引用本文： 徐燕, 魏波, 周進, 姚慶強, 王黎明, 那鍵. 多巴胺表面修飾/負載軟骨源性形態發生蛋白 1 的 3D 打印聚己內酯-羥基磷灰石三維多孔支架促進人 BMSCs 成軟骨分化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(2): 215-222. doi: 10.7507/1002-1892.201708017 復制
各種創傷和病理因素導致的關節軟骨損傷在骨科臨床極其常見。由于關節軟骨自我修復能力較差，在缺乏適當保護的情況下可加速其退行性變，最終導致嚴重的骨關節炎，給患者和社會造成極大經濟負擔和損失[1]。目前對有癥狀的骨軟骨損傷，臨床上有保守治療、關節鏡修復術、關節表面置換術及關節融合術等多種治療方案[2]。對早期有癥狀的軟骨損傷修復仍是骨科醫生面臨的挑戰。近年來，隨著 3D 打印技術的快速發展，為個性化軟骨缺損修復提供了新方法。3D 打印技術采用分層加工、疊加成形的方法，可構建具有復雜三維結構的醫用高分子支架材料，且其外形及內部結構可控、機械強度高，是修復骨軟骨損傷的理想支架材料[3]。本研究利用經多巴胺表面修飾并負載軟骨源性形態發生蛋白 1（cartilage derived morphogenetic protein 1，CDMP-1）的 3D 打印聚己內酯（polycaprolactone，PCL）-羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）三維多孔支架，接種人 BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）并在體外培養觀察，探討其向軟骨細胞分化的可行性，為最終構建簡便高效、具備個性化 3D 形態的無細胞軟骨修復材料提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、儀器
HA、PCL、鹽酸多巴胺（Sigma 公司，美國）；L-DMEM 培養基、胰蛋白酶、FBS（GIBCO 公司，美國）；hBMSCs（南京森貝伽生物科技有限公司）；Live/Dead 試劑盒（Molecular Probes 公司，美國）；DNA 提取試劑盒（Qiagen 公司，德國）。3K15 離心機（Sigma 公司，美國）；CO2 培養箱、–80℃ 深低溫冰箱（SANYO 公司，日本）；S4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；DM16000B 倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad 公司，美國）；UV-2450 紫外分光光度計（Shimadzu 公司，日本）；實時熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；3D FDM3000 系統（Stratasys 公司，美國）；SL200B 接觸角測試儀（Kino 公司，美國）；Micro-CT（Siemens 公司，德國）。Geomagic Studio 11.0 軟件（3D systems 公司，美國）。
1.2 支架材料的制備及相關觀測
1.2.1 3D 打印技術制備 PCL-HA 三維多孔支架材料
參照 Yao 等[4]方法，基于熔融沉積造型技術制備 3D 打印 PCL-HA 圓柱體狀三維多孔支架材料。先利用 Geomagic Studio 11.0 軟件進行 PCL-HA 三維多孔支架的計算機輔助設計，然后轉換成 STL 格式并輸入 3D 生物打印機，采用生物擠壓方法進行打印。3D 生物打印機采用直徑 200 μm 噴頭，行走速度 3 mm/min，層厚 200 μm，由打印機按預設參數熔融材料后在 x、y、z 軸 3 個方向分別噴涂成型完成支架打印。將初步制備的支架材料行支撐材料修整及邊角修飾。
1.2.2 多巴胺修飾及 CDMP-1 加載
參照 Poh 等[5]方法，用多巴胺對 3D 打印制備的 PCL-HA 三維多孔支架進行表面修飾。以 10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液為溶劑配制 2 mg/mL 多巴胺溶液；將 PCL-HA 三維多孔支架浸入多巴胺溶液中，室溫避光磁力攪拌（1 000 r/min）24 h 后，蒸餾水反復沖洗去除未聚合的多巴胺，于 60℃ 烘干過夜。然后將上述經多巴胺修飾的 PCL-HA 三維多孔支架置于 100 ng/mL CDMP-1 溶液中，低速（400 r/min）攪拌 24 h，于 37℃ 真空干燥箱充分干燥后常溫保存。
1.2.3 實驗分組及支架性能觀測
取 PCL-HA 三維多孔支架、經多巴胺修飾的 PCL-HA 三維多孔支架及經多巴胺修飾并加載 CDMP-1 的 PCL-HA 三維多孔支架，分別設為 A、B、C 組，進行以下檢測。① 掃描電鏡觀察：將 3 組支架材料用導電膠帶固定于銅測試臺上，表面噴金處理（噴金平均厚度為 24 nm），于掃描電鏡下觀測支架形貌特征。② 孔隙率測量：應用 Micro-CT 掃描 3 組支架材料（n=5），并用 Inveon research workplace 軟件進行三維重建，根據閾值對比法得到空隙體積，根據以下公式計算孔隙率：孔隙率=空隙體積/總體積×100%。③ 支架表面水靜態接觸角測試：采用 SL200B 接觸角測試儀對 3 組支架材料表面水靜態接觸角進行測試，表征其表面親水性。測試方法：以蒸餾水作為滴定液體，在室溫和合適濕度下，將蒸餾水緩慢滴至支架表面，記錄液滴與支架材料表面接觸瞬間的圖像，計算得到水靜態接觸角；每個支架測試 3 個不同的表面區域，取平均值。
1.3 支架材料促進 hBMSCs 成軟骨分化相關檢測
1.3.1 hBMSCs 培養及傳代
取出液氮保存的 hBMSCs，用含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液重懸細胞，復蘇接種（4.0×104 個/cm2 密度）于 T25 培養瓶中，于 37℃、5%CO2以及飽和濕度培養箱中靜置培養； 24 h 后半量換液，此后每隔 2～3 d 換液 1 次；當貼壁細胞鋪滿瓶底達 70%～80% 融合時，0.25% 胰蛋白酶消化傳代，按 1∶3 比例將細胞接種至新的培養瓶，取第 3 代細胞用于后續實驗。
1.3.2 支架材料的消毒
將 3 組支架材料置于 24 孔板中，加入 75% 乙醇浸泡 4 h，移棄乙醇，置超凈臺的無菌器皿中晾干 1 h，同時行紫外燈照射。將消毒處理后的支架材料用于后續細胞實驗。
1.3.3 細胞黏附實驗
取 3 組支架材料（n=9）置于 6 孔培養板底部，每個支架按 5×104 個/10 μL 的量接種 hBMSCs（此時細胞量記為 C0）細胞懸液，將細胞懸液用滴管緩慢滴于支架上，盡量使細胞懸液不要溢出支架。之后迅速將 6 孔板置于 37℃、5%CO2以及飽和濕度培養箱中培養 2 h，以便細胞充分黏附到支架上。加入成軟骨誘導培養液（含 1 nmol/L 地塞米松、6.25 μg/mL 胰島素、37.5 μg/mL 2-磷酸抗壞血酸鹽、10 ng/mL TGF-
的 H-DMEM 培養液），培養 24 h。棄培養液，取出細胞-支架復合物轉移至新的 6 孔培養板，PBS 洗 2 遍，加入 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化細胞；然后加入血清終止消化，移入 10 mL 離心管，以離心半徑 10 cm、800 r/min 離心 5 min；棄上清，以 L-DMEM 培養液混懸細胞，同時行每孔底細胞計數，細胞量記為 C1。按以下公式計算支架上細胞黏附率：細胞黏附率=（C0–C1）/C0×100%。
1.3.4 細胞增殖實驗
當 3 組細胞-支架復合物成軟骨誘導培養 1、4、7、14、21 d 后，棄孔板中的培養基。將 MTT 溶液經新鮮培養基稀釋 10 倍后，加入培養板孔并置于 37℃ 培養箱避光孵育 4 h。然后自每個樣品吸取 200 μL 混合液加入 96 孔板，置酶標儀 450 nm 波長下測定各孔吸光度（A）值，每組設 5 個復孔。
1.3.5 細胞活性檢測
3 組細胞-支架復合物成軟骨誘導培養 1、7、14 d 后，用 Live/Dead 試劑盒檢測細胞活性。將細胞-支架復合物用 PBS 洗滌 3 遍后，與 Live/Dead 試劑盒的工作液（2 μmol/L Calcein AM 和 4 μmol/L EthD-1）室溫孵育 60 min，最后用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞熒光信號，活細胞顯示為綠色，死細胞為紅色。
1.3.6 實時熒光定量 PCR 檢測軟骨特異基質基因表達
3 組細胞-支架復合物成軟骨誘導培養 7、14、21 d 后，采用實時熒光定量 PCR 檢測軟骨特異基質Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因表達。所有引物設計合成均由南京凱基生物技術有限公司完成，引物序列參照文獻[6]：GAPDH 為內參，上游引物：5’-TCGGAGTGAACGGATTTGG-3’，下游引物：5’-GCCAGAGTTAAAAGCAGCCCT-3’；Ⅱ型膠原上游引物：5’-CAGGTGAAGGTGGGAAACCA-3’，下游引物：5’-ACCCACGAGGCCAGGAG-3’；Aggrecan 上游引物；5’-CCCAACCAGCCTGACAA-3’；下游引物：5’-CCTTCTCGTGCCAGATCATCA-3’。將 3 組標本稱重后置于冰上，加入 Trizol 試劑，并加入氯仿、異丙醇提取 RNA。采用實時熒光定量 PCR 檢測樣本中Ⅱ型膠原 mRNA 和 Aggrecan mRNA相對表達量，每個樣本重復檢測 3 次。
1.4 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料相關觀測
2.1.1 大體觀察及掃描電鏡觀察
3 組 PCL-HA 三維多孔支架均為直徑 7 mm、高 2 mm 的圓柱體形狀；A 組支架顏色為白色，經多巴胺表面修飾后 B、C 組支架顏色均為較深的棕色。掃描電鏡觀察示，支架為三維多孔狀結構，孔洞相互聯通，孔徑為 400～500 μm，孔隙率 56%，材料纖維走向為 0°/90°。見圖 1。
2.1.2 支架表面水靜態接觸角檢測
A 組支架材料表面水靜態接觸角為 76°；經多巴胺改性后的 B、C 兩組支架材料表面水靜態接觸角均為 0°。見圖 2。
2.2 支架材料促 hBMSCs 成軟骨分化相關觀測
2.2.1 細胞黏附實驗
成軟骨誘導培養后 24 h，A、B、C 組細胞黏附率分別為 34.3%±3.5%、48.3%±1.5%、57.4%±2.5%，C 組細胞黏附率顯著高于 A 、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.2 細胞增殖實驗
3 組細胞在支架上的 A 值均隨培養時間延長而增大。培養后 4、7、14、21 d，C 組 A 值顯著高于 A、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
2.2.3 細胞活性檢測
熒光顯微鏡觀察示，培養 1、7、14 d，3 組支架內的細胞幾乎均被染成綠色，有較好的細胞活性。見圖 4。
2.2.4 實時熒光定量 PCR 檢測軟骨特異基質基因表達
隨培養時間延長，3 組支架Ⅱ型膠原 mRNA 和 Aggrecan mRNA 相對表達量均逐漸增加。培養后 14、21 d，C 組 Aggrecan mRNA 相對表達量均顯著高于 A、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；但培養后 7 d，3 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。而培養后各時間點 A、B、C 組間Ⅱ型膠原 mRNA 相對表達量比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖1
3 組支架材料大體觀察及掃描電鏡觀察
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 大體觀察；b. 掃描電鏡觀察（×30）
Figure1. General observation and scanning electron microscope observation of scaffold materials in 3 groupsFrom left to right for groups A, B, and C respectively a. General observation; b. Scanning electron microscope observation (×30)
圖2
3 組支架材料表面水靜態接觸角
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. The water static contact angle of the scaffold surface in 3 groupsa. Group A; b. Group B; c. Group C
圖3
MTT 法檢測培養不同時間點 3 組支架上細胞黏附情況
Figure3.
Cell adhesion detection of scaffolds in 3 groups at different time points by MTT method
圖4
培養各時間點各組支架內細胞活性檢測（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為培養后 1、7、14 d a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Cell activity detection of each group at different time pointsFrom left to right for cultured for 1, 7, and 14 days respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
圖5
實時熒光定量 PCR 檢測各組軟骨特異基質基因表達
a. Ⅱ型膠原；b. Aggrecan
Figure5. Specific gene expression detection of cartilage matrix in each group by real-time fluorescence quantitative PCRa. Collagen type Ⅱ; b. Aggrecan
3 討論
3.1 3D 打印技術在軟骨組織工程支架制備中的應用
軟骨缺損修復是骨科臨床難題。組織工程技術的發展，給軟骨缺損修復帶來了希望，其中支架材料的機械及生物屬性是軟骨再生的關鍵因素。軟骨組織工程支架的設計，既要考慮到細胞及組織的生長，也要考慮到支架的機械性能及降解速度等。以往的組織工程技術（尤其是第二、三代組織工程軟骨修復技術）主要是模仿細胞外基質制備生物支架，在體外將細胞種植于支架上，這種支架材料制備方法不能控制支架的幾何學參數（如孔徑、多孔性等），并且也無法制備復雜的三維結構[7-8]。近年來借助于計算機輔助設計和 3D 打印技術，使用醫用高分子材料構建的 3D 打印多孔支架，其外形及內部結構可控、機械強度高，是修復軟骨損傷的理想支架材料[9]。
3D 打印技術采用分層加工、疊加成形的方法，可以制造出任意復雜的三維結構，成形過程與人體關節的復雜程度無直接關系[10]。同時，通過調節打印粉末顆粒的大小或改變切層的填充方式，就可以改變孔隙率和孔徑大小，非常適合制造符合組織工程學需要、適應細胞生長的人工骨軟骨支架。同時 3D 打印技術制備人工支架材料具有生產周期短和成本低等優點，能滿足臨床上的大量需求。隨著精密制造技術在生物材料領域應用的不斷發展，實現骨軟骨個性化修復已日益明晰[10]。
3.2 無細胞支架及其負載生物活性因子方法的局限性
PCL 是目前研究最多、應用最廣的脂肪族聚酯類生物材料，由于其酯鍵容易發生水解而導致主鏈斷裂，在人體內可以完全降解，產物為 CO2 和 H2O，并通過新陳代謝排出體外[11]。我們在前期研究中使用質量比為 7∶3 的 PCL-HA 混合材料構建了 3D 打印支架，并與自體骨髓血相復合，進行體外直接誘導培養和體內植入實驗，得到了具有特定形狀與良好機械性能的新生軟骨組織；但該支架在軟骨誘導過程中不具備穩定可靠的透明軟骨再生能力，易產生纖維軟骨樣組織[4]。由于尚無有效的技術手段對其進行調控，這也是迄今制約軟骨組織工程技術進一步發展與臨床應用急需解決的關鍵問題[12]。
為了實現可靠的透明軟骨再生，我們需要深入了解軟骨誘導分化過程中支架材料內種子細胞的生物學行為與支架內透明軟骨基質積聚的關系，從而解決上述問題。研究表明，使用特定生長因子實現對細胞增殖、分化、透明軟骨基質表達的調控，提高軟骨支架再生性能[13]，并由此產生了無細胞支架材料的概念。無細胞支架不僅摒棄了負載各種源性干細胞涉及的倫理問題，而且負載的生物活性因子能促進其與期望的細胞底物間相互作用并增強細胞功能。
支架材料表面生物活性因子的負載方式大體可分為可溶性和固定化兩種，兩種方式負載的生物活性因子均與細胞上的受體結合[14]。但研究表明，可溶性生物活性因子會參與宿主細胞的胞吞作用，隨之快速降解，使得它對細胞的作用時間及效能非常有限；而固定化生物活性因子卻能抑制宿主細胞的胞吞作用，顯著抑制其濃度的快速下降，對細胞的作用時間和效能維持長久[14]。為了達到生物活性因子在材料底物上的固定化附著，大多需要復雜的程序及對底物和生長因子的廣泛修飾。理論上固定生物活性因子的方案，最好能利用因子蛋白表面暴露的功能基團，如氨基、羧基和硫醇基等，使其與合適的底物之間形成化學共價鍵[14-15]。如果生物活性因子的蛋白質或多肽未能形成化學共價鍵的功能基團，則需要對材料底物表面進行預處理來達到目的。Sharon 等[15]為將 VEGF 較牢固地附著于 PLGA 上，事先用高碘酸鹽氧化預處理，然后通過醛糖氧化糖蛋白上的多糖殘基使 VEGF 穩定地與酰肼衍生化的 PLGA 結合。但由此帶來的弊端是改變了材料底物本身的生物效應。因此，支架材料表面生物活性因子的固定化，應盡可能使用簡便有效的功能化程序，才不會改變植入材料和生長因子的效能。
3.3 多巴胺對生物材料表面改性和負載 CDPM-1 支架的應用
有研究發現，來源于海洋貝類生物的黏附蛋白可在溶液中發生氧化聚合，并能在多種材料的表面形成黏附層，是一種天然的膠黏劑[16]。而多巴胺就是這種黏附蛋白的關鍵成分，幾乎可以黏附在任何材料表面，有效改善材料表面的親水性和細胞相容性；尤為重要的是，其形成的聚多巴胺層可以作為二級反應平臺，在材料表面進一步修飾生物活性分子，賦予材料優異的生物學性能[16-17]。
由于多巴胺改性過程無溶劑、無毒、簡便高效，因此國內外有很多相關報道[17-20]。Lai 等[18]和 Chien 等[19]均對 Ti 合金表面進行了改性并引入 BMP-2 等活性物質，研究表明均能促進 BMSCs 的增殖分化、ALP 分泌及礦化。Kim 等[20]利用多巴胺將乳鐵蛋白固定在 PLGA 多孔微球表面，誘導兔脂肪干細胞成骨分化，結果顯示提高了 ALP 分泌、鈣沉積及成骨相關基質蛋白 mRNA 表達。
本實驗就利用了多巴胺優異的生物黏附性能。首先我們采用溶液澆鑄法，使多巴胺在 3D 打印支架表面發生氧化自聚合，反應產物（聚多巴胺）均勻覆蓋于材料表面[21]；然后借助它的二級反應平臺，通過邁克爾加成反應（Michael addition reaction）或席夫堿反應（Schiff base reaction）[16]，從而將生物活性物質 CDMP-1 引入到材料表面。結果顯示多巴胺的引入對 PCL-HA 三維多孔支架材料的生物學性能影響較大，降低了材料表面水靜態接觸角，改善了材料的親水性能。將 hBMSCs 以靜態培養法接種于 3 組支架，結果發現經多巴胺改性后的材料對細胞黏附和增殖都有明顯促進作用，且對細胞活性無毒性作用。
CDMP-1 是 Hotten 等[22]首先從人胚胎 cDNA 庫中發現的一種多肽生長因子，研究證明其作用于大鼠肢體芽細胞可誘導間質聚合和軟骨形成。此外，CDMP-1 作用于人軟骨細胞，可抑制軟骨細胞外基質相關降解酶——基質金屬蛋白酶 13 和 ADAMTS4 的表達，同時呈劑量依賴性增強軟骨合成代謝相關基因 SOX9 和 Aggrecan 的表達[23]。本研究利用多巴胺的黏附特性，在 PCL-HA 三維多孔支架表面引入 CDMP-1，與 hBMSCs 成軟骨誘導培養后進行基因檢測來驗證其促軟骨分化的功能特性。結果顯示各組軟骨特異基質Ⅱ型膠原 mRNA 和 Aggrecan mRNA 表達均呈明顯上升趨勢；且培養 7、14、21 d Ⅱ型膠原 mRNA 相對表達量及培養 14、21 d Aggrecan mRNA 相對表達量，3 組間比較差異均有統計學意義。因此，多巴胺作為天然黏附劑，對干細胞無毒性，且對 CDMP-1 的生物功效無不良影響，保留了 CDMP-1 體外刺激 hBMSCs 成軟骨分化的生物活性。
本研究局限性在于：首先，100 ng/mL CDMP-1 濃度是參照文獻報道使用的濃度，我們并未優化選擇濃度；其次，本研究的體外培養時間終點為 21 d，未來尚需培養更長時間后檢測，同時還需了解無細胞支架體內植入后的促軟骨再生作用；最后，仍需進一步探討其他軟骨分化特異基質，如Ⅹ型膠原、SOX9 基因和蛋白水平的變化。
各種創傷和病理因素導致的關節軟骨損傷在骨科臨床極其常見。由于關節軟骨自我修復能力較差，在缺乏適當保護的情況下可加速其退行性變，最終導致嚴重的骨關節炎，給患者和社會造成極大經濟負擔和損失[1]。目前對有癥狀的骨軟骨損傷，臨床上有保守治療、關節鏡修復術、關節表面置換術及關節融合術等多種治療方案[2]。對早期有癥狀的軟骨損傷修復仍是骨科醫生面臨的挑戰。近年來，隨著 3D 打印技術的快速發展，為個性化軟骨缺損修復提供了新方法。3D 打印技術采用分層加工、疊加成形的方法，可構建具有復雜三維結構的醫用高分子支架材料，且其外形及內部結構可控、機械強度高，是修復骨軟骨損傷的理想支架材料[3]。本研究利用經多巴胺表面修飾并負載軟骨源性形態發生蛋白 1（cartilage derived morphogenetic protein 1，CDMP-1）的 3D 打印聚己內酯（polycaprolactone，PCL）-羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）三維多孔支架，接種人 BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）并在體外培養觀察，探討其向軟骨細胞分化的可行性，為最終構建簡便高效、具備個性化 3D 形態的無細胞軟骨修復材料提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、儀器
HA、PCL、鹽酸多巴胺（Sigma 公司，美國）；L-DMEM 培養基、胰蛋白酶、FBS（GIBCO 公司，美國）；hBMSCs（南京森貝伽生物科技有限公司）；Live/Dead 試劑盒（Molecular Probes 公司，美國）；DNA 提取試劑盒（Qiagen 公司，德國）。3K15 離心機（Sigma 公司，美國）；CO2 培養箱、–80℃ 深低溫冰箱（SANYO 公司，日本）；S4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；DM16000B 倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad 公司，美國）；UV-2450 紫外分光光度計（Shimadzu 公司，日本）；實時熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；3D FDM3000 系統（Stratasys 公司，美國）；SL200B 接觸角測試儀（Kino 公司，美國）；Micro-CT（Siemens 公司，德國）。Geomagic Studio 11.0 軟件（3D systems 公司，美國）。
1.2 支架材料的制備及相關觀測
1.2.1 3D 打印技術制備 PCL-HA 三維多孔支架材料
參照 Yao 等[4]方法，基于熔融沉積造型技術制備 3D 打印 PCL-HA 圓柱體狀三維多孔支架材料。先利用 Geomagic Studio 11.0 軟件進行 PCL-HA 三維多孔支架的計算機輔助設計，然后轉換成 STL 格式并輸入 3D 生物打印機，采用生物擠壓方法進行打印。3D 生物打印機采用直徑 200 μm 噴頭，行走速度 3 mm/min，層厚 200 μm，由打印機按預設參數熔融材料后在 x、y、z 軸 3 個方向分別噴涂成型完成支架打印。將初步制備的支架材料行支撐材料修整及邊角修飾。
1.2.2 多巴胺修飾及 CDMP-1 加載
參照 Poh 等[5]方法，用多巴胺對 3D 打印制備的 PCL-HA 三維多孔支架進行表面修飾。以 10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液為溶劑配制 2 mg/mL 多巴胺溶液；將 PCL-HA 三維多孔支架浸入多巴胺溶液中，室溫避光磁力攪拌（1 000 r/min）24 h 后，蒸餾水反復沖洗去除未聚合的多巴胺，于 60℃ 烘干過夜。然后將上述經多巴胺修飾的 PCL-HA 三維多孔支架置于 100 ng/mL CDMP-1 溶液中，低速（400 r/min）攪拌 24 h，于 37℃ 真空干燥箱充分干燥后常溫保存。
1.2.3 實驗分組及支架性能觀測
取 PCL-HA 三維多孔支架、經多巴胺修飾的 PCL-HA 三維多孔支架及經多巴胺修飾并加載 CDMP-1 的 PCL-HA 三維多孔支架，分別設為 A、B、C 組，進行以下檢測。① 掃描電鏡觀察：將 3 組支架材料用導電膠帶固定于銅測試臺上，表面噴金處理（噴金平均厚度為 24 nm），于掃描電鏡下觀測支架形貌特征。② 孔隙率測量：應用 Micro-CT 掃描 3 組支架材料（n=5），并用 Inveon research workplace 軟件進行三維重建，根據閾值對比法得到空隙體積，根據以下公式計算孔隙率：孔隙率=空隙體積/總體積×100%。③ 支架表面水靜態接觸角測試：采用 SL200B 接觸角測試儀對 3 組支架材料表面水靜態接觸角進行測試，表征其表面親水性。測試方法：以蒸餾水作為滴定液體，在室溫和合適濕度下，將蒸餾水緩慢滴至支架表面，記錄液滴與支架材料表面接觸瞬間的圖像，計算得到水靜態接觸角；每個支架測試 3 個不同的表面區域，取平均值。
1.3 支架材料促進 hBMSCs 成軟骨分化相關檢測
1.3.1 hBMSCs 培養及傳代
取出液氮保存的 hBMSCs，用含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液重懸細胞，復蘇接種（4.0×104 個/cm2 密度）于 T25 培養瓶中，于 37℃、5%CO2以及飽和濕度培養箱中靜置培養； 24 h 后半量換液，此后每隔 2～3 d 換液 1 次；當貼壁細胞鋪滿瓶底達 70%～80% 融合時，0.25% 胰蛋白酶消化傳代，按 1∶3 比例將細胞接種至新的培養瓶，取第 3 代細胞用于后續實驗。
1.3.2 支架材料的消毒
將 3 組支架材料置于 24 孔板中，加入 75% 乙醇浸泡 4 h，移棄乙醇，置超凈臺的無菌器皿中晾干 1 h，同時行紫外燈照射。將消毒處理后的支架材料用于后續細胞實驗。
1.3.3 細胞黏附實驗
取 3 組支架材料（n=9）置于 6 孔培養板底部，每個支架按 5×104 個/10 μL 的量接種 hBMSCs（此時細胞量記為 C0）細胞懸液，將細胞懸液用滴管緩慢滴于支架上，盡量使細胞懸液不要溢出支架。之后迅速將 6 孔板置于 37℃、5%CO2以及飽和濕度培養箱中培養 2 h，以便細胞充分黏附到支架上。加入成軟骨誘導培養液（含 1 nmol/L 地塞米松、6.25 μg/mL 胰島素、37.5 μg/mL 2-磷酸抗壞血酸鹽、10 ng/mL TGF-
的 H-DMEM 培養液），培養 24 h。棄培養液，取出細胞-支架復合物轉移至新的 6 孔培養板，PBS 洗 2 遍，加入 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化細胞；然后加入血清終止消化，移入 10 mL 離心管，以離心半徑 10 cm、800 r/min 離心 5 min；棄上清，以 L-DMEM 培養液混懸細胞，同時行每孔底細胞計數，細胞量記為 C1。按以下公式計算支架上細胞黏附率：細胞黏附率=（C0–C1）/C0×100%。
1.3.4 細胞增殖實驗
當 3 組細胞-支架復合物成軟骨誘導培養 1、4、7、14、21 d 后，棄孔板中的培養基。將 MTT 溶液經新鮮培養基稀釋 10 倍后，加入培養板孔并置于 37℃ 培養箱避光孵育 4 h。然后自每個樣品吸取 200 μL 混合液加入 96 孔板，置酶標儀 450 nm 波長下測定各孔吸光度（A）值，每組設 5 個復孔。
1.3.5 細胞活性檢測
3 組細胞-支架復合物成軟骨誘導培養 1、7、14 d 后，用 Live/Dead 試劑盒檢測細胞活性。將細胞-支架復合物用 PBS 洗滌 3 遍后，與 Live/Dead 試劑盒的工作液（2 μmol/L Calcein AM 和 4 μmol/L EthD-1）室溫孵育 60 min，最后用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞熒光信號，活細胞顯示為綠色，死細胞為紅色。
1.3.6 實時熒光定量 PCR 檢測軟骨特異基質基因表達
3 組細胞-支架復合物成軟骨誘導培養 7、14、21 d 后，采用實時熒光定量 PCR 檢測軟骨特異基質Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因表達。所有引物設計合成均由南京凱基生物技術有限公司完成，引物序列參照文獻[6]：GAPDH 為內參，上游引物：5’-TCGGAGTGAACGGATTTGG-3’，下游引物：5’-GCCAGAGTTAAAAGCAGCCCT-3’；Ⅱ型膠原上游引物：5’-CAGGTGAAGGTGGGAAACCA-3’，下游引物：5’-ACCCACGAGGCCAGGAG-3’；Aggrecan 上游引物；5’-CCCAACCAGCCTGACAA-3’；下游引物：5’-CCTTCTCGTGCCAGATCATCA-3’。將 3 組標本稱重后置于冰上，加入 Trizol 試劑，并加入氯仿、異丙醇提取 RNA。采用實時熒光定量 PCR 檢測樣本中Ⅱ型膠原 mRNA 和 Aggrecan mRNA相對表達量，每個樣本重復檢測 3 次。
1.4 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料相關觀測
2.1.1 大體觀察及掃描電鏡觀察
3 組 PCL-HA 三維多孔支架均為直徑 7 mm、高 2 mm 的圓柱體形狀；A 組支架顏色為白色，經多巴胺表面修飾后 B、C 組支架顏色均為較深的棕色。掃描電鏡觀察示，支架為三維多孔狀結構，孔洞相互聯通，孔徑為 400～500 μm，孔隙率 56%，材料纖維走向為 0°/90°。見圖 1。
2.1.2 支架表面水靜態接觸角檢測
A 組支架材料表面水靜態接觸角為 76°；經多巴胺改性后的 B、C 兩組支架材料表面水靜態接觸角均為 0°。見圖 2。
2.2 支架材料促 hBMSCs 成軟骨分化相關觀測
2.2.1 細胞黏附實驗
成軟骨誘導培養后 24 h，A、B、C 組細胞黏附率分別為 34.3%±3.5%、48.3%±1.5%、57.4%±2.5%，C 組細胞黏附率顯著高于 A 、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.2 細胞增殖實驗
3 組細胞在支架上的 A 值均隨培養時間延長而增大。培養后 4、7、14、21 d，C 組 A 值顯著高于 A、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
2.2.3 細胞活性檢測
熒光顯微鏡觀察示，培養 1、7、14 d，3 組支架內的細胞幾乎均被染成綠色，有較好的細胞活性。見圖 4。
2.2.4 實時熒光定量 PCR 檢測軟骨特異基質基因表達
隨培養時間延長，3 組支架Ⅱ型膠原 mRNA 和 Aggrecan mRNA 相對表達量均逐漸增加。培養后 14、21 d，C 組 Aggrecan mRNA 相對表達量均顯著高于 A、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；但培養后 7 d，3 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。而培養后各時間點 A、B、C 組間Ⅱ型膠原 mRNA 相對表達量比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖1
3 組支架材料大體觀察及掃描電鏡觀察
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 大體觀察；b. 掃描電鏡觀察（×30）
Figure1. General observation and scanning electron microscope observation of scaffold materials in 3 groupsFrom left to right for groups A, B, and C respectively a. General observation; b. Scanning electron microscope observation (×30)
圖2
3 組支架材料表面水靜態接觸角
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. The water static contact angle of the scaffold surface in 3 groupsa. Group A; b. Group B; c. Group C
圖3
MTT 法檢測培養不同時間點 3 組支架上細胞黏附情況
Figure3.
Cell adhesion detection of scaffolds in 3 groups at different time points by MTT method
圖4
培養各時間點各組支架內細胞活性檢測（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為培養后 1、7、14 d a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Cell activity detection of each group at different time pointsFrom left to right for cultured for 1, 7, and 14 days respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
圖5
實時熒光定量 PCR 檢測各組軟骨特異基質基因表達
a. Ⅱ型膠原；b. Aggrecan
Figure5. Specific gene expression detection of cartilage matrix in each group by real-time fluorescence quantitative PCRa. Collagen type Ⅱ; b. Aggrecan
3 討論
3.1 3D 打印技術在軟骨組織工程支架制備中的應用
軟骨缺損修復是骨科臨床難題。組織工程技術的發展，給軟骨缺損修復帶來了希望，其中支架材料的機械及生物屬性是軟骨再生的關鍵因素。軟骨組織工程支架的設計，既要考慮到細胞及組織的生長，也要考慮到支架的機械性能及降解速度等。以往的組織工程技術（尤其是第二、三代組織工程軟骨修復技術）主要是模仿細胞外基質制備生物支架，在體外將細胞種植于支架上，這種支架材料制備方法不能控制支架的幾何學參數（如孔徑、多孔性等），并且也無法制備復雜的三維結構[7-8]。近年來借助于計算機輔助設計和 3D 打印技術，使用醫用高分子材料構建的 3D 打印多孔支架，其外形及內部結構可控、機械強度高，是修復軟骨損傷的理想支架材料[9]。
3D 打印技術采用分層加工、疊加成形的方法，可以制造出任意復雜的三維結構，成形過程與人體關節的復雜程度無直接關系[10]。同時，通過調節打印粉末顆粒的大小或改變切層的填充方式，就可以改變孔隙率和孔徑大小，非常適合制造符合組織工程學需要、適應細胞生長的人工骨軟骨支架。同時 3D 打印技術制備人工支架材料具有生產周期短和成本低等優點，能滿足臨床上的大量需求。隨著精密制造技術在生物材料領域應用的不斷發展，實現骨軟骨個性化修復已日益明晰[10]。
3.2 無細胞支架及其負載生物活性因子方法的局限性
PCL 是目前研究最多、應用最廣的脂肪族聚酯類生物材料，由于其酯鍵容易發生水解而導致主鏈斷裂，在人體內可以完全降解，產物為 CO2 和 H2O，并通過新陳代謝排出體外[11]。我們在前期研究中使用質量比為 7∶3 的 PCL-HA 混合材料構建了 3D 打印支架，并與自體骨髓血相復合，進行體外直接誘導培養和體內植入實驗，得到了具有特定形狀與良好機械性能的新生軟骨組織；但該支架在軟骨誘導過程中不具備穩定可靠的透明軟骨再生能力，易產生纖維軟骨樣組織[4]。由于尚無有效的技術手段對其進行調控，這也是迄今制約軟骨組織工程技術進一步發展與臨床應用急需解決的關鍵問題[12]。
為了實現可靠的透明軟骨再生，我們需要深入了解軟骨誘導分化過程中支架材料內種子細胞的生物學行為與支架內透明軟骨基質積聚的關系，從而解決上述問題。研究表明，使用特定生長因子實現對細胞增殖、分化、透明軟骨基質表達的調控，提高軟骨支架再生性能[13]，并由此產生了無細胞支架材料的概念。無細胞支架不僅摒棄了負載各種源性干細胞涉及的倫理問題，而且負載的生物活性因子能促進其與期望的細胞底物間相互作用并增強細胞功能。
支架材料表面生物活性因子的負載方式大體可分為可溶性和固定化兩種，兩種方式負載的生物活性因子均與細胞上的受體結合[14]。但研究表明，可溶性生物活性因子會參與宿主細胞的胞吞作用，隨之快速降解，使得它對細胞的作用時間及效能非常有限；而固定化生物活性因子卻能抑制宿主細胞的胞吞作用，顯著抑制其濃度的快速下降，對細胞的作用時間和效能維持長久[14]。為了達到生物活性因子在材料底物上的固定化附著，大多需要復雜的程序及對底物和生長因子的廣泛修飾。理論上固定生物活性因子的方案，最好能利用因子蛋白表面暴露的功能基團，如氨基、羧基和硫醇基等，使其與合適的底物之間形成化學共價鍵[14-15]。如果生物活性因子的蛋白質或多肽未能形成化學共價鍵的功能基團，則需要對材料底物表面進行預處理來達到目的。Sharon 等[15]為將 VEGF 較牢固地附著于 PLGA 上，事先用高碘酸鹽氧化預處理，然后通過醛糖氧化糖蛋白上的多糖殘基使 VEGF 穩定地與酰肼衍生化的 PLGA 結合。但由此帶來的弊端是改變了材料底物本身的生物效應。因此，支架材料表面生物活性因子的固定化，應盡可能使用簡便有效的功能化程序，才不會改變植入材料和生長因子的效能。
3.3 多巴胺對生物材料表面改性和負載 CDPM-1 支架的應用
有研究發現，來源于海洋貝類生物的黏附蛋白可在溶液中發生氧化聚合，并能在多種材料的表面形成黏附層，是一種天然的膠黏劑[16]。而多巴胺就是這種黏附蛋白的關鍵成分，幾乎可以黏附在任何材料表面，有效改善材料表面的親水性和細胞相容性；尤為重要的是，其形成的聚多巴胺層可以作為二級反應平臺，在材料表面進一步修飾生物活性分子，賦予材料優異的生物學性能[16-17]。
由于多巴胺改性過程無溶劑、無毒、簡便高效，因此國內外有很多相關報道[17-20]。Lai 等[18]和 Chien 等[19]均對 Ti 合金表面進行了改性并引入 BMP-2 等活性物質，研究表明均能促進 BMSCs 的增殖分化、ALP 分泌及礦化。Kim 等[20]利用多巴胺將乳鐵蛋白固定在 PLGA 多孔微球表面，誘導兔脂肪干細胞成骨分化，結果顯示提高了 ALP 分泌、鈣沉積及成骨相關基質蛋白 mRNA 表達。
本實驗就利用了多巴胺優異的生物黏附性能。首先我們采用溶液澆鑄法，使多巴胺在 3D 打印支架表面發生氧化自聚合，反應產物（聚多巴胺）均勻覆蓋于材料表面[21]；然后借助它的二級反應平臺，通過邁克爾加成反應（Michael addition reaction）或席夫堿反應（Schiff base reaction）[16]，從而將生物活性物質 CDMP-1 引入到材料表面。結果顯示多巴胺的引入對 PCL-HA 三維多孔支架材料的生物學性能影響較大，降低了材料表面水靜態接觸角，改善了材料的親水性能。將 hBMSCs 以靜態培養法接種于 3 組支架，結果發現經多巴胺改性后的材料對細胞黏附和增殖都有明顯促進作用，且對細胞活性無毒性作用。
CDMP-1 是 Hotten 等[22]首先從人胚胎 cDNA 庫中發現的一種多肽生長因子，研究證明其作用于大鼠肢體芽細胞可誘導間質聚合和軟骨形成。此外，CDMP-1 作用于人軟骨細胞，可抑制軟骨細胞外基質相關降解酶——基質金屬蛋白酶 13 和 ADAMTS4 的表達，同時呈劑量依賴性增強軟骨合成代謝相關基因 SOX9 和 Aggrecan 的表達[23]。本研究利用多巴胺的黏附特性，在 PCL-HA 三維多孔支架表面引入 CDMP-1，與 hBMSCs 成軟骨誘導培養后進行基因檢測來驗證其促軟骨分化的功能特性。結果顯示各組軟骨特異基質Ⅱ型膠原 mRNA 和 Aggrecan mRNA 表達均呈明顯上升趨勢；且培養 7、14、21 d Ⅱ型膠原 mRNA 相對表達量及培養 14、21 d Aggrecan mRNA 相對表達量，3 組間比較差異均有統計學意義。因此，多巴胺作為天然黏附劑，對干細胞無毒性，且對 CDMP-1 的生物功效無不良影響，保留了 CDMP-1 體外刺激 hBMSCs 成軟骨分化的生物活性。
本研究局限性在于：首先，100 ng/mL CDMP-1 濃度是參照文獻報道使用的濃度，我們并未優化選擇濃度；其次，本研究的體外培養時間終點為 21 d，未來尚需培養更長時間后檢測，同時還需了解無細胞支架體內植入后的促軟骨再生作用；最后，仍需進一步探討其他軟骨分化特異基質，如Ⅹ型膠原、SOX9 基因和蛋白水平的變化。
