引用本文： 張東旸, 楊雷, 田海, 傅畢成, 陳巍, 劉開宇, 賈智博, 蔣樹林, 韓鑫浩, 孫露. 陽離子微泡提高超聲波靶向擊碎微泡技術體內基因靶向轉染效率及治療效果的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(2): 228-236. doi: 10.7507/1002-1892.201706058 復制
急性心肌梗死可造成心肌細胞不可逆性壞死、心肌間質重構等一系列病理損傷，最終導致心力衰竭[1-2]。基因治療心臟疾病一直是心血管領域研究熱點，已有大量體外實驗證實了該治療方法的有效性[3-4]。但是，目前的體內基因轉染技術存在轉染效率低、轉染效果不穩定、轉染靶向性差以及副損傷大等缺陷，降低了基因治療用于臨床的可能性。
靜脈內脂質微泡（lipid microbubble，MB）成像技術是臨床超聲評估患者心肌灌注情況的一種常用方法。近年，大量研究應用超聲波靶向擊碎微泡（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）技術成功實現了動物心臟的基因靶向轉染及基因治療[5-8]，提示 UTMD 技術是一種可控性強、轉染效果穩定、靶向性強、副損傷小的體內基因轉染技術，有望用于臨床基因治療。但是，目前常用于 UTMD 體內基因轉染研究的傳統微泡（definity microbubble，DMB），其 DNA 結合率相對較低，造成 UTMD 體內基因轉染效率相對較低[9]。為此，本研究旨在構建一種新型陽離子微泡（cationic microbubble，CMB），以期其表面攜帶的正電荷增加攜帶質粒的能力，進而提高 UTMD 基因轉染效率。同時，系統評估和比較應用 CMB 與 DMB 對心臟缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷大鼠進行 AKT 基因治療的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 4 周齡雄性 SD 大鼠 80 只，體質量 200～225 g，由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供。DMB（Bristol-Myers Squibb 公司，加拿大）；氫化大豆卵磷脂（hydrogenated soy L-α-phosphatidylcholine，HSPC）、氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基銨（1，2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammoniumpropane，DOTMA；Avanti Polar Lipids 公司，加拿大）；全氟丙烷（C3F8；Airgas 公司，加拿大）；pcDNA3 質粒（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；熒光素酶活性檢測試劑盒（BD 公司，加拿大）；AKT 兔單克隆抗體、磷酸化 AKT（phospho-AKT，P-AKT）兔單克隆抗體、生存素（Survivin）兔單克隆抗體、磷酸化 BAD（phospho-BAD，P-BAD）兔單克隆抗體、α-SMA 兔單克隆抗體、第Ⅷ因子兔單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；小鼠抗 GAPDH、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；TUNEL 試劑盒（Roche 公司，美國）。
超聲發生器（Misonix 公司，美國）；ZS90 納米粒度電位儀（Malvern 公司，英國）；Multisizer4 庫爾特顆粒計數器（Beckman Coulter 公司，美國）；Vivid7 超聲機（GE 公司，美國）；Xenogen IVIS Spectra 成像系統（Xenogen 公司，美國）。
1.2 CMB 制備及觀測
1.2.1 CMB 制備
采用薄膜水化法制備 CMB[10]。在燒瓶中將 HSPC 和 DOTMA 按照摩爾比 94∶6混合后，氯仿充分溶解。將燒瓶放入真空旋轉蒸發儀上過夜，充分干燥以去除有機溶劑，形成一層干燥薄膜。向燒瓶中加入 PBS，獲取混合溶液。將上述溶液置于內置 C3F8 氣體的密閉小瓶中，1 min 后使用超聲發生器以 20 kHz、33～42 W 條件進行超聲處理形成 CMB。4℃ 條件下保存。
1.2.2 CMB 觀測
取 CMB，采用 ZS90 納米粒度電位儀以動態光散射法測定 zeta 電位（n=10），用 Multisizer4 庫爾特顆粒計數器以電區感應方法測定粒徑（n=5），光鏡下觀察其形態。用生理鹽水將 10、20、40 和 80 μg 生物熒光素酶質粒溶液（濃度 2 μg/μL）分別稀釋至 50 μL，然后加入 50 μL CMB 懸液，孵育 10 min。為精確檢測 CMB 的 DNA 結合能力，單獨收集混合液中的微泡，再將質粒 DNA 從 CMB 上分離、收集再進行檢測。具體方法如下：將質粒微泡混合樣本以 1 000×g 離心 10 min，離心后混合液分為 2 層，上層為包含微泡的乳白色液體，下層為透明液體。分別提取上、下層液體后用 3 mol/L 乙酸鈉和 100% 無水乙醇處理，使質粒 DNA 析出。再次以 1 000×g 離心 10 min 后，用 70% 乙醇洗滌沉淀狀態的質粒 DNA，然后用 TE 緩沖液溶解質粒 DNA。分別測定上、下層溶液中 DNA 含量，按以下公式計算 CMB 攜帶的質粒 DNA 百分比，評估其 DNA 結合能力。DNA 攜帶百分比=（DNA 攜帶量/總 DNA 含量）×100%。同時，取 DMB 進行以上檢測，作為對照。
1.3 質粒 DNA 和不同 MB 混合液的制備
在巨細胞病毒啟動子控制下，將生物熒光素酶基因或人 AKT 基因分別整合至 pcDNA3 質粒中。然后取 40～45 μg pcDNA3 質粒，以 0.20 mg/kg 計算每只大鼠 pcDNA3 質粒用量[7]，用生理鹽水稀釋至 100 μL，室溫下孵育 20 min 后，分別加入 CMB 及 DMB，并用生理鹽水將混合液進一步稀釋至 0.4 mL，分別用于下一步體內實驗。
1.4 不同 MB 的體內基因轉染效果比較
取 16 只大鼠隨機分為 CMB 組和 DMB 組（n=8），2% 異氟醚吸入麻醉后，以 1.2 mL/h 速度通過尾靜脈持續、勻速注射對應質粒 DNA 和 MB 的混合液。同時，應用 Vivid7 超聲機 M3S 探頭進行超聲沖擊。具體操作：在心電記錄儀自動觸發裝置控制下，每 4 次心臟收縮進行 1 次二次諧波的超聲波沖擊（發射：1.6 MHz，接收：3.2 MHz），持續 20 min；超聲波沖擊深度設為 3 cm，同時調整探頭以使作用焦點在心肌水平。基因轉染后第 3、7、14 天進行活體生物熒光成像檢測（第 3 天，n=8；第 7、14 天，n=4）。具體方法如下：同上述方法將大鼠麻醉后，按 150 mg/kg 劑量腹腔注射熒光素酶底物，5 min 后按 Xenogen IVIS Spectra 成像系統說明書操作進行活體生物熒光成像檢測，測量生物熒光表達量。
為進一步檢測熒光素酶質粒的轉染效率，第 3、14 天兩組各取大鼠 4 只定量檢測熒光素酶活性。具體方法：首先應用注射過量麻醉藥物方法處死大鼠，切取心臟，生理鹽水沖洗后迅速放入液氮中冷凍，保存于–80℃ 冰箱。按熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性［RLU/（min·mg）］，每個樣本發光檢測時間為 10 s。
1.5 大鼠心肌 I/R 模型建立及分組
取 64 只大鼠同上法麻醉后，于左側第 4 肋間開胸暴露心臟。先阻斷冠狀動脈前降支，60 min 后去掉結扎線恢復血液灌注[7]，建立大鼠心肌 I/R 模型。模型制備后第 5 天通過心臟彩色超聲檢查測定心肌梗死面積，在左心室舒張末期乳頭肌水平短軸圖像中測得梗死區域的實際長度，排除室壁運動減弱區域長度小于0.8 cm 及大于1.2 cm 的大鼠。共 60 只大鼠成功制備心肌 I/R 模型，納入下一步實驗。
將 I/R 大鼠模型隨機分為 3 組（n=20），其中對照組大鼠接受 DMB 攜帶空質粒轉染，DMB 組接受 DMB 攜帶 AKT 質粒轉染，CMB 組接受 CMB 攜帶 AKT 質粒轉染。具體轉染方法參照 1.4。
1.6 觀測指標
1.6.1 心臟功能、心肌灌注和梗死面積檢測
I/R 模型術后第 5、21 天應用心肌聲學造影評估心肌灌注情況（第 5 天，n=6；第 21 天，n=5）。具體操作如下：首先將大鼠麻醉并通過尾靜脈注入 DMB，然后通過 1 800～2 000 ms 脈沖間隔的數字圖像來測量信號強度。心室前壁代表了梗死區域，心室后壁代表了非梗死（正常）區域，計算前、后壁信號強度比值來評估心肌內血液灌注情況。
I/R 模型制備前及術后第 5、21 天（n=6），應用心臟彩色超聲測量大鼠心臟射血分數（ejection fraction，EF）和左室短軸縮短率（fractional shortening，FS）。同時，于第 21 天測量梗死區域長度和厚度；其中，在左心室舒張末期乳頭肌水平短軸圖像中測得梗死區域的實際長度，并計算其占左心室周長的百分比來表示梗死區域長度；在梗死區域中心測量梗死區域厚度。
1.6.2 組織學觀察
I/R 模型術后第 21 天，將各組心臟彩色超聲檢測后的大鼠以注射過量麻醉藥物方法處死，切取心臟并在生理壓力下用 10% 甲醛固定，10 μm 厚切片，取左心室乳頭肌水平心臟切片，分別行 HE 和 Masson 染色，觀察心肌梗死范圍以及梗死區膠原含量。
1.6.3 血管密度檢測
I/R 模型術后第 21 天，各組取 4 只大鼠同上法切取心臟并制備切片后，行 α-SMA、第Ⅷ因子免疫組織化學染色，鏡下可見新生毛細血管和小動脈呈棕色管狀結構。肉眼直接計數并計算梗死邊緣區毛細血管密度和小動脈密度。以 200 倍鏡下每張切片隨機取 5 個視野（每個視野面積為 0.4 mm2），取均值表示血管密度（個/視野）。
1.6.4 心肌細胞凋亡檢測
基因轉染后第 3 天，各組取 5 只大鼠同上法取出心臟并快速冷凍，按照 TUNEL 試劑盒說明書進行染色。在 400 倍熒光顯微鏡下計數 TUNEL 陽性細胞（凋亡細胞），每個樣本隨機取 5 個視野計數，取均值。
1.6.5 心肌 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 表達檢測
基因轉染后第 3 天，各組取 5 只大鼠同上法取出心臟并快速冷凍，使用蛋白提取液提取心肌組織勻漿中的蛋白，應用 Western blot 方法檢測 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 蛋白表達[11]。
1.7 統計學方法
采用 GraphPad Prism 4.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 CMB 相關檢測
薄膜水化法制備的 CMB 經過高頻振動具有脂質外殼，內含 C3F8 氣體。CMB 的 zeta 電位為（36.7±2.4）mV，顯著高于 DMB 的（2.8±0.2）mV，比較差異有統計學意義（t=28.680，P=0.000）。光鏡下觀察，CMB 及 DMB 形狀均一，CMB 的粒徑為（1.57±0.21）μm，DMB 為（1.07±0.08）μm（圖 1a）。與 10、20 和 40 μg 生物熒光素酶質粒溶液混合孵育時，CMB 的 DNA 攜帶百分比均顯著高于 DMB（P<0.05）；與 80 μg 生物熒光素酶質粒溶液混合孵育時，CMB 與 DMB 比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1b。
圖1
CMB 及 DMB 相關檢測
a. 光鏡下觀察 DMB 及 CMB 形態（×200），從左至右分別為 DMB 及 CMB；b. DNA 攜帶百分比
Figure1. Detection of DMB and CMBa. Morphology of DMB and CMB under optical microscope (×200), from left to right for DMB and CMB; b. Comparison of plasmid-binding capacity between DMB and CMB
2.2 不同 MB 的體內基因轉染效果比較
體內 CMB 和 DMB 在超聲波下的顯影強度無顯著差別（圖 2a）。隨著超聲波對微泡的靶向擊碎，微泡在心臟中的顯影逐漸減弱，提示靶向擊碎效果確切（圖 2b）。
圖2
體內 CMB 和 DMB 超聲波顯影強度
從左至右分別為 DMB 及 CMB a. 靶向擊碎前；b.靶向擊碎后
Figure2. Ultrasonic development intensity of CMB and DMB in vivoFrom left to right for DMB and CMB a. Before targeted destruction; b. After targeted destruction
基因轉染后第 3、7、14 天，CMB 組體內生物熒光表達量均明顯高于 DMB 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。第 3、14 天，CMB 組熒光素酶活性為（2 039.60±192.75）、（338.09±32.00）RLU/（min·mg），顯著高于 DMB 組的（1 051.20±38.12）、（155.26±15.21）RLU/（min·mg），比較差異有統計學意義（t=10.060，P=0.000；t=10.320，P=0.000）。
圖3
轉染后體內生物熒光表達觀察
a. DMB 組，從左至右分別為第 3、7、14 天；b. CMB 組，從左至右分別為第 3、7、14 天；c. 生物熒光表達量比較
Figure3. Bioluminescence images after gene transfection in vivoa. Bioluminescence images of group DMB, from left to right for 3, 7, and 14 days; b. Bioluminescence images of group CMB, from left to right for 3, 7, and 14 days; c. Comparison of bioluminescence expressions
2.3 體內實驗結果
2.3.1 心臟功能、心肌灌注和梗死面積檢測
I/R 模型術后第 5 天，CMB 組、DMB 組以及對照組的前、后壁信號強度比值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。術后第 21 天，CMB 組及 DMB 組前、后壁信號強度比值較對照組增加，且 CMB 組高于 DMB 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
I/R 模型制備前及術后第 5 天各組大鼠心臟 EF、FS 比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。術后第 21 天，CMB 組及 DMB 組以上檢測指標均較對照組明顯提高，且 CMB 組高于 DMB 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
術后第 21 天 CMB 組梗死區域長度最小、厚度最大，對照組梗死區域最大、厚度最小，DMB 組介于其中，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠心肌灌注、心臟功能和梗死面積檢測（n=6,
）
Table1.
Detection of myocardial perfusion, myocardial function, and infarct size of each group (n=6,
)
2.3.2 組織學觀察
I/R 模型術后第 21 天，染色觀察見對照組心肌梗死范圍最大，膠原最多、其次為 DMB 組、CMB 組。見圖 4。
圖4
各組組織學觀察（×200）
從左至右分別為對照組、DMB 組、CMB 組，箭頭示膠原組織 a. HE 染色；b. Masson 染色
Figure4. Histological onsercation of each group (×200)From left to right for control, DMB, and CMB groups, arrow indicated the collagena. HE staining; b. Masson staining
2.3.3 血管密度檢測
CMB 組、DMB 組及對照組毛細血管密度分別為（16.19±1.52）、（13.44±1.21）、（10.75±1.32）個/視野；小動脈密度分別為（9.69±0.83）、（5.38±0.92）、（3.25±0.74）個/視野。CMB 組及 DMB 組兩種血管密度均較對照組明顯增大，CMB 組較 DMB 組增大，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
各組免疫組織化學染色觀察（×200）
從左至右分別為對照組、DMB 組、CMB 組 a. α-SMA；b. 第Ⅷ因子
Figure5. Immunohistochemical staining of each group (×200)From left to right for control, DMB, and CMB groups a. α-SMA; b. Factor Ⅷ
2.3.4 心肌細胞凋亡檢測
基因轉染后第 3 天，TUNEL 染色觀察，各組均可見凋亡細胞；其中，對照組凋亡細胞最多，達（54.67±9.00）個/視野，其次為 DMB 組（43.67±5.13）個/視野，CMB 組最少（31.00±4.94）個/視野，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
各組 TUNEL 染色觀察（×400）
箭頭示凋亡細胞，從左至右分別為對照組、DMB 組、CMB 組
Figure6. TUNEL staining of each group (×400)Arrow indicated the apoptotic cells, from left to right for control, DMB, and CMB groups
2.3.5 心肌 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 蛋白表達檢測
基因轉染后第 3 天，CMB 組及 DMB 組 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 蛋白相對表達量均明顯高于對照組，CMB 組高于 DMB 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
各組心肌 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 蛋白相對表 達量比較（n=5,
）
Table2.
The relative expressions of AKT, P-AKT, Survivin, and P-BAD in myocardium of each group (n=5,
)
3 討論
研究證實，通過 UTMD 技術可將基因轉入特定的組織，如缺血心肌等。但是目前廣泛應用于 UTMD 技術的 DMB 轉染效率有限，有很多研究者嘗試通過不同方法來提高 UTMD 技術的轉染效率[3, 5]。我們在前期實驗中也發現，轉染效果較差是采用 DMB 進行基因治療的主要缺陷[6-7]。因此，制備具有更高質粒攜帶能力的 MB 對于 UTMD 技術至關重要。參照 Smith 等[10]方法，我們擬應用薄膜水化法制備 CMB 來改善 DMB 的缺陷。HSPC 能夠給 MB 提供帶有正電荷的脂質體外殼，本實驗結果顯示 CMB 攜帶 DNA 的能力以及轉染能力均較 DMB 顯著提高。
AKT 能夠在缺氧環境下被激活，并參與調節細胞凋亡、增殖及血管生成，進而改善心肌梗死后的心室重構和心腔擴大[12-13]。有文獻報道，過表達 AKT 的細胞被移植至受損心臟后可以提高心臟功能[14]。本實驗中，UTMD 介導的 AKT 轉染增加了心肌中 AKT 的磷酸化及其下游 Survivin 和 P-BAD 的表達。Survivin 作為凋亡抑制因子家族中的一員，過表達后可以減少細胞凋亡和增加細胞存活[15]。BAD 是 BCL2 家族的凋亡前體蛋白。AKT 使 BAD 磷酸化，進而使 BAD 從 BCL2/BCL-X 的復合物中分離，從而失去其凋亡前體蛋白的功能[16-17]。本實驗結果顯示，因為 CMB 轉染效率明顯高于 DMB，基因治療效果也明顯提高，所以 CMB 組心肌細胞凋亡明顯減少、血管密度增加、梗死面積減小、瘢痕厚度增加、心臟灌注提高和心臟功能改善。
但本實驗也有一定局限性，因體內轉染前未預沖洗微泡，所以存在未包裝的質粒進入循環的可能。但考慮 UTMD 技術是通過 MB 破裂造成的輕度內皮損傷轉染質粒 DNA，所以只有與 MB 結合的 DNA 才能夠穿過內皮屏障并被靶向轉入心臟[5, 6]。并且，研究表明經靜脈注入的質粒會被核酸酶快速降解，而經過包裝的質粒會因微泡的保護作用而不被降解[18-21]。所以，內皮屏障以及未包裝質粒的快速降解能夠減少質粒轉入機體其他器官的可能性。雖然我們不能完全排除血液循環中質粒也可能有轉入機體其他器官，但是我們認為這種作用效果微乎其微，可以忽略不計。
綜上述，本實驗提示增加 MB 的陽離子電荷可以提高 UTMD 技術介導的基因轉染效果。與 DMB 相比，CMB 能提高 UTMD 技術體內靶向轉染效率，進而提高 AKT 基因治療大鼠心肌 I/R 損傷的效果。
急性心肌梗死可造成心肌細胞不可逆性壞死、心肌間質重構等一系列病理損傷，最終導致心力衰竭[1-2]。基因治療心臟疾病一直是心血管領域研究熱點，已有大量體外實驗證實了該治療方法的有效性[3-4]。但是，目前的體內基因轉染技術存在轉染效率低、轉染效果不穩定、轉染靶向性差以及副損傷大等缺陷，降低了基因治療用于臨床的可能性。
靜脈內脂質微泡（lipid microbubble，MB）成像技術是臨床超聲評估患者心肌灌注情況的一種常用方法。近年，大量研究應用超聲波靶向擊碎微泡（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）技術成功實現了動物心臟的基因靶向轉染及基因治療[5-8]，提示 UTMD 技術是一種可控性強、轉染效果穩定、靶向性強、副損傷小的體內基因轉染技術，有望用于臨床基因治療。但是，目前常用于 UTMD 體內基因轉染研究的傳統微泡（definity microbubble，DMB），其 DNA 結合率相對較低，造成 UTMD 體內基因轉染效率相對較低[9]。為此，本研究旨在構建一種新型陽離子微泡（cationic microbubble，CMB），以期其表面攜帶的正電荷增加攜帶質粒的能力，進而提高 UTMD 基因轉染效率。同時，系統評估和比較應用 CMB 與 DMB 對心臟缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷大鼠進行 AKT 基因治療的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 4 周齡雄性 SD 大鼠 80 只，體質量 200～225 g，由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供。DMB（Bristol-Myers Squibb 公司，加拿大）；氫化大豆卵磷脂（hydrogenated soy L-α-phosphatidylcholine，HSPC）、氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基銨（1，2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammoniumpropane，DOTMA；Avanti Polar Lipids 公司，加拿大）；全氟丙烷（C3F8；Airgas 公司，加拿大）；pcDNA3 質粒（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；熒光素酶活性檢測試劑盒（BD 公司，加拿大）；AKT 兔單克隆抗體、磷酸化 AKT（phospho-AKT，P-AKT）兔單克隆抗體、生存素（Survivin）兔單克隆抗體、磷酸化 BAD（phospho-BAD，P-BAD）兔單克隆抗體、α-SMA 兔單克隆抗體、第Ⅷ因子兔單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；小鼠抗 GAPDH、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；TUNEL 試劑盒（Roche 公司，美國）。
超聲發生器（Misonix 公司，美國）；ZS90 納米粒度電位儀（Malvern 公司，英國）；Multisizer4 庫爾特顆粒計數器（Beckman Coulter 公司，美國）；Vivid7 超聲機（GE 公司，美國）；Xenogen IVIS Spectra 成像系統（Xenogen 公司，美國）。
1.2 CMB 制備及觀測
1.2.1 CMB 制備
采用薄膜水化法制備 CMB[10]。在燒瓶中將 HSPC 和 DOTMA 按照摩爾比 94∶6混合后，氯仿充分溶解。將燒瓶放入真空旋轉蒸發儀上過夜，充分干燥以去除有機溶劑，形成一層干燥薄膜。向燒瓶中加入 PBS，獲取混合溶液。將上述溶液置于內置 C3F8 氣體的密閉小瓶中，1 min 后使用超聲發生器以 20 kHz、33～42 W 條件進行超聲處理形成 CMB。4℃ 條件下保存。
1.2.2 CMB 觀測
取 CMB，采用 ZS90 納米粒度電位儀以動態光散射法測定 zeta 電位（n=10），用 Multisizer4 庫爾特顆粒計數器以電區感應方法測定粒徑（n=5），光鏡下觀察其形態。用生理鹽水將 10、20、40 和 80 μg 生物熒光素酶質粒溶液（濃度 2 μg/μL）分別稀釋至 50 μL，然后加入 50 μL CMB 懸液，孵育 10 min。為精確檢測 CMB 的 DNA 結合能力，單獨收集混合液中的微泡，再將質粒 DNA 從 CMB 上分離、收集再進行檢測。具體方法如下：將質粒微泡混合樣本以 1 000×g 離心 10 min，離心后混合液分為 2 層，上層為包含微泡的乳白色液體，下層為透明液體。分別提取上、下層液體后用 3 mol/L 乙酸鈉和 100% 無水乙醇處理，使質粒 DNA 析出。再次以 1 000×g 離心 10 min 后，用 70% 乙醇洗滌沉淀狀態的質粒 DNA，然后用 TE 緩沖液溶解質粒 DNA。分別測定上、下層溶液中 DNA 含量，按以下公式計算 CMB 攜帶的質粒 DNA 百分比，評估其 DNA 結合能力。DNA 攜帶百分比=（DNA 攜帶量/總 DNA 含量）×100%。同時，取 DMB 進行以上檢測，作為對照。
1.3 質粒 DNA 和不同 MB 混合液的制備
在巨細胞病毒啟動子控制下，將生物熒光素酶基因或人 AKT 基因分別整合至 pcDNA3 質粒中。然后取 40～45 μg pcDNA3 質粒，以 0.20 mg/kg 計算每只大鼠 pcDNA3 質粒用量[7]，用生理鹽水稀釋至 100 μL，室溫下孵育 20 min 后，分別加入 CMB 及 DMB，并用生理鹽水將混合液進一步稀釋至 0.4 mL，分別用于下一步體內實驗。
1.4 不同 MB 的體內基因轉染效果比較
取 16 只大鼠隨機分為 CMB 組和 DMB 組（n=8），2% 異氟醚吸入麻醉后，以 1.2 mL/h 速度通過尾靜脈持續、勻速注射對應質粒 DNA 和 MB 的混合液。同時，應用 Vivid7 超聲機 M3S 探頭進行超聲沖擊。具體操作：在心電記錄儀自動觸發裝置控制下，每 4 次心臟收縮進行 1 次二次諧波的超聲波沖擊（發射：1.6 MHz，接收：3.2 MHz），持續 20 min；超聲波沖擊深度設為 3 cm，同時調整探頭以使作用焦點在心肌水平。基因轉染后第 3、7、14 天進行活體生物熒光成像檢測（第 3 天，n=8；第 7、14 天，n=4）。具體方法如下：同上述方法將大鼠麻醉后，按 150 mg/kg 劑量腹腔注射熒光素酶底物，5 min 后按 Xenogen IVIS Spectra 成像系統說明書操作進行活體生物熒光成像檢測，測量生物熒光表達量。
為進一步檢測熒光素酶質粒的轉染效率，第 3、14 天兩組各取大鼠 4 只定量檢測熒光素酶活性。具體方法：首先應用注射過量麻醉藥物方法處死大鼠，切取心臟，生理鹽水沖洗后迅速放入液氮中冷凍，保存于–80℃ 冰箱。按熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性［RLU/（min·mg）］，每個樣本發光檢測時間為 10 s。
1.5 大鼠心肌 I/R 模型建立及分組
取 64 只大鼠同上法麻醉后，于左側第 4 肋間開胸暴露心臟。先阻斷冠狀動脈前降支，60 min 后去掉結扎線恢復血液灌注[7]，建立大鼠心肌 I/R 模型。模型制備后第 5 天通過心臟彩色超聲檢查測定心肌梗死面積，在左心室舒張末期乳頭肌水平短軸圖像中測得梗死區域的實際長度，排除室壁運動減弱區域長度小于0.8 cm 及大于1.2 cm 的大鼠。共 60 只大鼠成功制備心肌 I/R 模型，納入下一步實驗。
將 I/R 大鼠模型隨機分為 3 組（n=20），其中對照組大鼠接受 DMB 攜帶空質粒轉染，DMB 組接受 DMB 攜帶 AKT 質粒轉染，CMB 組接受 CMB 攜帶 AKT 質粒轉染。具體轉染方法參照 1.4。
1.6 觀測指標
1.6.1 心臟功能、心肌灌注和梗死面積檢測
I/R 模型術后第 5、21 天應用心肌聲學造影評估心肌灌注情況（第 5 天，n=6；第 21 天，n=5）。具體操作如下：首先將大鼠麻醉并通過尾靜脈注入 DMB，然后通過 1 800～2 000 ms 脈沖間隔的數字圖像來測量信號強度。心室前壁代表了梗死區域，心室后壁代表了非梗死（正常）區域，計算前、后壁信號強度比值來評估心肌內血液灌注情況。
I/R 模型制備前及術后第 5、21 天（n=6），應用心臟彩色超聲測量大鼠心臟射血分數（ejection fraction，EF）和左室短軸縮短率（fractional shortening，FS）。同時，于第 21 天測量梗死區域長度和厚度；其中，在左心室舒張末期乳頭肌水平短軸圖像中測得梗死區域的實際長度，并計算其占左心室周長的百分比來表示梗死區域長度；在梗死區域中心測量梗死區域厚度。
1.6.2 組織學觀察
I/R 模型術后第 21 天，將各組心臟彩色超聲檢測后的大鼠以注射過量麻醉藥物方法處死，切取心臟并在生理壓力下用 10% 甲醛固定，10 μm 厚切片，取左心室乳頭肌水平心臟切片，分別行 HE 和 Masson 染色，觀察心肌梗死范圍以及梗死區膠原含量。
1.6.3 血管密度檢測
I/R 模型術后第 21 天，各組取 4 只大鼠同上法切取心臟并制備切片后，行 α-SMA、第Ⅷ因子免疫組織化學染色，鏡下可見新生毛細血管和小動脈呈棕色管狀結構。肉眼直接計數并計算梗死邊緣區毛細血管密度和小動脈密度。以 200 倍鏡下每張切片隨機取 5 個視野（每個視野面積為 0.4 mm2），取均值表示血管密度（個/視野）。
1.6.4 心肌細胞凋亡檢測
基因轉染后第 3 天，各組取 5 只大鼠同上法取出心臟并快速冷凍，按照 TUNEL 試劑盒說明書進行染色。在 400 倍熒光顯微鏡下計數 TUNEL 陽性細胞（凋亡細胞），每個樣本隨機取 5 個視野計數，取均值。
1.6.5 心肌 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 表達檢測
基因轉染后第 3 天，各組取 5 只大鼠同上法取出心臟并快速冷凍，使用蛋白提取液提取心肌組織勻漿中的蛋白，應用 Western blot 方法檢測 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 蛋白表達[11]。
1.7 統計學方法
采用 GraphPad Prism 4.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 CMB 相關檢測
薄膜水化法制備的 CMB 經過高頻振動具有脂質外殼，內含 C3F8 氣體。CMB 的 zeta 電位為（36.7±2.4）mV，顯著高于 DMB 的（2.8±0.2）mV，比較差異有統計學意義（t=28.680，P=0.000）。光鏡下觀察，CMB 及 DMB 形狀均一，CMB 的粒徑為（1.57±0.21）μm，DMB 為（1.07±0.08）μm（圖 1a）。與 10、20 和 40 μg 生物熒光素酶質粒溶液混合孵育時，CMB 的 DNA 攜帶百分比均顯著高于 DMB（P<0.05）；與 80 μg 生物熒光素酶質粒溶液混合孵育時，CMB 與 DMB 比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1b。
圖1
CMB 及 DMB 相關檢測
a. 光鏡下觀察 DMB 及 CMB 形態（×200），從左至右分別為 DMB 及 CMB；b. DNA 攜帶百分比
Figure1. Detection of DMB and CMBa. Morphology of DMB and CMB under optical microscope (×200), from left to right for DMB and CMB; b. Comparison of plasmid-binding capacity between DMB and CMB
2.2 不同 MB 的體內基因轉染效果比較
體內 CMB 和 DMB 在超聲波下的顯影強度無顯著差別（圖 2a）。隨著超聲波對微泡的靶向擊碎，微泡在心臟中的顯影逐漸減弱，提示靶向擊碎效果確切（圖 2b）。
圖2
體內 CMB 和 DMB 超聲波顯影強度
從左至右分別為 DMB 及 CMB a. 靶向擊碎前；b.靶向擊碎后
Figure2. Ultrasonic development intensity of CMB and DMB in vivoFrom left to right for DMB and CMB a. Before targeted destruction; b. After targeted destruction
基因轉染后第 3、7、14 天，CMB 組體內生物熒光表達量均明顯高于 DMB 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。第 3、14 天，CMB 組熒光素酶活性為（2 039.60±192.75）、（338.09±32.00）RLU/（min·mg），顯著高于 DMB 組的（1 051.20±38.12）、（155.26±15.21）RLU/（min·mg），比較差異有統計學意義（t=10.060，P=0.000；t=10.320，P=0.000）。
圖3
轉染后體內生物熒光表達觀察
a. DMB 組，從左至右分別為第 3、7、14 天；b. CMB 組，從左至右分別為第 3、7、14 天；c. 生物熒光表達量比較
Figure3. Bioluminescence images after gene transfection in vivoa. Bioluminescence images of group DMB, from left to right for 3, 7, and 14 days; b. Bioluminescence images of group CMB, from left to right for 3, 7, and 14 days; c. Comparison of bioluminescence expressions
2.3 體內實驗結果
2.3.1 心臟功能、心肌灌注和梗死面積檢測
I/R 模型術后第 5 天，CMB 組、DMB 組以及對照組的前、后壁信號強度比值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。術后第 21 天，CMB 組及 DMB 組前、后壁信號強度比值較對照組增加，且 CMB 組高于 DMB 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
I/R 模型制備前及術后第 5 天各組大鼠心臟 EF、FS 比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。術后第 21 天，CMB 組及 DMB 組以上檢測指標均較對照組明顯提高，且 CMB 組高于 DMB 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
術后第 21 天 CMB 組梗死區域長度最小、厚度最大，對照組梗死區域最大、厚度最小，DMB 組介于其中，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠心肌灌注、心臟功能和梗死面積檢測（n=6,
）
Table1.
Detection of myocardial perfusion, myocardial function, and infarct size of each group (n=6,
)
2.3.2 組織學觀察
I/R 模型術后第 21 天，染色觀察見對照組心肌梗死范圍最大，膠原最多、其次為 DMB 組、CMB 組。見圖 4。
圖4
各組組織學觀察（×200）
從左至右分別為對照組、DMB 組、CMB 組，箭頭示膠原組織 a. HE 染色；b. Masson 染色
Figure4. Histological onsercation of each group (×200)From left to right for control, DMB, and CMB groups, arrow indicated the collagena. HE staining; b. Masson staining
2.3.3 血管密度檢測
CMB 組、DMB 組及對照組毛細血管密度分別為（16.19±1.52）、（13.44±1.21）、（10.75±1.32）個/視野；小動脈密度分別為（9.69±0.83）、（5.38±0.92）、（3.25±0.74）個/視野。CMB 組及 DMB 組兩種血管密度均較對照組明顯增大，CMB 組較 DMB 組增大，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
各組免疫組織化學染色觀察（×200）
從左至右分別為對照組、DMB 組、CMB 組 a. α-SMA；b. 第Ⅷ因子
Figure5. Immunohistochemical staining of each group (×200)From left to right for control, DMB, and CMB groups a. α-SMA; b. Factor Ⅷ
2.3.4 心肌細胞凋亡檢測
基因轉染后第 3 天，TUNEL 染色觀察，各組均可見凋亡細胞；其中，對照組凋亡細胞最多，達（54.67±9.00）個/視野，其次為 DMB 組（43.67±5.13）個/視野，CMB 組最少（31.00±4.94）個/視野，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
各組 TUNEL 染色觀察（×400）
箭頭示凋亡細胞，從左至右分別為對照組、DMB 組、CMB 組
Figure6. TUNEL staining of each group (×400)Arrow indicated the apoptotic cells, from left to right for control, DMB, and CMB groups
2.3.5 心肌 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 蛋白表達檢測
基因轉染后第 3 天，CMB 組及 DMB 組 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 蛋白相對表達量均明顯高于對照組，CMB 組高于 DMB 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
各組心肌 AKT、P-AKT、Survivin 和 P-BAD 蛋白相對表 達量比較（n=5,
）
Table2.
The relative expressions of AKT, P-AKT, Survivin, and P-BAD in myocardium of each group (n=5,
)
3 討論
研究證實，通過 UTMD 技術可將基因轉入特定的組織，如缺血心肌等。但是目前廣泛應用于 UTMD 技術的 DMB 轉染效率有限，有很多研究者嘗試通過不同方法來提高 UTMD 技術的轉染效率[3, 5]。我們在前期實驗中也發現，轉染效果較差是采用 DMB 進行基因治療的主要缺陷[6-7]。因此，制備具有更高質粒攜帶能力的 MB 對于 UTMD 技術至關重要。參照 Smith 等[10]方法，我們擬應用薄膜水化法制備 CMB 來改善 DMB 的缺陷。HSPC 能夠給 MB 提供帶有正電荷的脂質體外殼，本實驗結果顯示 CMB 攜帶 DNA 的能力以及轉染能力均較 DMB 顯著提高。
AKT 能夠在缺氧環境下被激活，并參與調節細胞凋亡、增殖及血管生成，進而改善心肌梗死后的心室重構和心腔擴大[12-13]。有文獻報道，過表達 AKT 的細胞被移植至受損心臟后可以提高心臟功能[14]。本實驗中，UTMD 介導的 AKT 轉染增加了心肌中 AKT 的磷酸化及其下游 Survivin 和 P-BAD 的表達。Survivin 作為凋亡抑制因子家族中的一員，過表達后可以減少細胞凋亡和增加細胞存活[15]。BAD 是 BCL2 家族的凋亡前體蛋白。AKT 使 BAD 磷酸化，進而使 BAD 從 BCL2/BCL-X 的復合物中分離，從而失去其凋亡前體蛋白的功能[16-17]。本實驗結果顯示，因為 CMB 轉染效率明顯高于 DMB，基因治療效果也明顯提高，所以 CMB 組心肌細胞凋亡明顯減少、血管密度增加、梗死面積減小、瘢痕厚度增加、心臟灌注提高和心臟功能改善。
但本實驗也有一定局限性，因體內轉染前未預沖洗微泡，所以存在未包裝的質粒進入循環的可能。但考慮 UTMD 技術是通過 MB 破裂造成的輕度內皮損傷轉染質粒 DNA，所以只有與 MB 結合的 DNA 才能夠穿過內皮屏障并被靶向轉入心臟[5, 6]。并且，研究表明經靜脈注入的質粒會被核酸酶快速降解，而經過包裝的質粒會因微泡的保護作用而不被降解[18-21]。所以，內皮屏障以及未包裝質粒的快速降解能夠減少質粒轉入機體其他器官的可能性。雖然我們不能完全排除血液循環中質粒也可能有轉入機體其他器官，但是我們認為這種作用效果微乎其微，可以忽略不計。
綜上述，本實驗提示增加 MB 的陽離子電荷可以提高 UTMD 技術介導的基因轉染效果。與 DMB 相比，CMB 能提高 UTMD 技術體內靶向轉染效率，進而提高 AKT 基因治療大鼠心肌 I/R 損傷的效果。
