成竇道。F 組 4 只切口紅腫，皮溫增高，尚未形成竇道；4 只切口皮溫高，無紅腫，皮膚處有紅斑。見圖 1。
A、B、C、D、E、F 組大體觀察評分分別為 0、（3.00±0.00）、（2.33±0.52）、（1.88±0.35）、（1.75±0.46）、（1.50±0.53）分，A 組評分顯著低于其余各組，B 組顯著高于其余各組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C 組評分高于 D、E、F 組，D 組高于 E、F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；E、F 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 細菌學檢查
A 組無切口紅腫滲出，E 組 2 只、F 組 8 只切口未破潰形成竇道，因此未進行細菌學培養測定。B 組 3 只、C 組 6 只、D 組 8 只、E 組 6 只細菌培養結果陽性，確定為 MRSA。
2.3 血清 C 反應蛋白含量檢測
術前各組間比較 C 反應蛋白含量差異均無統計學意義（P>0.05）。術后 2 周，B～F 組 C 反應蛋白含量均顯著高于 A 組，B、C 組高于 D、E、F 組，D、E 組顯著高于 F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間及 D、E 組間差異無統計學意義（P>0.05）。術后 4 周，各組間差異均有統計學意義（P<0.05）。A 組術后 2、4 周 C 反應蛋白含量與術前比較差異無統計學意義（P>0.05），B～F 組術后 2、4 周顯著高于術前（P<0.05）；A、F 組術后 2、4 周間比較差異無統計學意義（P>0.05），B～E 組術后 4 周顯著高于術后 2 周（P<0.05）。見表 1。
表1
各組各時間點血清 C 反應蛋白含量比較（mg/mL，
）
Table1.
Comparison of serum C-reactive protein content at each time point of each group (mg/mL,
)
2.4 影像學觀察
X 線片示：A 組軟組織無腫脹，骨質無破壞，無死骨形成。B～F 組均見不同程度骨質破壞，死骨形成，其中 B 組軟組織腫脹明顯，侵犯至關節；C 組中 2 只侵犯至關節，但侵犯程度不及 B 組；D、E 組均可見死骨形成，股骨破壞腫脹，腫脹程度不及 B 組；F 組可見骨質破壞，骨質增生，破壞程度不及 D、E 組。見圖 2。
CT 三維重建示：A 組可見股骨三維重建結構良好，無明顯骨質破壞，股骨干平滑完整。B 組可見股骨結構破壞，關節處骨質破壞嚴重，大量死骨形成，骨質增生，股骨干顯著增粗。C 組中有 2 只侵犯至膝關節，侵犯程度不及 B 組；其余可見股骨干增粗，股骨髁上骨質破壞嚴重，骨質增生，死骨形成。D、E 組可見股骨髁上骨質破壞，破壞程度不及 C 組，少量死骨形成。F 組可見股骨髁上骨質少許破壞，破壞程度不及 E 組。見圖 3。
橫斷面 CT 示：A 組可見股骨干平滑完整，無死骨、骨質破壞及軟組織腫脹。B 組可見股骨干靠近膝關節處嚴重破壞，大量死骨形成，骨質增生，軟組織腫脹嚴重。C 組 2 只侵犯至膝關節，嚴重程度不及 B 組；其余可見股骨干增粗，局部死骨形成，骨質增生，軟組織腫脹。D、E 組均可見股骨髁上股骨增粗，骨質破壞，死骨形成，軟組織腫脹程度不及 C 組。F 組可見少量骨質破壞，部分實驗動物可疑骨質增生，軟組織未見明顯腫脹。見圖 4。
A、B、C、D、E、F 組 Norden 評分分別為 0、（6.50±0.86）、（5.92±0.86）、（5.12±0.69）、（4.75±0.80）、（3.69±0.26）分。B～F 組評分顯著高于 A 組，B、C 組顯著高于 D、E、F 組，D、E 組顯著高于 F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間及 D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.5 組織學觀察
A、B、C、D、E、F 組標本大體觀察評分分別為 0、（3.00±0.00）、（2.33±0.52）、（1.75±0.46）、（1.62±0.52）、（1.37±0.52）分，B～F 組顯著高于 A 組，B、C 組顯著高于 D、E、F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E、F 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
HE 染色示：A 組未見明顯異常，骨小梁結構清晰可見，排列整齊完整，未見明顯炎性細胞浸潤；B 組可見大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，骨小梁破壞，骨細胞壞死，部分區域膿腫伴機化；C 組可見大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，骨小梁破壞程度不及 B 組，嗜伊紅組織膿腫形成；D、E 組可見中等量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，骨小梁破壞程度不及 C 組，部分區域膿腫形成；F 組可見少量中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，骨小梁結構未見明顯破壞。見圖 5。A、B、C、D、E、F 組組織學評分分別為（0.13±0.35）、（2.67±0.58）、（1.67±0.82）、（1.38±0.52）、（1.13±0.35）、（0.75±0.71）分，B～F 組顯著高于 A 組，B 組顯著高于 C～F 組，C、D 組顯著高于 F 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D、E 組間以及 E、F 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
圖1
術后 4 周各組兔大體觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure1. General observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖2
術后 4 周各組 X 線片觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure2. X-ray film observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖3
術后 4 周各組 CT 三維重建觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure3. CT three-dimensional observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖4
術后 4 周各組橫斷面 CT 觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure4. Cross section CT observation of rabbits at 4 weeks after operation in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
圖5
術后 4 周各組 HE 染色觀察（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組；f. F 組
Figure5. HE staining observation of rabbits at 4 weeks after operation in each group (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E; f. Group F
3 討論
慢性骨髓炎是骨科常見且嚴重的并發癥。隨著組織工程的發展，各種植入型器械在骨科應用越來越多，慢性骨髓炎是導致植入器械失敗的重要原因之一；最終傷口遷延不愈，致病菌長期存在，抗生素耐藥，死骨形成，竇道存在，病程時長，反復發作。隨著抗生素的廣泛使用，MRSA 已成為骨髓炎常見的致病菌。臨床一旦確診為 MRSA 所形成的慢性骨髓炎，需要更長住院時間及更多抗生素使用，給患者帶來巨大的心理和生理負擔[18]。
合適的動物模型在骨髓炎治療研究中起著至關重要的作用。骨髓炎造模動物不同，實驗所施加的干預措施也不同。常用的實驗動物有犬、豬、兔、大鼠、小鼠等，由于兔經濟實惠、占用飼養面積小、股骨大利于操作，故本實驗采用兔股骨作為實驗對象與部位。國內外報道的骨髓炎模型制備的菌液濃度不一致[19-20]，制備的細菌種類也不同[21-23]，且臨床因 MRSA 形成的骨髓炎發生率逐漸上升，因此本實驗選用 MRSA 為造模實驗菌屬。菌液濃度是制備骨髓炎模型的關鍵因素，菌液濃度高會造成較高的死亡率。本實驗中，當注射菌液濃度為 1×109 CFU/mL 時，動物存活率僅 37.5%（3/8），且存活的模型感染程度均較重。但濃度太低，造模結果也不盡如人意。根據文獻報道[18]，研究者使用金黃色葡萄球菌造模濃度至少在 1×105 CFU/mL 以上才可能有較高的感染率。MRSA 與金黃色葡萄球菌類似，故我們選用濃度為 1×105～1×109 CFU/mL 的 MRSA 進行篩選。本研究結果發現，適宜的造模濃度為 1×106～1×107 CFU/mL，大于文獻報道的 1×105 CFU/mL，可能與既往文獻未使用硬化劑及骨蠟封閉，造成菌液外溢，外部軟組織為細菌提供了良好的生存環境有關。
在制備過程中，硬化劑的選擇也較為關鍵。本實驗的預實驗中發現，未注射硬化劑可造成兔死亡只數增加，可能是因菌液進入血液循環導致死亡。本研究選用 5% 魚肝油酸鈉[24-25]，它可以使骨局部微循環栓塞，阻斷微循環，使得菌液進入血液的量減少，防止膿毒血癥的發生，也為細菌生長提供了良好環境。這種方法簡單易操作，是骨髓炎造模中較合適的方法。
綜上述，在兔股骨慢性骨髓炎模型制備過程中，硬化劑的選用及合適濃度的 MRSA 是造模關鍵。本實驗結果提示，制備 MRSA 所形成的兔股骨慢性骨髓炎適宜的菌液濃度為 1×106～1×107 CFU/mL，該方法重復性高，制備模型較統一。
