引用本文： 李建偉, 張學亮, 郭全義, 張景春, 曹艷杰, 張新國, 黃建軍, 王琪, 劉小剛, 郝春香. 組織工程骨軟骨一體化多相支架的制備與體外檢測評估. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(4): 434-440. doi: 10.7507/1002-1892.201712038 復制
由于缺乏血管的特性，軟骨再生能力十分有限；此外，軟骨是無神經支配的組織，其損傷后患者疼痛感不顯著，導致軟骨表面的損傷繼續加載至軟骨下骨，造成更嚴重的骨軟骨損傷[1]。同時，臨床上嚴重的軟骨損傷后，軟骨下骨板也早已發生相應的變硬、增厚等病變。因此，在創傷與骨關節疾病后，骨軟骨損傷的整體修復常給臨床帶來巨大挑戰。傳統的骨軟骨損傷治療策略包括微骨折、關節鏡清創術、鑲嵌成形術、自體軟骨細胞移植、自體骨軟骨柱移植及異體骨軟骨柱移植等，這些方法各有其相應優勢，如微骨折與簡單的關節鏡清創術花費少、創傷小、恢復快，部分患者可二次手術[2]；自體軟骨細胞移植與自體骨軟骨柱移植則具有軟骨細胞存活率高、可重建透明軟骨表面、遠期修復效果較好的優勢。但目前這些治療手段也有其相應缺點，如易形成纖維軟骨，缺損區再生填充不完整，負重區域修復效果不明顯且容易再次復發等；同時移植物來源受限，所移植組織的來源區發病率高，缺損區的修復與周圍正常關節軟骨不吻合等一系列問題，也限制了傳統治療手段的進一步發展[3]。
組織工程技術的出現與發展為骨軟骨損傷的再生和修復帶來了新的希望。生物支架材料與種子細胞是骨軟骨組織工程的重要元素，但由于負載種子細胞型生物支架的修復方法存在花費高、需二次手術、體外細胞培養繁瑣、種子細胞來源受限和相應的社會法律等問題，限制了其進一步發展。因此通過結合正常骨軟骨所固有的結構與成分設計構建多相梯度骨軟骨支架，利用仿生型生物支架來滲透募集周圍正常軟骨細胞，同時誘導分化來自骨髓腔的宿主干細胞[4-5]，從而實現骨軟骨缺損的修復與再生，已成為當前骨軟骨組織工程領域研究的熱點之一。
本實驗在前期研究基礎上，以脫細胞軟骨細胞外基質、納米級羥基磷灰石和海藻酸鈉為原材料，成功制備了結構與成分雙重仿生的骨軟骨一體化多相支架，并進行了相關生物學與力學性能檢測，為下一步動物體內實驗提供了研究基礎，同時為未來骨軟骨的修復與再生提供一種具有希望的治療手段與方法。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
健康新鮮家豬膝關節購自本地屠宰場；納米級羥基磷灰石顆粒、海藻酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。健康 1 月齡 SD 大鼠 2 只，雌雄不限，體質量 100～200 g，購自解放軍總醫院實驗動物中心。
胰蛋白酶粉劑、脫氧核糖核酸酶（DNase）粉劑、核糖核酸酶（RNase）粉劑、EDTA、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDAC］、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（Sigma 公司，美國）；Triton X-100 溶液（J.T.Baker 公司，美國）；無水 CaCl2（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。
Milli-Q BIOCEL 超純水機（Millipore 公司，法國）；BS-8000U 去離子水過濾機（北京普亞特環保科技公司）；JYL-350A 家用九陽粉碎機（山東九陽股份有限公司）；Beckman J-25 低溫高速離心機（Beckman 公司，美國）；FD-1 冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；Bio-link 紫外交聯儀（北京博威興業科技發展有限公司）；BCPCAS-4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）； ElectroForce 3220 材料試驗機（BOSE 公司，美國）；FV-1000 激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Epoch Take 3 酶標儀（Bio-Tek 公司，美國）。
1.2 骨軟骨一體化多相支架制備
1.2.1 軟骨層漿料制備
將本地屠宰場獲取的新鮮豬膝關節用冰袋保鮮運送回實驗室，在無菌超凈臺中常規聚維酮碘溶液消毒后，打開膝關節腔，用無菌手術刀片削取股骨內外側髁及髕骨內側面的透明軟骨。將收集的透明軟骨片置于無菌瓶中，加入等體積無菌去離子水后–80℃ 冰箱過夜；PBS 液沖洗 3 遍，再加入過氧化氫置于搖床震蕩清洗 2 遍，每遍 30 min，再用無菌 PBS 液漂洗 3 遍后，盡量將其剪切成小塊置入無菌粉碎機內，加適量無菌去離子水，反復進行濕法粉碎，最后形成勻漿。將形成的原漿用無菌去離子水充分稀釋后，置入 4℃ 恒溫離心機進行差速離心：先低速離心（離心半徑 13 cm、1 500 r/min 離心 10 min）分離沉淀，保留上清液；再將上清液分別以中速（離心半徑 13 cm、3 000 r/min 離心 10 min 及離心半徑 13 cm、6 000 r/min 離心 20 min）先后離心，分離沉淀，收集上清液；最后將得到的上清懸浮液加入適量 9%NaCl，再進行高速離心（離心半徑 13 cm、10 000 r/min；離心 40 min），收集沉淀即為軟骨納米微絲原液。此過程中將收集的沉淀再次放入無菌粉碎機中，重復進行濕法粉碎與差速離心，不斷收集軟骨納米微絲原液。將收集的微絲原液分別加入 0.25% 胰蛋白酶與 3%Triton X-100，置于 4℃ 恒溫搖床中勻速攪拌各 12 h 進行脫細胞處理，然后用無菌去離子水反復清洗；再于 37℃ 條件下分別加入 DNase（50 U/mL）與 RNase（1 U/mL），攪拌均勻以去除核物質；處理完成后再次用無菌去離子水與 PBS 液反復清洗，最后低溫（4℃）高速離心（離心半徑 13 cm、10 000 r/min 離心 30 min），所得到的沉淀即為脫細胞軟骨細胞外基質。將其收集于無菌去離子水中，配制成 3%（W/V）濃度的懸液，無菌條件下保存。
1.2.2 骨層漿料的制備
不同含量的羥基磷灰石影響著支架骨層的力學性能。將納米級羥基磷灰石粉末用無菌去離子水配置成 10%（W/V）濃度的混懸液，并攪拌均勻；再將海藻酸鈉顆粒用此混懸液配置成 4%（W/V）濃度的漿料；最后與脫細胞軟骨細胞外基質混合均勻，室溫下真空狀態（<–40 kPa）進行脫氣并反復低速離心（離心半徑 13 cm、500 r/min 離心 10 min），以去除漿料中的氣泡，無菌條件下保存。
1.2.3 中間層漿料的制備
將 4%（W/V）濃度的海藻酸鈉漿料與脫細胞軟骨細胞外基質混合，然后用磁力攪拌器于 37℃ 恒溫培養箱內勻速攪動 12 h；再用超聲波震蕩處理 2 次，每次 30 min，以保證兩種漿料混合均勻。無菌條件下保存。
1.2.4 一體化制備過程
將 3 種漿料按骨層、中間層與軟骨層的順序，依次注入聚苯乙烯筒形模具（孔徑 10.2 mm、最大容積 1.7 mL）中。為使各層之間的接觸面更加平坦，在加入一層漿料后迅速將模具置入–80℃ 深低溫冰箱內，20 min 后再加入另外一層，最后加完軟骨層漿料后，將模具置入–20℃ 冰箱內至少 4 h。待完全凝固后，將樣品在冷凍干燥機內真空條件下冷凍干燥 24 h，脫模后取出支架進行交聯[6]。首先將支架置于 258 nm 波長的紫外線下，距光源 10 cm 處持續照射交聯 4 h；然后用含 EDAC（50 mmol/L）與 NHS（20 mmol/L）的 95%（V/V）乙醇溶液浸泡交聯 6～12 h，再用 5%CaCl2 交聯 2～4 h。交聯完成后用無菌去離子水反復震蕩漂洗支架，以去除殘留的交聯劑，再次冷凍干燥處理 24 h。最后將制作好的支架用 20 kGy 60Co γ 射線輻照滅菌后，4℃ 條件下密封保存備用。
1.3 觀測指標
1.3.1 支架的結構特征觀察
① 取支架進行大體觀察及 Micro-CT 觀察：通過 Micro-CT 斷層掃描成像技術，在 50 kV 電壓下進行 1 h 精細掃描，分析骨軟骨一體化多相支架每層孔隙率及孔徑大小。② 掃描電鏡觀察：將骨軟骨一體化多相支架的每層于水平面切開，并固定于鋁質底座上，進行離子濺射噴金 120 s，于 15 keV 加速電壓下進行掃描電鏡觀察。③ 能量色散 X 射線光譜儀觀察：通過能量色散 X 射線光譜儀線性掃描獲取骨軟骨一體化多相支架中每層磷和鈣以及其他主要元素的含量數據，同時組成能譜。
1.3.2 吸水能力測定
先將每層交聯后凍干的骨軟骨一體化多相支架在空氣中稱重（n=6），得到每層支架的干重（Wd）；再將其放入去離子水中浸泡 20 min，確認其完全吸水后取出支架，用濾紙輕微吸干其表面液體后再次稱重，即為濕重（Ww）。按以下公式計算支架吸水能力，即親水性：（Ww–Wd）/Wd。
1.3.3 力學測試
① 壓縮模量測定：將凍干后的支架（n=6）每層切割成直徑 9 mm、高 9 mm 的圓柱體，為使支架樣本處于完全濕潤狀態，支架在室溫下浸泡于去離子水，至測試時取出。將樣本置于定制的上下兩層剛性夾板之間，應用 ElectroForce 3220 材料試驗機，連接 250 N 載荷力學傳感器，先緩慢持續施加 0.01 N 的預負荷，確保上層剛性夾板與支架表面達到真正接觸后，再用壓頭以 0.01 mm/s 的恒定壓縮速率進行位移控制，最大應變至 20% 時停止。此時測試數據自動輸出，根據應力-應變曲線的線性變化部分，取斜率在 2%～6% 應變下對應的曲線進行線性擬合，并計算相應的壓縮模量，分析支架每層的力學性能。② 界面間黏附強度檢測：用高強度黏合劑將骨軟骨一體化多相支架固定于 ElectroForce 3220 材料試驗機上下兩層夾板間，用 250 N 的載荷力學傳感器以 0.01 mm/s 的恒定拉伸速率進行位移控制，以 3 層間任意 2 層的界面分離或 3 層各自分離為極限拉伸強度，最終測定一體化多相支架每層間的界面黏附強度。
1.3.4 MTT檢測支架的細胞毒性
① 支架浸提液制備：取支架（n=6）并計算支架表面積，按 1.25 cm2/mL 計算出所需的 DMEM 培養液量。將計算好的 DMEM 培養液加入滅菌后裝有標本的離心管內，在 37℃ 溫箱孵育 24 h 后，以離心半徑 13 cm、1 600 r/min 離心 10 min，取上清液，即為支架浸提液。② 實驗分組及 MTT 檢測方法：取鼠 L929 成纖維細胞培養使其貼壁與生長，24 h 后胰蛋白酶消化計數，將吹打均勻的細胞懸液按 0.3 mL/孔（3 000～5 000 個/孔）加入 5 塊 96 孔板，每組 3 孔。將原培養液倒掉，實驗組和對照組分別加入骨軟骨一體化多相支架浸提液和正常 DMEM 培養液進行細胞培養。培養 5 d 內每天取 1 塊板，棄去培養液，每孔加入 20 μL MTT 液于無菌培養箱內培養；4 h 后每孔加入 150 μL DMSO，震蕩均勻后上酶標儀于 492 nm 處測定吸光度（A）值。
1.3.5 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察支架生物相容性
取 SD 大鼠以頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出雙側股骨，采用全骨髓貼壁法提取并培養 BMSCs。取生長狀態良好的第 2 代 BMSCs，采用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記后，以 1×106個/mL 濃度接種于縱切的 1 mm 厚骨軟骨一體化多相支架薄片上，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞生長及黏附情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 法檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架結構特征觀察
大體觀察示，骨軟骨一體化多相支架中骨層與中間層層次分明，軟骨層與中間層之間界限模糊，層與層間無縫連接。Micro-CT 觀察示，支架各層間結合緊密，未出現明顯的不連續性與相互分離。掃描電鏡觀察示，骨層結構相對致密，中間層與軟骨層結構則比較疏松，各層內的孔隙結構相互連通且均具有立體多維性。支架能量色散 X 射線光譜儀下掃描可見骨層因含有羥基磷灰石，含鈣量較高，磷元素及其他元素含量較低；而軟骨層與中間層內的礦物質含量幾乎可忽略不計。見圖 1～3。
圖1
骨軟骨一體化多相支架大體觀察及 Micro-CT 觀察
a. 大體觀察；b. Micro-CT 觀察
Figure1. Gross morphology and Micro-CT scanning observation of the osteochondral integration of multi-layered scaffolda. Gross morphology observation; b. Micro-CT scanning observation
圖2
骨軟骨一體化多相支架掃描電鏡觀察（×100）
a. 軟骨層；b. 中間層；c. 骨層
Figure2. Scanning electron microscope observation of the osteochondral integration of multi-layered scaffold （×100）a. Cartilage layer; b. Middle layer; c. Bone layer
圖3
骨軟骨一體化多相支架礦物元素分布與化學成分分析a. 軟骨層；b. 中間層；c. 骨層
Figure3.
The mineral element distribution and chemical composition analysis of the osteochondral integration of multi-layered scaffold
a. Cartilage layer; b. Middle layer; c. Bone layer
支架軟骨層、中間層、骨層孔隙率分別為 93.55%±2.90%、93.55%±4.10%、50.28%±3.20%，骨層顯著低于軟骨層和中間層，差異有統計學意義（P<0.05）；軟骨層與中間層比較差異無統計學意義（P>0.05）。支架軟骨層、中間層、骨層孔徑分別為（239.66±35.28）、（153.24±19.78）、（82.72±16.94）μm，各層間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2 支架吸水能力和力學性能檢測
軟骨層、中間層和骨層的親水性分別為（15.14±3.15）、（13.56±2.98）、（5.32±1.87）mL/g，骨層顯著低于軟骨層和中間層，差異有統計學意義（P<0.05）；軟骨層與中間層比較差異無統計學意義（P>0.05）。
軟骨層、中間層和骨層的壓縮模量分別為（51.36±13.25）、（47.93±12.74）、（155.18±19.62）kPa，骨層顯著高于軟骨層和中間層，差異有統計學意義（P<0.05）；軟骨層與中間層比較差異無統計學意義（P>0.05）。骨軟骨一體化多相支架每兩層間結合緊密，其中軟骨層與中間層的界面黏附強度為（18.21±5.16）kPa，骨層與中間層的界面黏附強度則為（16.73±6.38）kPa，比較差異無統計學意義（t=0.637，P=0.537）。
2.3 一體化支架的體外生物學評估
MTT 檢測示，兩組均能促進 L929 細胞生長，各時間點實驗組與正常組比較 A 值差異均無統計學意義（P>0.05），表明支架材料無細胞毒性。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察示，GFP 標記的大鼠 BMSCs 在縱切的支架薄片上生長分布均勻，表明支架具有良好的生物學相容性。見圖 4。
圖4
支架生物相容性檢測
a. MTT 法檢測兩組 L929 細胞增殖情況；b. 大鼠 BMSCs 在支架上的生長情況（激光掃描共聚焦顯微鏡×100）
Figure4. Scaffold biocompatibility testinga. L929 cell proliferation detected by MTT assay in 2 groups; b. The growth of BMSCs on scaffold (Laser scanning confocal microscope×100)
3 討論
由于骨軟骨組織自身有限的再生修復能力和復雜的解剖分層結構，制備具有梯度結構的多相生物材料支架已成為骨軟骨組織工程領域密切關注的焦點[7]。本研究中的骨軟骨一體化多相支架設計仿生天然骨軟骨組織中的透明軟骨層、鈣化層與軟骨下骨層[8-9]，通過選用適宜每層結構特性的生物材料，制備出結構與成分雙仿生的一體化多相骨軟骨支架。其中脫細胞軟骨細胞外基質因其來源于天然的軟骨組織，富含膠原與糖胺多糖，具有良好的生物相容性，有利于細胞的黏附與生長，是構建骨軟骨組織工程支架軟骨層的理想型材料[10]。羥基磷灰石作為骨組織中主要的無機組成成分，具有很好的力學性能和成骨誘導性，是骨軟骨一體化多相支架骨層主要的力學承載單元。4%（W/V）濃度的海藻酸鈉具有較高的生物黏性，可以很好地將納米級羥基磷灰石粉末連接固定在一起，在支架凍干交聯后保持其光滑的表面，同時海藻酸鈉良好的生物學與力學性能可以為骨軟骨的修復與再生提供適宜的微環境[11-12]。通過逐層冷凍添加上一層漿料制備支架，可使每層之間的接觸面更加平坦，同時在冷凍后的下層消融過程中及時添加上一層漿料，可形成互相滲透、交錯結合的接觸面，有效防止骨軟骨多相支架層與層之間出現分離，實現交界面緊密無縫連接的一體化設計[13-14]。
正常的骨軟骨組織中，軟骨層含有較多Ⅱ型膠原與糖胺多糖，可有效地誘導與維持來自關節腔的 MSCs 成軟骨分化[15]。本實驗通過濕法粉碎與反復差速離心制備的脫細胞軟骨細胞外基質，充分保留了天然軟骨組織中的 Ⅱ 型膠原與糖胺多糖等成分，其良好的生物學特性非常有利于種子細胞與周圍正常組織細胞的黏附與生長[16]。通過將 GFP 標記的大鼠 BMSCs 種植于骨軟骨一體化多相支架上觀察可見，細胞在支架上分布均勻且生長良好。同時通過掃描電鏡觀察支架微觀結構可見，軟骨層內孔隙間連通性良好。多相支架因有較高的孔隙率與相對較大的孔徑，故其有利于組織內細胞間氧氣與營養物質的交換，促進細胞的生長與繁殖。與軟骨層更多強調其良好的生物學特性相比，軟骨下骨層則更加關注力學性能[17-18]。目前已有多項研究證明羥基磷灰石在增強支架力學性能的同時，也可提高來自骨髓腔的 MSCs 成骨分化的能力[19-21]。但是單純的羥基磷灰石粉末在冷凍干燥后無法很好地塑形，經實驗研究發現，羥基磷灰石含量為 10%（W/V）時與 4%（W/V）濃度的海藻酸鈉和軟骨細胞外基質混合，其凍干后的軟骨下骨層支架的力學性能與吸水能力表現均衡。骨軟骨組織中鈣化層作為中間過渡層，在力學上將較軟的軟骨層與較硬的骨層連接起來，同時承受著來自 2 層間巨大的剪切應力；在生物學上鈣化層起著防止軟骨下骨層血管上侵至軟骨層，致使軟骨層骨化的作用[22-23]。因此，本研究中采用軟骨細胞外基質漿料復合海藻酸鈉，制備了既符合鈣化層生物學特性又適合其力學性能的中間過渡層支架。多相支架制備過程中采用逐層單獨冷凍后，再 3 層一體化冷凍干燥、物理化學交聯，Micro-CT 結果顯示一體化支架各層間無明顯分層現象。實驗中發現相比逐層凍干交聯法制備的多相支架，一體化凍干交聯制備出的支架各層間黏附得更加堅固[24-25]。而 MTT 檢測結果顯示，骨軟骨一體化多相支架上細胞生長情況與正常組比較差異無統計學意義，表明一體化多相支架有良好的細胞相容性。
本研究旨在制備一種新型骨軟骨一體化多相支架，并通過相關檢測驗證其生物學與力學性能，探討在骨軟骨缺損或嚴重損傷后，利用組織工程生物材料支架修復缺損區的可行性。實驗結果顯示該骨軟骨一體化多相支架具有良好的生物學與力學特性，有潛力作為骨軟骨缺損處的植入材料。但本實驗作為動物體外實驗的前期研究，難以模擬動物體內關節處復雜的微環境，對真正將該多相支架植入動物體內的修復再生表現尚不明確。因此，下一步研究應將該骨軟骨一體化多相支架植入動物體內，觀察其對骨軟骨缺損的修復再生效果，為臨床轉化與應用作進一步努力。
由于缺乏血管的特性，軟骨再生能力十分有限；此外，軟骨是無神經支配的組織，其損傷后患者疼痛感不顯著，導致軟骨表面的損傷繼續加載至軟骨下骨，造成更嚴重的骨軟骨損傷[1]。同時，臨床上嚴重的軟骨損傷后，軟骨下骨板也早已發生相應的變硬、增厚等病變。因此，在創傷與骨關節疾病后，骨軟骨損傷的整體修復常給臨床帶來巨大挑戰。傳統的骨軟骨損傷治療策略包括微骨折、關節鏡清創術、鑲嵌成形術、自體軟骨細胞移植、自體骨軟骨柱移植及異體骨軟骨柱移植等，這些方法各有其相應優勢，如微骨折與簡單的關節鏡清創術花費少、創傷小、恢復快，部分患者可二次手術[2]；自體軟骨細胞移植與自體骨軟骨柱移植則具有軟骨細胞存活率高、可重建透明軟骨表面、遠期修復效果較好的優勢。但目前這些治療手段也有其相應缺點，如易形成纖維軟骨，缺損區再生填充不完整，負重區域修復效果不明顯且容易再次復發等；同時移植物來源受限，所移植組織的來源區發病率高，缺損區的修復與周圍正常關節軟骨不吻合等一系列問題，也限制了傳統治療手段的進一步發展[3]。
組織工程技術的出現與發展為骨軟骨損傷的再生和修復帶來了新的希望。生物支架材料與種子細胞是骨軟骨組織工程的重要元素，但由于負載種子細胞型生物支架的修復方法存在花費高、需二次手術、體外細胞培養繁瑣、種子細胞來源受限和相應的社會法律等問題，限制了其進一步發展。因此通過結合正常骨軟骨所固有的結構與成分設計構建多相梯度骨軟骨支架，利用仿生型生物支架來滲透募集周圍正常軟骨細胞，同時誘導分化來自骨髓腔的宿主干細胞[4-5]，從而實現骨軟骨缺損的修復與再生，已成為當前骨軟骨組織工程領域研究的熱點之一。
本實驗在前期研究基礎上，以脫細胞軟骨細胞外基質、納米級羥基磷灰石和海藻酸鈉為原材料，成功制備了結構與成分雙重仿生的骨軟骨一體化多相支架，并進行了相關生物學與力學性能檢測，為下一步動物體內實驗提供了研究基礎，同時為未來骨軟骨的修復與再生提供一種具有希望的治療手段與方法。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
健康新鮮家豬膝關節購自本地屠宰場；納米級羥基磷灰石顆粒、海藻酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。健康 1 月齡 SD 大鼠 2 只，雌雄不限，體質量 100～200 g，購自解放軍總醫院實驗動物中心。
胰蛋白酶粉劑、脫氧核糖核酸酶（DNase）粉劑、核糖核酸酶（RNase）粉劑、EDTA、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDAC］、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（Sigma 公司，美國）；Triton X-100 溶液（J.T.Baker 公司，美國）；無水 CaCl2（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。
Milli-Q BIOCEL 超純水機（Millipore 公司，法國）；BS-8000U 去離子水過濾機（北京普亞特環保科技公司）；JYL-350A 家用九陽粉碎機（山東九陽股份有限公司）；Beckman J-25 低溫高速離心機（Beckman 公司，美國）；FD-1 冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；Bio-link 紫外交聯儀（北京博威興業科技發展有限公司）；BCPCAS-4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）； ElectroForce 3220 材料試驗機（BOSE 公司，美國）；FV-1000 激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Epoch Take 3 酶標儀（Bio-Tek 公司，美國）。
1.2 骨軟骨一體化多相支架制備
1.2.1 軟骨層漿料制備
將本地屠宰場獲取的新鮮豬膝關節用冰袋保鮮運送回實驗室，在無菌超凈臺中常規聚維酮碘溶液消毒后，打開膝關節腔，用無菌手術刀片削取股骨內外側髁及髕骨內側面的透明軟骨。將收集的透明軟骨片置于無菌瓶中，加入等體積無菌去離子水后–80℃ 冰箱過夜；PBS 液沖洗 3 遍，再加入過氧化氫置于搖床震蕩清洗 2 遍，每遍 30 min，再用無菌 PBS 液漂洗 3 遍后，盡量將其剪切成小塊置入無菌粉碎機內，加適量無菌去離子水，反復進行濕法粉碎，最后形成勻漿。將形成的原漿用無菌去離子水充分稀釋后，置入 4℃ 恒溫離心機進行差速離心：先低速離心（離心半徑 13 cm、1 500 r/min 離心 10 min）分離沉淀，保留上清液；再將上清液分別以中速（離心半徑 13 cm、3 000 r/min 離心 10 min 及離心半徑 13 cm、6 000 r/min 離心 20 min）先后離心，分離沉淀，收集上清液；最后將得到的上清懸浮液加入適量 9%NaCl，再進行高速離心（離心半徑 13 cm、10 000 r/min；離心 40 min），收集沉淀即為軟骨納米微絲原液。此過程中將收集的沉淀再次放入無菌粉碎機中，重復進行濕法粉碎與差速離心，不斷收集軟骨納米微絲原液。將收集的微絲原液分別加入 0.25% 胰蛋白酶與 3%Triton X-100，置于 4℃ 恒溫搖床中勻速攪拌各 12 h 進行脫細胞處理，然后用無菌去離子水反復清洗；再于 37℃ 條件下分別加入 DNase（50 U/mL）與 RNase（1 U/mL），攪拌均勻以去除核物質；處理完成后再次用無菌去離子水與 PBS 液反復清洗，最后低溫（4℃）高速離心（離心半徑 13 cm、10 000 r/min 離心 30 min），所得到的沉淀即為脫細胞軟骨細胞外基質。將其收集于無菌去離子水中，配制成 3%（W/V）濃度的懸液，無菌條件下保存。
1.2.2 骨層漿料的制備
不同含量的羥基磷灰石影響著支架骨層的力學性能。將納米級羥基磷灰石粉末用無菌去離子水配置成 10%（W/V）濃度的混懸液，并攪拌均勻；再將海藻酸鈉顆粒用此混懸液配置成 4%（W/V）濃度的漿料；最后與脫細胞軟骨細胞外基質混合均勻，室溫下真空狀態（<–40 kPa）進行脫氣并反復低速離心（離心半徑 13 cm、500 r/min 離心 10 min），以去除漿料中的氣泡，無菌條件下保存。
1.2.3 中間層漿料的制備
將 4%（W/V）濃度的海藻酸鈉漿料與脫細胞軟骨細胞外基質混合，然后用磁力攪拌器于 37℃ 恒溫培養箱內勻速攪動 12 h；再用超聲波震蕩處理 2 次，每次 30 min，以保證兩種漿料混合均勻。無菌條件下保存。
1.2.4 一體化制備過程
將 3 種漿料按骨層、中間層與軟骨層的順序，依次注入聚苯乙烯筒形模具（孔徑 10.2 mm、最大容積 1.7 mL）中。為使各層之間的接觸面更加平坦，在加入一層漿料后迅速將模具置入–80℃ 深低溫冰箱內，20 min 后再加入另外一層，最后加完軟骨層漿料后，將模具置入–20℃ 冰箱內至少 4 h。待完全凝固后，將樣品在冷凍干燥機內真空條件下冷凍干燥 24 h，脫模后取出支架進行交聯[6]。首先將支架置于 258 nm 波長的紫外線下，距光源 10 cm 處持續照射交聯 4 h；然后用含 EDAC（50 mmol/L）與 NHS（20 mmol/L）的 95%（V/V）乙醇溶液浸泡交聯 6～12 h，再用 5%CaCl2 交聯 2～4 h。交聯完成后用無菌去離子水反復震蕩漂洗支架，以去除殘留的交聯劑，再次冷凍干燥處理 24 h。最后將制作好的支架用 20 kGy 60Co γ 射線輻照滅菌后，4℃ 條件下密封保存備用。
1.3 觀測指標
1.3.1 支架的結構特征觀察
① 取支架進行大體觀察及 Micro-CT 觀察：通過 Micro-CT 斷層掃描成像技術，在 50 kV 電壓下進行 1 h 精細掃描，分析骨軟骨一體化多相支架每層孔隙率及孔徑大小。② 掃描電鏡觀察：將骨軟骨一體化多相支架的每層于水平面切開，并固定于鋁質底座上，進行離子濺射噴金 120 s，于 15 keV 加速電壓下進行掃描電鏡觀察。③ 能量色散 X 射線光譜儀觀察：通過能量色散 X 射線光譜儀線性掃描獲取骨軟骨一體化多相支架中每層磷和鈣以及其他主要元素的含量數據，同時組成能譜。
1.3.2 吸水能力測定
先將每層交聯后凍干的骨軟骨一體化多相支架在空氣中稱重（n=6），得到每層支架的干重（Wd）；再將其放入去離子水中浸泡 20 min，確認其完全吸水后取出支架，用濾紙輕微吸干其表面液體后再次稱重，即為濕重（Ww）。按以下公式計算支架吸水能力，即親水性：（Ww–Wd）/Wd。
1.3.3 力學測試
① 壓縮模量測定：將凍干后的支架（n=6）每層切割成直徑 9 mm、高 9 mm 的圓柱體，為使支架樣本處于完全濕潤狀態，支架在室溫下浸泡于去離子水，至測試時取出。將樣本置于定制的上下兩層剛性夾板之間，應用 ElectroForce 3220 材料試驗機，連接 250 N 載荷力學傳感器，先緩慢持續施加 0.01 N 的預負荷，確保上層剛性夾板與支架表面達到真正接觸后，再用壓頭以 0.01 mm/s 的恒定壓縮速率進行位移控制，最大應變至 20% 時停止。此時測試數據自動輸出，根據應力-應變曲線的線性變化部分，取斜率在 2%～6% 應變下對應的曲線進行線性擬合，并計算相應的壓縮模量，分析支架每層的力學性能。② 界面間黏附強度檢測：用高強度黏合劑將骨軟骨一體化多相支架固定于 ElectroForce 3220 材料試驗機上下兩層夾板間，用 250 N 的載荷力學傳感器以 0.01 mm/s 的恒定拉伸速率進行位移控制，以 3 層間任意 2 層的界面分離或 3 層各自分離為極限拉伸強度，最終測定一體化多相支架每層間的界面黏附強度。
1.3.4 MTT檢測支架的細胞毒性
① 支架浸提液制備：取支架（n=6）并計算支架表面積，按 1.25 cm2/mL 計算出所需的 DMEM 培養液量。將計算好的 DMEM 培養液加入滅菌后裝有標本的離心管內，在 37℃ 溫箱孵育 24 h 后，以離心半徑 13 cm、1 600 r/min 離心 10 min，取上清液，即為支架浸提液。② 實驗分組及 MTT 檢測方法：取鼠 L929 成纖維細胞培養使其貼壁與生長，24 h 后胰蛋白酶消化計數，將吹打均勻的細胞懸液按 0.3 mL/孔（3 000～5 000 個/孔）加入 5 塊 96 孔板，每組 3 孔。將原培養液倒掉，實驗組和對照組分別加入骨軟骨一體化多相支架浸提液和正常 DMEM 培養液進行細胞培養。培養 5 d 內每天取 1 塊板，棄去培養液，每孔加入 20 μL MTT 液于無菌培養箱內培養；4 h 后每孔加入 150 μL DMSO，震蕩均勻后上酶標儀于 492 nm 處測定吸光度（A）值。
1.3.5 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察支架生物相容性
取 SD 大鼠以頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出雙側股骨，采用全骨髓貼壁法提取并培養 BMSCs。取生長狀態良好的第 2 代 BMSCs，采用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記后，以 1×106個/mL 濃度接種于縱切的 1 mm 厚骨軟骨一體化多相支架薄片上，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞生長及黏附情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 法檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架結構特征觀察
大體觀察示，骨軟骨一體化多相支架中骨層與中間層層次分明，軟骨層與中間層之間界限模糊，層與層間無縫連接。Micro-CT 觀察示，支架各層間結合緊密，未出現明顯的不連續性與相互分離。掃描電鏡觀察示，骨層結構相對致密，中間層與軟骨層結構則比較疏松，各層內的孔隙結構相互連通且均具有立體多維性。支架能量色散 X 射線光譜儀下掃描可見骨層因含有羥基磷灰石，含鈣量較高，磷元素及其他元素含量較低；而軟骨層與中間層內的礦物質含量幾乎可忽略不計。見圖 1～3。
圖1
骨軟骨一體化多相支架大體觀察及 Micro-CT 觀察
a. 大體觀察；b. Micro-CT 觀察
Figure1. Gross morphology and Micro-CT scanning observation of the osteochondral integration of multi-layered scaffolda. Gross morphology observation; b. Micro-CT scanning observation
圖2
骨軟骨一體化多相支架掃描電鏡觀察（×100）
a. 軟骨層；b. 中間層；c. 骨層
Figure2. Scanning electron microscope observation of the osteochondral integration of multi-layered scaffold （×100）a. Cartilage layer; b. Middle layer; c. Bone layer
圖3
骨軟骨一體化多相支架礦物元素分布與化學成分分析a. 軟骨層；b. 中間層；c. 骨層
Figure3.
The mineral element distribution and chemical composition analysis of the osteochondral integration of multi-layered scaffold
a. Cartilage layer; b. Middle layer; c. Bone layer
支架軟骨層、中間層、骨層孔隙率分別為 93.55%±2.90%、93.55%±4.10%、50.28%±3.20%，骨層顯著低于軟骨層和中間層，差異有統計學意義（P<0.05）；軟骨層與中間層比較差異無統計學意義（P>0.05）。支架軟骨層、中間層、骨層孔徑分別為（239.66±35.28）、（153.24±19.78）、（82.72±16.94）μm，各層間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2 支架吸水能力和力學性能檢測
軟骨層、中間層和骨層的親水性分別為（15.14±3.15）、（13.56±2.98）、（5.32±1.87）mL/g，骨層顯著低于軟骨層和中間層，差異有統計學意義（P<0.05）；軟骨層與中間層比較差異無統計學意義（P>0.05）。
軟骨層、中間層和骨層的壓縮模量分別為（51.36±13.25）、（47.93±12.74）、（155.18±19.62）kPa，骨層顯著高于軟骨層和中間層，差異有統計學意義（P<0.05）；軟骨層與中間層比較差異無統計學意義（P>0.05）。骨軟骨一體化多相支架每兩層間結合緊密，其中軟骨層與中間層的界面黏附強度為（18.21±5.16）kPa，骨層與中間層的界面黏附強度則為（16.73±6.38）kPa，比較差異無統計學意義（t=0.637，P=0.537）。
2.3 一體化支架的體外生物學評估
MTT 檢測示，兩組均能促進 L929 細胞生長，各時間點實驗組與正常組比較 A 值差異均無統計學意義（P>0.05），表明支架材料無細胞毒性。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察示，GFP 標記的大鼠 BMSCs 在縱切的支架薄片上生長分布均勻，表明支架具有良好的生物學相容性。見圖 4。
圖4
支架生物相容性檢測
a. MTT 法檢測兩組 L929 細胞增殖情況；b. 大鼠 BMSCs 在支架上的生長情況（激光掃描共聚焦顯微鏡×100）
Figure4. Scaffold biocompatibility testinga. L929 cell proliferation detected by MTT assay in 2 groups; b. The growth of BMSCs on scaffold (Laser scanning confocal microscope×100)
3 討論
由于骨軟骨組織自身有限的再生修復能力和復雜的解剖分層結構，制備具有梯度結構的多相生物材料支架已成為骨軟骨組織工程領域密切關注的焦點[7]。本研究中的骨軟骨一體化多相支架設計仿生天然骨軟骨組織中的透明軟骨層、鈣化層與軟骨下骨層[8-9]，通過選用適宜每層結構特性的生物材料，制備出結構與成分雙仿生的一體化多相骨軟骨支架。其中脫細胞軟骨細胞外基質因其來源于天然的軟骨組織，富含膠原與糖胺多糖，具有良好的生物相容性，有利于細胞的黏附與生長，是構建骨軟骨組織工程支架軟骨層的理想型材料[10]。羥基磷灰石作為骨組織中主要的無機組成成分，具有很好的力學性能和成骨誘導性，是骨軟骨一體化多相支架骨層主要的力學承載單元。4%（W/V）濃度的海藻酸鈉具有較高的生物黏性，可以很好地將納米級羥基磷灰石粉末連接固定在一起，在支架凍干交聯后保持其光滑的表面，同時海藻酸鈉良好的生物學與力學性能可以為骨軟骨的修復與再生提供適宜的微環境[11-12]。通過逐層冷凍添加上一層漿料制備支架，可使每層之間的接觸面更加平坦，同時在冷凍后的下層消融過程中及時添加上一層漿料，可形成互相滲透、交錯結合的接觸面，有效防止骨軟骨多相支架層與層之間出現分離，實現交界面緊密無縫連接的一體化設計[13-14]。
正常的骨軟骨組織中，軟骨層含有較多Ⅱ型膠原與糖胺多糖，可有效地誘導與維持來自關節腔的 MSCs 成軟骨分化[15]。本實驗通過濕法粉碎與反復差速離心制備的脫細胞軟骨細胞外基質，充分保留了天然軟骨組織中的 Ⅱ 型膠原與糖胺多糖等成分，其良好的生物學特性非常有利于種子細胞與周圍正常組織細胞的黏附與生長[16]。通過將 GFP 標記的大鼠 BMSCs 種植于骨軟骨一體化多相支架上觀察可見，細胞在支架上分布均勻且生長良好。同時通過掃描電鏡觀察支架微觀結構可見，軟骨層內孔隙間連通性良好。多相支架因有較高的孔隙率與相對較大的孔徑，故其有利于組織內細胞間氧氣與營養物質的交換，促進細胞的生長與繁殖。與軟骨層更多強調其良好的生物學特性相比，軟骨下骨層則更加關注力學性能[17-18]。目前已有多項研究證明羥基磷灰石在增強支架力學性能的同時，也可提高來自骨髓腔的 MSCs 成骨分化的能力[19-21]。但是單純的羥基磷灰石粉末在冷凍干燥后無法很好地塑形，經實驗研究發現，羥基磷灰石含量為 10%（W/V）時與 4%（W/V）濃度的海藻酸鈉和軟骨細胞外基質混合，其凍干后的軟骨下骨層支架的力學性能與吸水能力表現均衡。骨軟骨組織中鈣化層作為中間過渡層，在力學上將較軟的軟骨層與較硬的骨層連接起來，同時承受著來自 2 層間巨大的剪切應力；在生物學上鈣化層起著防止軟骨下骨層血管上侵至軟骨層，致使軟骨層骨化的作用[22-23]。因此，本研究中采用軟骨細胞外基質漿料復合海藻酸鈉，制備了既符合鈣化層生物學特性又適合其力學性能的中間過渡層支架。多相支架制備過程中采用逐層單獨冷凍后，再 3 層一體化冷凍干燥、物理化學交聯，Micro-CT 結果顯示一體化支架各層間無明顯分層現象。實驗中發現相比逐層凍干交聯法制備的多相支架，一體化凍干交聯制備出的支架各層間黏附得更加堅固[24-25]。而 MTT 檢測結果顯示，骨軟骨一體化多相支架上細胞生長情況與正常組比較差異無統計學意義，表明一體化多相支架有良好的細胞相容性。
本研究旨在制備一種新型骨軟骨一體化多相支架，并通過相關檢測驗證其生物學與力學性能，探討在骨軟骨缺損或嚴重損傷后，利用組織工程生物材料支架修復缺損區的可行性。實驗結果顯示該骨軟骨一體化多相支架具有良好的生物學與力學特性，有潛力作為骨軟骨缺損處的植入材料。但本實驗作為動物體外實驗的前期研究，難以模擬動物體內關節處復雜的微環境，對真正將該多相支架植入動物體內的修復再生表現尚不明確。因此，下一步研究應將該骨軟骨一體化多相支架植入動物體內，觀察其對骨軟骨缺損的修復再生效果，為臨床轉化與應用作進一步努力。
