引用本文： 劉慶喜, 呂麗慧, 孫賀, 張金花, 馬文建, 張同存. 血清對神經干細胞分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(2): 223-227. doi: 10.7507/1002-1892.201710113 復制
1996 年，Reynolds 等從成年小鼠腦紋狀體中分離出具有多種分化潛能的細胞群，并正式提出“神經干細胞”概念[1-2]。隨后人們從哺乳動物中樞神經系統成功分離神經干細胞[3]。目前，神經干細胞體外分化研究已經成為神經科學研究領域的熱點。
神經元是神經系統的結構與功能單位之一，其能接受傳入信息，并將信息傳遞給其他效應細胞[4]。除神經元外，膠質細胞也是構成神經系統的主要細胞。神經細胞的功能活動主要由神經元承擔，膠質細胞起輔助作用[5]。大腦和脊髓神經元喪失會導致神經退行性疾病[6]，如阿茲海默病、肌肉萎縮性疾病、帕金森病、多發性硬化癥等。神經干細胞是一類擁有自我更新與分化潛能的細胞[7]，但神經干細胞向神經元定向分化受多種因素影響。隨著神經干細胞體外培養及誘導分化研究的深入，采用多種細胞因子以及小分子藥物誘導神經干細胞向神經元分化已取得很大進展[8-10]，相關研究所用的誘導培養基中大多含有一定比例血清，血清是由血漿去除纖維蛋白所形成的一種復雜混合物，其組成成分尚未完全明確。本實驗采用不同濃度血清培養神經干細胞，觀測神經膠質細胞、神經元標志物的變化，進一步觀察血清對神經干細胞向神經元分化過程的影響，以期為神經干細胞向神經元分化過程中血清濃度的選擇提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM/F12 培養液、EGF、bFGF、N2 添加物、B27 細胞添加物、谷丙酸二肽（Glutamax）、肝素（Heparin）、FBS、雙抗、活/死細胞染色試劑盒（GIBCO 公司，美國）；神經干細胞分散液（AccutaseTM；Sigma 公司，美國）；巢蛋白（Nestin）鼠單克隆抗體、Ⅲ 型 β 神經元微管蛋白（β-Ⅲ Tubulin）鼠單克隆抗體、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）兔單克隆抗體、山羊抗小鼠 Alexa Fluor488 二抗、山羊抗兔 Alexa Fluor647 二抗 （Abcam 公司，英國）；逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）。
超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；離心機、細胞培養箱（Thermo 公司，美國）；超純水機（Millipore-Q-Synthesis 公司，法國）；體視顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 神經干細胞分離培養及鑒定
取孕 14 d SD 大鼠 1 只，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。將 SD 大鼠引頸處死，取出胚胎，PBS 清洗 2 次；體視顯微鏡下，除去胚胎頭部兩層膜，暴露整個腦組織，分離海馬區組織并用眼科手術剪剪成 1 mm×1 mm×1mm 大小碎塊，加入 2 mL AccutaseTM，37℃ 震蕩 10 min，吸管反復吹打 20 次，消化成單細胞懸液后，以離心半徑 20 cm、1 000 r/min 離心 5 min，加入適量神經干細胞培養基（含 bFGF 10 ng/mL、EGF 20 ng/mL、HEPES 5 mmol/L、Heparin 5 mg/mL、葡萄糖 23.33 mmol/L、Glutamax 3 mmol/L、1% B27 的 DMEM/F12 培養基）重懸細胞并計數，并以 1×108個/L 密度接種于 25 cm2培養瓶中，加入神經干細胞培養基，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察神經干細胞球直徑達約 150 μm 時進行傳代。取第 3 代細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態；并行 Nestin 免疫細胞化學染色進行鑒定，鏡下觀察染色呈陽性則為神經干細胞。
1.2.2 神經干細胞分化培養
實驗分為 A、B、C 3 組，A、B、C 組細胞培養基除 FBS 濃度不同（分別為 5%、1%、0）外，其余成分均一致（F12、1% N2、1% 雙抗、1% 谷氨酰胺）[11-12]。取第 3 代神經干細胞，以 1×105個/孔接種于鼠尾膠原包被的 24 孔板，按照分組進行培養。培養第 4、8 天取細胞進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 活/死細胞染色觀察
培養第 8 天時各組取細胞以 0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min。按照試劑盒操作說明配制工作液，每孔添加 200 μL 工作液孵育 25 min，吸棄染液；0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min。熒光顯微鏡下觀察細胞生長形態，活細胞呈綠色熒光，死細胞呈紅色熒光。
1.3.2 免疫細胞化學染色觀察
培養第 4、8 天各組取細胞，棄培養基，0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min；加入 4% 多聚甲醛固定 15 min，0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min；加入 0.25% TritonX-100 作用 15 min 后羊血清封閉 30 min，添加 β-Ⅲ Tubulin（1∶250）多克隆抗體、Nestin（1∶250）單克隆抗體和 GFAP（1∶250）單克隆抗體；4℃ 過夜后加入山羊抗兔 Alexa Fluor647 和山羊抗小鼠 Alexa Fluor488 二抗，避光孵育 2 h 后 Hoechst 核染 10 min，0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min。熒光顯微鏡下觀察神經膠質細胞標記物 GFAP 與神經元標志物 β-Ⅲ Tubulin 蛋白表達，GFAP 表達呈紅色熒光、β-Ⅲ Tubulin 表達呈綠色熒光。
1.3.3 實時熒光定量 PCR 檢測
采用實時熒光定量 PCR 方法檢測 GFAP 和 β-Ⅲ Tubulin mRNA 的表達情況。培養第 4、8 天各組取 3 孔細胞，在已加入 1 mL 預冷 Trizol 的樣品中加 200 μL 預冷的氯仿，振蕩混勻，室溫放置 2 min；4℃，以離心半徑 20 cm、12 000 r/min 離心 15 min，重復 1 次。取上清至另一離心管，加等體積預冷異丙醇，4℃ 放置 10 min，同上法離心 15 min；棄上清，用 0.5 mL 冰上預冷的 75% 乙醇重懸 RNA 沉淀進行洗滌，同上法離心 5 min；棄上清，75% 乙醇洗滌 2 次，室溫干燥。用 30 μL 滅菌 DEPC 水溶解 RNA，取 2 μL 進行 RNA 凝膠電泳，其余–80℃ 保存備用。依據逆轉錄試劑盒說明書進行 cDNA 第 1 鏈合成，以 cDNA 第 1 鏈為模板進行 PCR 反應，反應體系（20 μL）包括 2×Power q PCR Pre-Mix 10 μL、上下游引物各 0.5 μL（終濃度 0.2 μmol/L）、cDNA 模板 2 μL 和 50×Rox Reference Dye 0.4 μL，最后 ddH2O 補至 20 μL。PCR 擴增序列：95℃、5 min；95℃、10 s，60℃、10 s，72℃、30 s，40 個循環；熔解曲線反應程序：95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、30 s，60℃、15 s。引物序列：β-Ⅲ Tubulin，上游：5’-CAGATGCTGGCCATTCAGAGTAAG-3’，下游：5’-TGTTGCCGATGAAGGTGGAC-3’；GFAP，上游：5’-AGGCTGCTGGAGCAAGACAA-3’，下游：5’-GCCTTAGTGGCCATTCCAGGTA-3’；β-actin，上游：5’-CAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游：5’-GACATTGCCGATAGTGATGACCT-3’。所有引物均由美國 Invitrogen 公司合成。按照公式 2–ΔΔCt 法計算 β-Ⅲ Tubulin、GFAP mRNA 相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 神經干細胞鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察，第 3 代神經干細胞呈球狀、遮光性強且不貼壁，分散生長（圖 1a）。免疫細胞化學染色示 Nestin 染色成強陽性，表明培養細胞為神經干細胞（圖 1b）。
圖1
第 3 代神經干細胞鑒定
a. 細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b. 免疫細胞化學染色觀察（熒光顯微鏡×100）
Figure1. The identification of 3rd generation neural stem cellsa. Observation of cell morphology (Inverted phase contrast microscope×100); b. Observation of immunocytochemical staining (Fluorescence microscope×100)
2.2 活/死細胞染色觀察
第 8 天，倒置相差顯微鏡下觀察 A、B、C 組細胞突觸呈伸展狀態，貼壁生長，均未出現皺縮死亡現象（圖 2a）。染色觀察 3 組細胞均呈綠色熒光，為活細胞；無呈紅色熒光的死細胞（圖 2b）。
圖2
培養第 8 天 C 組細胞觀察
a. 細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×200）；b. 活/死細胞染色觀察（熒光顯微鏡×200）
Figure2. Observation of the neural stem cells in group Ca. Observation of cell morphology (Inverted phase contrast microscope×200); b. Observation of Live/Dead cell staining (Fluorescence microscope×200)
2.3 免疫細胞化學染色觀察
培養第 4、8 天，A、B、C 組 GFAP 蛋白表達逐漸減弱，但 β-Ⅲ Tubulin 表達逐漸增強。 各組第 8 天時染色均較第 4 天時增強。見圖 3。
圖3
免疫細胞化學染色觀察（熒光顯微鏡×200）
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 第 4 天；b. 第 8 天
Figure3. Immunocytochemical staining in 3 groups (Fluorescence microscope×200)From left to right for groups A, B, and C a. At 4 days; b. At 8 days
2.4 實時熒光定量 PCR 檢測
第 4 天時，A、B、C 組 GFAP mRNA 相對表達量分別為 1.73±0.35、1.53±0.25、1±0，β-Ⅲ Tubulin mRNA 相對表達量分別為 0.47±0.24、0.67±0.23、1±0。3 組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
第 8 天時，A、B、C 組 GFAP mRNA 相對表達量分別為 4.50±1.50、3.50±0.70、2.10±0.35，β-Ⅲ Tubulin mRNA 相對表達量分別為 0.40±0.07、0.62±0.05、3.20±0.75。3 組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
神經干細胞分化機制較復雜，包括如體內細胞間相互作用、各種細胞因子相互作用、各種因子和不同受體的結合以及周圍環境對細胞的影響等[13-15]，所以神經干細胞分化過程受多種因素的制約。
血清為血液凝固后析出的淡黃色透明液體[14]，其成分十分復雜，含有大量對促進細胞生長、分化有作用的細胞因子[15-18]，目前已知的細胞因子包括神經營養因子、生長因子、細胞黏附因子等，由于多種細胞因子的存在，導致神經干細胞經含血清培養基培養后出現多向分化[19-22]。本實驗采用含不同濃度的 FBS 對神經干細胞進行分化培養，以期觀察血清對神經干細胞分化的影響。培養 8 d 后 3 組細胞均正常生長，表明在 N2 存在情況下，干細胞源性的神經細胞在低濃度和無血清培養環境中可以長時間分化生長。GFAP 是神經膠質細胞標記物，β-Ⅲ Tubulin 是神經元標志物。免疫細胞化學染色及實時熒光定量 PCR 檢測顯示，3 組神經干細胞 GFAP 蛋白與 mRNA 的表達隨著時間延長而升高；同一時間點隨著血清濃度增加，GFAP 也升高。而 β-Ⅲ Tubulin 蛋白及 mRNA 的表達隨著血清濃度及培養時間的增加均降低。該結果顯示，血清能夠促進神經干細胞向膠質細胞分化，并減緩其向神經元分化速度。因此，我們認為低濃度血清能夠更好地應用于神經干細胞向神經元分化模型。但血清影響神經干細胞分化的具體機制尚有待進一步研究明確。
1996 年，Reynolds 等從成年小鼠腦紋狀體中分離出具有多種分化潛能的細胞群，并正式提出“神經干細胞”概念[1-2]。隨后人們從哺乳動物中樞神經系統成功分離神經干細胞[3]。目前，神經干細胞體外分化研究已經成為神經科學研究領域的熱點。
神經元是神經系統的結構與功能單位之一，其能接受傳入信息，并將信息傳遞給其他效應細胞[4]。除神經元外，膠質細胞也是構成神經系統的主要細胞。神經細胞的功能活動主要由神經元承擔，膠質細胞起輔助作用[5]。大腦和脊髓神經元喪失會導致神經退行性疾病[6]，如阿茲海默病、肌肉萎縮性疾病、帕金森病、多發性硬化癥等。神經干細胞是一類擁有自我更新與分化潛能的細胞[7]，但神經干細胞向神經元定向分化受多種因素影響。隨著神經干細胞體外培養及誘導分化研究的深入，采用多種細胞因子以及小分子藥物誘導神經干細胞向神經元分化已取得很大進展[8-10]，相關研究所用的誘導培養基中大多含有一定比例血清，血清是由血漿去除纖維蛋白所形成的一種復雜混合物，其組成成分尚未完全明確。本實驗采用不同濃度血清培養神經干細胞，觀測神經膠質細胞、神經元標志物的變化，進一步觀察血清對神經干細胞向神經元分化過程的影響，以期為神經干細胞向神經元分化過程中血清濃度的選擇提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM/F12 培養液、EGF、bFGF、N2 添加物、B27 細胞添加物、谷丙酸二肽（Glutamax）、肝素（Heparin）、FBS、雙抗、活/死細胞染色試劑盒（GIBCO 公司，美國）；神經干細胞分散液（AccutaseTM；Sigma 公司，美國）；巢蛋白（Nestin）鼠單克隆抗體、Ⅲ 型 β 神經元微管蛋白（β-Ⅲ Tubulin）鼠單克隆抗體、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）兔單克隆抗體、山羊抗小鼠 Alexa Fluor488 二抗、山羊抗兔 Alexa Fluor647 二抗 （Abcam 公司，英國）；逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）。
超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；離心機、細胞培養箱（Thermo 公司，美國）；超純水機（Millipore-Q-Synthesis 公司，法國）；體視顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 神經干細胞分離培養及鑒定
取孕 14 d SD 大鼠 1 只，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。將 SD 大鼠引頸處死，取出胚胎，PBS 清洗 2 次；體視顯微鏡下，除去胚胎頭部兩層膜，暴露整個腦組織，分離海馬區組織并用眼科手術剪剪成 1 mm×1 mm×1mm 大小碎塊，加入 2 mL AccutaseTM，37℃ 震蕩 10 min，吸管反復吹打 20 次，消化成單細胞懸液后，以離心半徑 20 cm、1 000 r/min 離心 5 min，加入適量神經干細胞培養基（含 bFGF 10 ng/mL、EGF 20 ng/mL、HEPES 5 mmol/L、Heparin 5 mg/mL、葡萄糖 23.33 mmol/L、Glutamax 3 mmol/L、1% B27 的 DMEM/F12 培養基）重懸細胞并計數，并以 1×108個/L 密度接種于 25 cm2培養瓶中，加入神經干細胞培養基，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察神經干細胞球直徑達約 150 μm 時進行傳代。取第 3 代細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態；并行 Nestin 免疫細胞化學染色進行鑒定，鏡下觀察染色呈陽性則為神經干細胞。
1.2.2 神經干細胞分化培養
實驗分為 A、B、C 3 組，A、B、C 組細胞培養基除 FBS 濃度不同（分別為 5%、1%、0）外，其余成分均一致（F12、1% N2、1% 雙抗、1% 谷氨酰胺）[11-12]。取第 3 代神經干細胞，以 1×105個/孔接種于鼠尾膠原包被的 24 孔板，按照分組進行培養。培養第 4、8 天取細胞進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 活/死細胞染色觀察
培養第 8 天時各組取細胞以 0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min。按照試劑盒操作說明配制工作液，每孔添加 200 μL 工作液孵育 25 min，吸棄染液；0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min。熒光顯微鏡下觀察細胞生長形態，活細胞呈綠色熒光，死細胞呈紅色熒光。
1.3.2 免疫細胞化學染色觀察
培養第 4、8 天各組取細胞，棄培養基，0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min；加入 4% 多聚甲醛固定 15 min，0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min；加入 0.25% TritonX-100 作用 15 min 后羊血清封閉 30 min，添加 β-Ⅲ Tubulin（1∶250）多克隆抗體、Nestin（1∶250）單克隆抗體和 GFAP（1∶250）單克隆抗體；4℃ 過夜后加入山羊抗兔 Alexa Fluor647 和山羊抗小鼠 Alexa Fluor488 二抗，避光孵育 2 h 后 Hoechst 核染 10 min，0.01 mol/L PBS 浸洗 3 次，每次 5 min。熒光顯微鏡下觀察神經膠質細胞標記物 GFAP 與神經元標志物 β-Ⅲ Tubulin 蛋白表達，GFAP 表達呈紅色熒光、β-Ⅲ Tubulin 表達呈綠色熒光。
1.3.3 實時熒光定量 PCR 檢測
采用實時熒光定量 PCR 方法檢測 GFAP 和 β-Ⅲ Tubulin mRNA 的表達情況。培養第 4、8 天各組取 3 孔細胞，在已加入 1 mL 預冷 Trizol 的樣品中加 200 μL 預冷的氯仿，振蕩混勻，室溫放置 2 min；4℃，以離心半徑 20 cm、12 000 r/min 離心 15 min，重復 1 次。取上清至另一離心管，加等體積預冷異丙醇，4℃ 放置 10 min，同上法離心 15 min；棄上清，用 0.5 mL 冰上預冷的 75% 乙醇重懸 RNA 沉淀進行洗滌，同上法離心 5 min；棄上清，75% 乙醇洗滌 2 次，室溫干燥。用 30 μL 滅菌 DEPC 水溶解 RNA，取 2 μL 進行 RNA 凝膠電泳，其余–80℃ 保存備用。依據逆轉錄試劑盒說明書進行 cDNA 第 1 鏈合成，以 cDNA 第 1 鏈為模板進行 PCR 反應，反應體系（20 μL）包括 2×Power q PCR Pre-Mix 10 μL、上下游引物各 0.5 μL（終濃度 0.2 μmol/L）、cDNA 模板 2 μL 和 50×Rox Reference Dye 0.4 μL，最后 ddH2O 補至 20 μL。PCR 擴增序列：95℃、5 min；95℃、10 s，60℃、10 s，72℃、30 s，40 個循環；熔解曲線反應程序：95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、30 s，60℃、15 s。引物序列：β-Ⅲ Tubulin，上游：5’-CAGATGCTGGCCATTCAGAGTAAG-3’，下游：5’-TGTTGCCGATGAAGGTGGAC-3’；GFAP，上游：5’-AGGCTGCTGGAGCAAGACAA-3’，下游：5’-GCCTTAGTGGCCATTCCAGGTA-3’；β-actin，上游：5’-CAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游：5’-GACATTGCCGATAGTGATGACCT-3’。所有引物均由美國 Invitrogen 公司合成。按照公式 2–ΔΔCt 法計算 β-Ⅲ Tubulin、GFAP mRNA 相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 神經干細胞鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察，第 3 代神經干細胞呈球狀、遮光性強且不貼壁，分散生長（圖 1a）。免疫細胞化學染色示 Nestin 染色成強陽性，表明培養細胞為神經干細胞（圖 1b）。
圖1
第 3 代神經干細胞鑒定
a. 細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b. 免疫細胞化學染色觀察（熒光顯微鏡×100）
Figure1. The identification of 3rd generation neural stem cellsa. Observation of cell morphology (Inverted phase contrast microscope×100); b. Observation of immunocytochemical staining (Fluorescence microscope×100)
2.2 活/死細胞染色觀察
第 8 天，倒置相差顯微鏡下觀察 A、B、C 組細胞突觸呈伸展狀態，貼壁生長，均未出現皺縮死亡現象（圖 2a）。染色觀察 3 組細胞均呈綠色熒光，為活細胞；無呈紅色熒光的死細胞（圖 2b）。
圖2
培養第 8 天 C 組細胞觀察
a. 細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡×200）；b. 活/死細胞染色觀察（熒光顯微鏡×200）
Figure2. Observation of the neural stem cells in group Ca. Observation of cell morphology (Inverted phase contrast microscope×200); b. Observation of Live/Dead cell staining (Fluorescence microscope×200)
2.3 免疫細胞化學染色觀察
培養第 4、8 天，A、B、C 組 GFAP 蛋白表達逐漸減弱，但 β-Ⅲ Tubulin 表達逐漸增強。 各組第 8 天時染色均較第 4 天時增強。見圖 3。
圖3
免疫細胞化學染色觀察（熒光顯微鏡×200）
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 第 4 天；b. 第 8 天
Figure3. Immunocytochemical staining in 3 groups (Fluorescence microscope×200)From left to right for groups A, B, and C a. At 4 days; b. At 8 days
2.4 實時熒光定量 PCR 檢測
第 4 天時，A、B、C 組 GFAP mRNA 相對表達量分別為 1.73±0.35、1.53±0.25、1±0，β-Ⅲ Tubulin mRNA 相對表達量分別為 0.47±0.24、0.67±0.23、1±0。3 組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
第 8 天時，A、B、C 組 GFAP mRNA 相對表達量分別為 4.50±1.50、3.50±0.70、2.10±0.35，β-Ⅲ Tubulin mRNA 相對表達量分別為 0.40±0.07、0.62±0.05、3.20±0.75。3 組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
神經干細胞分化機制較復雜，包括如體內細胞間相互作用、各種細胞因子相互作用、各種因子和不同受體的結合以及周圍環境對細胞的影響等[13-15]，所以神經干細胞分化過程受多種因素的制約。
血清為血液凝固后析出的淡黃色透明液體[14]，其成分十分復雜，含有大量對促進細胞生長、分化有作用的細胞因子[15-18]，目前已知的細胞因子包括神經營養因子、生長因子、細胞黏附因子等，由于多種細胞因子的存在，導致神經干細胞經含血清培養基培養后出現多向分化[19-22]。本實驗采用含不同濃度的 FBS 對神經干細胞進行分化培養，以期觀察血清對神經干細胞分化的影響。培養 8 d 后 3 組細胞均正常生長，表明在 N2 存在情況下，干細胞源性的神經細胞在低濃度和無血清培養環境中可以長時間分化生長。GFAP 是神經膠質細胞標記物，β-Ⅲ Tubulin 是神經元標志物。免疫細胞化學染色及實時熒光定量 PCR 檢測顯示，3 組神經干細胞 GFAP 蛋白與 mRNA 的表達隨著時間延長而升高；同一時間點隨著血清濃度增加，GFAP 也升高。而 β-Ⅲ Tubulin 蛋白及 mRNA 的表達隨著血清濃度及培養時間的增加均降低。該結果顯示，血清能夠促進神經干細胞向膠質細胞分化，并減緩其向神經元分化速度。因此，我們認為低濃度血清能夠更好地應用于神經干細胞向神經元分化模型。但血清影響神經干細胞分化的具體機制尚有待進一步研究明確。
