引用本文： 于榮華, 侯春林, 林浩東, 趙建國, 宗海洋, 林耀發. 大鼠脊髓圓錐損傷后大腦排尿功能區變化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(1): 75-79. doi: 10.7507/1002-1892.201708126 復制
近年來研究表明，哺乳動物神經系統損傷后會引起腦功能區的可塑性變化[1-2]。目前通過動物實驗和臨床病例證實，利用損傷平面以上正常的神經根前后根移位和支配膀胱的骶神經根前后根吻合，可同時重建膀胱的傳入和傳出通路，而且神經移位術后大腦出現了可塑性變化[3-6]。大腦究竟是如何完成這一可塑性變化，其轉變過程、具體部位、功能信息的傳遞以及分子水平機制仍不明確。外周神經損傷后其在大腦的相應代表區會逐漸退變，但脊髓損傷后膀胱在大腦的代表區會出現什么變化目前尚未見報道。本研究擬建立大鼠脊髓圓錐損傷模型，通過組織學觀察腦橋被蓋背外側部大腦排尿中樞相關區域組織結構的變化，采用免疫組織化學染色法檢測凋亡相關蛋白 Bcl-2 的表達變化，探討脊髓損傷后大腦排尿相關功能區的變化情況。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雌性 SD 大鼠 36 只，體質量 180～200 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。顯微手術器械（北京中興名業科技發展有限責任公司）；1% 戊巴比妥鈉（上海山浦化工有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒（Abcam 公司，美國）。倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 大鼠脊髓圓錐損傷模型建立
將 36 只 SD 大鼠隨機分為實驗組（30 只）和對照組（6 只）。實驗組為脊髓圓錐損傷組，將大鼠以 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于鼠板上，剃毛，消毒，取后正中切口逐步分離皮膚、皮下及深筋膜，顯露棘突，向兩側鈍性剝離骶脊肌，顯露椎板；骶骨上第 1 個活動關節定位為 L6、S1 間隙，依次定位各脊椎平面；在 10 倍顯微鏡下，應用顯微持針器自 L3～S3 節段咬除棘突及椎板，剪開硬脊膜，暴露脊髓及馬尾神經；將 L4 以下所有脊神經剪斷，逐層縫合切口。大鼠麻醉蘇醒后，腹腔注射慶大霉素 0.5 mg/kg，1 次/d，共 3 d；每天早晚 2 次腹部按摩排除殘余尿。對照組不行任何處理，正常飼養。
1.3 膀胱大腦標本采集及觀測指標
實驗組大鼠手術全部成功，術后 3、5 個月分別死亡 1 只大鼠，原因可能是腎功能衰竭及尿路感染。實驗組于術后 1 d、1 周以及 1、3、6 個月分別取 6、6、6、5、5 只大鼠，腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/100 g）麻醉后，剪開胸壁，暴露心尖部，于心尖部至主動脈穿刺，用生理鹽水和 4% 多聚甲醛溶液固定；然后暴露大腦，取腦橋被蓋背外側部，進行以下觀測。對照組于分組后 1 d、1 周以及 1、3、6 個月各取 1 只大鼠腦橋被蓋背外側部進行相應觀測。
1.3.1 HE 染色觀察
取腦橋被蓋背外側部組織，用 4% 多聚甲醛固定，生理鹽水沖洗，梯度乙醇脫水，行 5 μm 厚縱切片，常規進行 HE 染色。隨機取 10 個視野，于光鏡高倍鏡（×10）下觀察腦橋被蓋背外側部組織結構變化情況。
1.3.2 Bcl-2 免疫組織化學 SP 染色觀察
取腦橋被蓋背外側部組織，采用免疫組織化學 SP 染色檢測。常規脫蠟、水化，抗原修復，PBS 液沖洗，滴加正常山羊血清封閉液保護，加入 Bcl-2 小鼠單克隆抗體 50 μL，室溫靜置 1 h，或 4℃ 過夜后 37℃ 復溫 45 min，或 37℃ 靜置 1 h。PBS 洗 3 次各 5 min；滴加二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體 40～50 μL，室溫靜置 1 h 或 37℃ 靜置 30 min；PBS 洗 3 次各 5 min；DAB 顯色 5～10 min，PBS 沖洗 5 min，蘇木精復染 2 min，鹽酸乙醇分化；PBS 沖洗 5～10 min；脫水、透明、封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇 5 個視野，計數陽性細胞（細胞質呈棕黃色），并計算陽性細胞比例。按陽性細胞比例分為 4 個等級：陰性（–），<5%；弱陽性（+），5%～30%；陽性（++），30%～60%；強陽性（+++），>60%。
2 結果
2.1 HE 染色觀察
對照組：各時間點標本均無明顯區別，均見神經元細胞密集、排列整齊，細胞核居中，核仁清楚。實驗組：術后 1 d，與對照組無明顯區別；1 周，可見神經元細胞周圍間隙稍增寬；1 個月，部分神經元出現細胞核固縮；3、6 個月，細胞核固縮的細胞越來越多，甚至部分細胞出現核消失。見圖 1。
2.2 Bcl-2 免疫組織化學 SP 染色觀察
對照組 5 只大鼠 Bcl-2 表達均呈弱陽性（+）。實驗組：術后 1 d 均出現明顯 Bcl-2 陽性表達（++）；術后 7 d，Bcl-2 陽性表達明顯升高，并達高峰，呈強陽性（+++）5 只、陽性（++）1 只；術后 1、3、6 個月 Bcl-2 陽性表達逐漸下降，但仍高于對照組，其中 1 個月時強陽性（+++）2 只、陽性（++）4 只，3 個月時均為陽性（++），6 個月時陽性（++）4 只、弱陽性（+++）1 只。見圖 2。
圖1
兩組大鼠各時間點 HE 染色觀察（×10）
a. 對照組；b. 實驗組術后 1 d；c. 實驗組術后 1 周；d. 實驗組術后 1 個月；e. 實驗組術后 3 個月；f. 實驗組術后 6 個月
Figure1. HE staining observation of 2 groups at each time point (×10)a. Control group; b. Experimental group at 1 day after operation; c. Experimental group at 1 week after operation; d. Experimental group at 1 month after operation; e. Experimental group at 3 months after operation; f. Experimental group at 6 months after operation
圖2
兩組大鼠各時間點 Bcl-2 免疫組織化學染色觀察（倒置熒光顯微鏡×40）
a. 對照組；b. 實驗組術后 1 d；c. 實驗組術后 1 周；d. 實驗組術后 1 個月；e. 實驗組術后 3 個月；f. 實驗組術后 6 個月
Figure2. Bcl-2 immunohistochemical SP staining observation of 2 groups at each time point (Inverted fluorescence microscope×40)a. Control group; b. Experimental group at 1 day after operation; c. Experimental group at 1 week after operation; d. Experimental group at 1 month after operation; e. Experimental group at 3 months after operation; f. Experimental group at 6 months after operation
3 討論
長期以來，對脊髓損傷后膀胱功能障礙的研究主要集中在膀胱運動、感覺功能的缺失及其功能重建上，而對于損傷后造成的大腦儲尿排尿相關的各功能區退變研究較少。人的高級排尿中樞位于腦部，大腦、丘腦、基底節、邊緣系統、下丘腦和腦干網狀結構參與排尿調控過程，腦橋排尿中樞和 Barrington 核中轉的脊髓-延髓-脊髓反射是排尿調控的關鍵環節；腦橋排尿中樞的 M 區和 L 區接受來自中腦導水管灰質的神經信號，分別具有興奮和抑制膀胱的作用。大鼠 Barrington 核是位于腦橋被蓋背外側部，為腦橋排尿中樞[7]。本實驗通過建立大鼠脊髓圓錐橫斷傷模型，對大腦膀胱中樞區域變化情況進行初步觀察。
3.1 腦橋排尿中樞出現神經元凋亡病理改變
研究表明大鼠脊髓損傷可能導致大腦皮質神經元的死亡[8]，但其引起腦部變化的確切機制尚不清楚。有研究認為脊髓損傷可導致腦內發生慢性炎癥[9]，其可抑制神經再生[10]。也有研究認為可能是由于腦內的神經遞質發生變化[11]，嚴重影響脊髓功能修復。Felix 等[10]發現，脊髓損傷可誘導大腦皮質和海馬 CA1 區中神經元細胞凋亡和死亡。但也有學者得出相反的研究結果，脊髓損傷后僅誘導腦部神經元發生形態改變，并未發生凋亡或消失[12]。McBride 等[13]研究發現脊髓 T9 節段橫斷損傷后 20 周大腦皮質神經元數量無變化，只是神經元的大小顯著減小。本研究建立大鼠脊髓圓錐損傷模型，發現脊髓損傷后隨時間延長，腦橋排尿中樞神經元細胞出現凋亡病理改變。損傷后 1 個月出現明顯神經元細胞核固縮，3、6 個月細胞出現核消失，這是典型的壞死表現。
3.2 腦橋 Bcl-2 蛋白表達變化
目前已證實 Bcl-2 基因是重要的抗凋亡基因之一[14]，其基因家族包括促進（Bax）和抑制（Bcl-2）細胞凋亡的兩大類成員，是脊髓損傷后細胞凋亡的重要調控基因。研究表明 Bcl-2 對神經功能的保護作用是多方面的，過度表達的 Bcl-2 能抑制由于鈣超載、興奮性氨基酸及缺血缺氧等誘發的神經元凋亡[15]。并且 Bcl-2 是可誘導基因，神經受損后，通過誘導可以增加其在神經組織中的表達并增加神經抗損傷的能力[16]。Luo 等[17]制作大鼠脊髓損傷模型，實驗組整合 Bcl-2 基因，并使脊髓中 Bcl-2 過表達，對照組相同位置只整合β-半乳糖苷酶基因，發現術后實驗組殘留的正常脊髓組織明顯多于對照組，凋亡的神經元數量也明顯少于對照組，說明 Bcl-2 的過表達具有保護神經組織、抑制細胞凋亡和細胞壞死的作用。本研究結果發現，實驗組術后 1 周 Bcl-2 蛋白表達明顯增高，并達高峰，術后 1、3、6 個月 Bcl-2 陽性表達逐漸下降，但仍高于對照組。表明大鼠腦橋排尿中樞 Bcl-2 表達與脊髓損傷有因果關系，損傷促進 Bcl-2 基因的表達，使 Bcl-2 含量迅速升高，從而在損傷早期即可發揮抑制細胞凋亡的作用。以后 Bcl-2 表達有所回落，可能與相關神經元發生細胞壞死和凋亡，影響蛋白質的合成有關。術后 1、3、6 個月表達雖然下降但仍高于正常水平，提示 Bcl-2 增加表達以組織修復為主，其作用是誘導神經元增加表達，減少細胞死亡。但 Bcl-2 增加表達并不能逆轉神經細胞退變，可能是脊髓全橫斷損傷后引起腦內慢性炎癥及引起上行通路神經元的凋亡等促進腦部退變的因素占優勢，從而使神經細胞向壞死和凋亡方向發展。
綜上述，脊髓圓錐損傷后會出現膀胱中樞退變、神經細胞凋亡現象；Bcl-2 蛋白表達增加是機體阻止細胞凋亡和組織修復的表現，但 Bcl-2 增加并不能逆轉神經結構退變。有觀點認為脊髓損傷后通過損傷軸突的逆行退化可引起上行通路神經元的凋亡[18]，若利用損傷平面以上正常的神經根和支配膀胱的骶神經根吻合，重建膀胱的傳入和傳出通路，是否可阻止膀胱中樞細胞凋亡并對腦部結構進行重塑，目前尚無報道，需要進一步研究證實。
近年來研究表明，哺乳動物神經系統損傷后會引起腦功能區的可塑性變化[1-2]。目前通過動物實驗和臨床病例證實，利用損傷平面以上正常的神經根前后根移位和支配膀胱的骶神經根前后根吻合，可同時重建膀胱的傳入和傳出通路，而且神經移位術后大腦出現了可塑性變化[3-6]。大腦究竟是如何完成這一可塑性變化，其轉變過程、具體部位、功能信息的傳遞以及分子水平機制仍不明確。外周神經損傷后其在大腦的相應代表區會逐漸退變，但脊髓損傷后膀胱在大腦的代表區會出現什么變化目前尚未見報道。本研究擬建立大鼠脊髓圓錐損傷模型，通過組織學觀察腦橋被蓋背外側部大腦排尿中樞相關區域組織結構的變化，采用免疫組織化學染色法檢測凋亡相關蛋白 Bcl-2 的表達變化，探討脊髓損傷后大腦排尿相關功能區的變化情況。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雌性 SD 大鼠 36 只，體質量 180～200 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。顯微手術器械（北京中興名業科技發展有限責任公司）；1% 戊巴比妥鈉（上海山浦化工有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒（Abcam 公司，美國）。倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 大鼠脊髓圓錐損傷模型建立
將 36 只 SD 大鼠隨機分為實驗組（30 只）和對照組（6 只）。實驗組為脊髓圓錐損傷組，將大鼠以 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于鼠板上，剃毛，消毒，取后正中切口逐步分離皮膚、皮下及深筋膜，顯露棘突，向兩側鈍性剝離骶脊肌，顯露椎板；骶骨上第 1 個活動關節定位為 L6、S1 間隙，依次定位各脊椎平面；在 10 倍顯微鏡下，應用顯微持針器自 L3～S3 節段咬除棘突及椎板，剪開硬脊膜，暴露脊髓及馬尾神經；將 L4 以下所有脊神經剪斷，逐層縫合切口。大鼠麻醉蘇醒后，腹腔注射慶大霉素 0.5 mg/kg，1 次/d，共 3 d；每天早晚 2 次腹部按摩排除殘余尿。對照組不行任何處理，正常飼養。
1.3 膀胱大腦標本采集及觀測指標
實驗組大鼠手術全部成功，術后 3、5 個月分別死亡 1 只大鼠，原因可能是腎功能衰竭及尿路感染。實驗組于術后 1 d、1 周以及 1、3、6 個月分別取 6、6、6、5、5 只大鼠，腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/100 g）麻醉后，剪開胸壁，暴露心尖部，于心尖部至主動脈穿刺，用生理鹽水和 4% 多聚甲醛溶液固定；然后暴露大腦，取腦橋被蓋背外側部，進行以下觀測。對照組于分組后 1 d、1 周以及 1、3、6 個月各取 1 只大鼠腦橋被蓋背外側部進行相應觀測。
1.3.1 HE 染色觀察
取腦橋被蓋背外側部組織，用 4% 多聚甲醛固定，生理鹽水沖洗，梯度乙醇脫水，行 5 μm 厚縱切片，常規進行 HE 染色。隨機取 10 個視野，于光鏡高倍鏡（×10）下觀察腦橋被蓋背外側部組織結構變化情況。
1.3.2 Bcl-2 免疫組織化學 SP 染色觀察
取腦橋被蓋背外側部組織，采用免疫組織化學 SP 染色檢測。常規脫蠟、水化，抗原修復，PBS 液沖洗，滴加正常山羊血清封閉液保護，加入 Bcl-2 小鼠單克隆抗體 50 μL，室溫靜置 1 h，或 4℃ 過夜后 37℃ 復溫 45 min，或 37℃ 靜置 1 h。PBS 洗 3 次各 5 min；滴加二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體 40～50 μL，室溫靜置 1 h 或 37℃ 靜置 30 min；PBS 洗 3 次各 5 min；DAB 顯色 5～10 min，PBS 沖洗 5 min，蘇木精復染 2 min，鹽酸乙醇分化；PBS 沖洗 5～10 min；脫水、透明、封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇 5 個視野，計數陽性細胞（細胞質呈棕黃色），并計算陽性細胞比例。按陽性細胞比例分為 4 個等級：陰性（–），<5%；弱陽性（+），5%～30%；陽性（++），30%～60%；強陽性（+++），>60%。
2 結果
2.1 HE 染色觀察
對照組：各時間點標本均無明顯區別，均見神經元細胞密集、排列整齊，細胞核居中，核仁清楚。實驗組：術后 1 d，與對照組無明顯區別；1 周，可見神經元細胞周圍間隙稍增寬；1 個月，部分神經元出現細胞核固縮；3、6 個月，細胞核固縮的細胞越來越多，甚至部分細胞出現核消失。見圖 1。
2.2 Bcl-2 免疫組織化學 SP 染色觀察
對照組 5 只大鼠 Bcl-2 表達均呈弱陽性（+）。實驗組：術后 1 d 均出現明顯 Bcl-2 陽性表達（++）；術后 7 d，Bcl-2 陽性表達明顯升高，并達高峰，呈強陽性（+++）5 只、陽性（++）1 只；術后 1、3、6 個月 Bcl-2 陽性表達逐漸下降，但仍高于對照組，其中 1 個月時強陽性（+++）2 只、陽性（++）4 只，3 個月時均為陽性（++），6 個月時陽性（++）4 只、弱陽性（+++）1 只。見圖 2。
圖1
兩組大鼠各時間點 HE 染色觀察（×10）
a. 對照組；b. 實驗組術后 1 d；c. 實驗組術后 1 周；d. 實驗組術后 1 個月；e. 實驗組術后 3 個月；f. 實驗組術后 6 個月
Figure1. HE staining observation of 2 groups at each time point (×10)a. Control group; b. Experimental group at 1 day after operation; c. Experimental group at 1 week after operation; d. Experimental group at 1 month after operation; e. Experimental group at 3 months after operation; f. Experimental group at 6 months after operation
圖2
兩組大鼠各時間點 Bcl-2 免疫組織化學染色觀察（倒置熒光顯微鏡×40）
a. 對照組；b. 實驗組術后 1 d；c. 實驗組術后 1 周；d. 實驗組術后 1 個月；e. 實驗組術后 3 個月；f. 實驗組術后 6 個月
Figure2. Bcl-2 immunohistochemical SP staining observation of 2 groups at each time point (Inverted fluorescence microscope×40)a. Control group; b. Experimental group at 1 day after operation; c. Experimental group at 1 week after operation; d. Experimental group at 1 month after operation; e. Experimental group at 3 months after operation; f. Experimental group at 6 months after operation
3 討論
長期以來，對脊髓損傷后膀胱功能障礙的研究主要集中在膀胱運動、感覺功能的缺失及其功能重建上，而對于損傷后造成的大腦儲尿排尿相關的各功能區退變研究較少。人的高級排尿中樞位于腦部，大腦、丘腦、基底節、邊緣系統、下丘腦和腦干網狀結構參與排尿調控過程，腦橋排尿中樞和 Barrington 核中轉的脊髓-延髓-脊髓反射是排尿調控的關鍵環節；腦橋排尿中樞的 M 區和 L 區接受來自中腦導水管灰質的神經信號，分別具有興奮和抑制膀胱的作用。大鼠 Barrington 核是位于腦橋被蓋背外側部，為腦橋排尿中樞[7]。本實驗通過建立大鼠脊髓圓錐橫斷傷模型，對大腦膀胱中樞區域變化情況進行初步觀察。
3.1 腦橋排尿中樞出現神經元凋亡病理改變
研究表明大鼠脊髓損傷可能導致大腦皮質神經元的死亡[8]，但其引起腦部變化的確切機制尚不清楚。有研究認為脊髓損傷可導致腦內發生慢性炎癥[9]，其可抑制神經再生[10]。也有研究認為可能是由于腦內的神經遞質發生變化[11]，嚴重影響脊髓功能修復。Felix 等[10]發現，脊髓損傷可誘導大腦皮質和海馬 CA1 區中神經元細胞凋亡和死亡。但也有學者得出相反的研究結果，脊髓損傷后僅誘導腦部神經元發生形態改變，并未發生凋亡或消失[12]。McBride 等[13]研究發現脊髓 T9 節段橫斷損傷后 20 周大腦皮質神經元數量無變化，只是神經元的大小顯著減小。本研究建立大鼠脊髓圓錐損傷模型，發現脊髓損傷后隨時間延長，腦橋排尿中樞神經元細胞出現凋亡病理改變。損傷后 1 個月出現明顯神經元細胞核固縮，3、6 個月細胞出現核消失，這是典型的壞死表現。
3.2 腦橋 Bcl-2 蛋白表達變化
目前已證實 Bcl-2 基因是重要的抗凋亡基因之一[14]，其基因家族包括促進（Bax）和抑制（Bcl-2）細胞凋亡的兩大類成員，是脊髓損傷后細胞凋亡的重要調控基因。研究表明 Bcl-2 對神經功能的保護作用是多方面的，過度表達的 Bcl-2 能抑制由于鈣超載、興奮性氨基酸及缺血缺氧等誘發的神經元凋亡[15]。并且 Bcl-2 是可誘導基因，神經受損后，通過誘導可以增加其在神經組織中的表達并增加神經抗損傷的能力[16]。Luo 等[17]制作大鼠脊髓損傷模型，實驗組整合 Bcl-2 基因，并使脊髓中 Bcl-2 過表達，對照組相同位置只整合β-半乳糖苷酶基因，發現術后實驗組殘留的正常脊髓組織明顯多于對照組，凋亡的神經元數量也明顯少于對照組，說明 Bcl-2 的過表達具有保護神經組織、抑制細胞凋亡和細胞壞死的作用。本研究結果發現，實驗組術后 1 周 Bcl-2 蛋白表達明顯增高，并達高峰，術后 1、3、6 個月 Bcl-2 陽性表達逐漸下降，但仍高于對照組。表明大鼠腦橋排尿中樞 Bcl-2 表達與脊髓損傷有因果關系，損傷促進 Bcl-2 基因的表達，使 Bcl-2 含量迅速升高，從而在損傷早期即可發揮抑制細胞凋亡的作用。以后 Bcl-2 表達有所回落，可能與相關神經元發生細胞壞死和凋亡，影響蛋白質的合成有關。術后 1、3、6 個月表達雖然下降但仍高于正常水平，提示 Bcl-2 增加表達以組織修復為主，其作用是誘導神經元增加表達，減少細胞死亡。但 Bcl-2 增加表達并不能逆轉神經細胞退變，可能是脊髓全橫斷損傷后引起腦內慢性炎癥及引起上行通路神經元的凋亡等促進腦部退變的因素占優勢，從而使神經細胞向壞死和凋亡方向發展。
綜上述，脊髓圓錐損傷后會出現膀胱中樞退變、神經細胞凋亡現象；Bcl-2 蛋白表達增加是機體阻止細胞凋亡和組織修復的表現，但 Bcl-2 增加并不能逆轉神經結構退變。有觀點認為脊髓損傷后通過損傷軸突的逆行退化可引起上行通路神經元的凋亡[18]，若利用損傷平面以上正常的神經根和支配膀胱的骶神經根吻合，重建膀胱的傳入和傳出通路，是否可阻止膀胱中樞細胞凋亡并對腦部結構進行重塑，目前尚無報道，需要進一步研究證實。
