引用本文： 龔飛宇, 魏在榮, 金文虎, 李海, 鄧呈亮, 吳必華, 聶開瑜. 人羊膜間充質干細胞來源的雪旺細胞樣細胞移植在皮瓣神經再生中的作用. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(1): 80-90. doi: 10.7507/1002-1892.201708007 復制
周圍神經損傷是外科領域常見疾病，可由創傷、腫瘤等原因引起，其損傷后可能導致神經功能完全或永久性喪失。盡管自體神經移植是其修復的金標準，但存在供體有限、供區部位失神經而引起并發癥（如感覺障礙、神經瘤等）以及供區神經直徑和長度與受區不匹配等因素，導致其無法在臨床中廣泛應用[1]。雪旺細胞（Schwann cells，SCs）是支持周圍神經再生的種子細胞，但其存在獲取困難、增殖少、細胞量不足、存活率較低、來源有限以及可能產生供區并發癥等問題，限制了其在臨床上的廣泛應用[2]。近幾年，干細胞治療周圍神經損傷成為了研究熱點。本研究中，我們擬在體外將人羊膜間充質干細胞（human amniotic membrane mesenchymal stem cells，hAMSCs）誘導分化為 SCs 樣細胞（SCs-like cells），采用免疫熒光染色法、Western blot、實時熒光定量 PCR（real time fluorescent quantitative PCR，qPCR）以及 ELISA 法檢測相應標志，并在大鼠腹壁失神經支配的穿支皮瓣模型中觀察 hAMSCs 和 SCs-like cells 促進神經再生的情況，為臨床上皮瓣感覺功能的恢復提供一種新的選擇。
1 材料與方法
1.1 實驗材料、動物及主要試劑、儀器
經產婦及家屬知情同意，并經遵義醫學院附屬醫院倫理委員會批準后，對本院婦產科產前檢測人類乙型肝炎病毒 5 項、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、梅毒等其他相關傳染性指標均呈陰性的健康足月剖宮產胎盤（產婦年齡<30 歲），無菌條件下剝離羊膜。
健康成年 SD 雌性大鼠 75 只，體質量（200±10）g，購于第三軍醫大學實驗動物中心。
DMEM/F12 培養基、0.25% 胰蛋白酶+EDTA（HyClone 公司，美國）；L-谷氨酰胺（Amresco 公司，美國）；FBS、Ⅱ 型膠原酶（GIBCO 公司，美國）；青鏈雙抗、β-巰基乙醇（北京索萊寶科技有限公司）；全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）、Forskolin（Sigma 公司，美國）；PDGF-AA、bFGF、調蛋白 β-1（Heregulin β-1；Peprotech 公司，美國）；兔抗 p75 單克隆抗體、兔抗 S-100 單克隆抗體、兔抗神經膠質酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、小鼠抗神經絲重鏈多肽抗體（neurofilament heavy polypeptide antibody，NF-01）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG（Abcam 公司，美國）。CO2 細胞培養箱（Thermo Scientific 公司，美國）；倒置相差熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；qPCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；酶標儀（Tecan 公司，奧地利）；冰凍切片機（Leica 公司，德國）；ND1000 型微量紫外可見分光光度計（Thermo Scientific 公司，美國）。
1.2 hAMSCs 分離、培養及鑒定
1.2.1 hAMSCs 分離、培養
取羊膜用含雙抗的無菌 PBS 溶液沖洗，用 2 個載玻片輕輕刮除羊膜表面的血管和黏液并剪碎，0.05% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化液 37℃、200 r/min 消化 30 min；移除消化液，按上述步驟再次消化，300 目細胞過濾篩過濾以去除人羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）；剩余組織用 PBS 沖洗 3 次，加入0.5 mg/mLⅡ 型膠原酶-0.05 mg/mL DnaseⅠ，37℃、200 r/min 消化 1 h；300 目細胞過濾篩過濾，收集細胞濾液，終止消化，以半徑 20 cm、1 500 r/min 離心 10 min，棄上清，用完全培養基（含 10%FBS、1% L-谷氨酰胺、1% 雙抗、10 ng/mL bFGF 的 DMEM/F12 培養基）重懸細胞，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養，48 h 后進行細胞換液。待細胞匯合達 80%～90% 時，0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.2.2 hAMSCs 鑒定
① 流式細胞術檢測 hAMSCs 免疫表型：待第 3 代細胞密度達 90% 時，0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化，以半徑 20 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，沉淀物用 PBS 洗滌 2 遍，調節細胞濃度為 1×106 個/L，分別加入抗大鼠 CD90、CD44、CD73、CD105 和陰性混合組抗體（包含 CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR），用 PBS 洗滌多余抗體后采用流式細胞儀分析。
② 免疫熒光法鑒定 hAMSCs：將干凈蓋片置入 6 孔板內，取第 3 代 hAMSCs 以 2×105 個/孔密度接種于蓋片上，待細胞密度達 80%～90% 時，4% 多聚甲醛室溫固定 30 min。PBS 洗滌 5 min，重復 3 次，室溫封閉 30 min。分別用抗體稀釋液緩沖液[1×PBS，1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）]稀釋一抗大鼠抗波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體和大鼠抗細胞角蛋白 19（cytokeratin 19，CK19）單克隆抗體，并置入濕盒內，4℃ 過夜；對照組加 PBS 代替一抗。PBS 洗滌 5 min，重復 3 次。用抗體稀釋緩沖液稀釋二抗室溫避光孵育 1 h。DAPI 染色 1 min，95% 甘油封片，倒置相差熒光顯微鏡觀察。
1.3 hAMSCs 體外誘導分化為 SCs-like cells 及相關觀測
1.3.1 hAMSCs 體外誘導分化為 SCs-like cells
待 6 孔板內第 3 代 hAMSCs 密度達 80%～90% 時，PBS 漂洗 3 次，加入誘導液 1[含 1 mmol/L β-巰基乙醇的 DMEM/F12 培養液]，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養 24 h；PBS 漂洗 3 次，加入誘導液 2（含 35 ng/mL ATRA 及 10%FBS 的 DMEM/F12 培養液），置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內開放培養 72 h；PBS 漂洗 3 次，加入誘導液 3[含 10%FBS、5 mmol/L Forskolin、10 ng/mL bFGF、 5 ng/mL PDGF-AA 以及 200 ng/mL Heregulin β-1 的 DMEM/F12 培養液]，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內開放培養，每隔 3 d 換液 1 次，培養 2 周。每次更換誘導液時均在倒置相差顯微鏡下觀察。
1.3.2 免疫熒光法檢測 S-100、p75 和 GFAP 表達
取第 3 代 hAMSCs 及 SCs-like cells，PBS 洗滌 5 min，重復 3 次，室溫封閉 30 min。分別用抗體稀釋液緩沖液稀釋一抗兔抗 S-100 單克隆抗體、兔抗 p75 單克隆抗體以及兔抗 GFAP 多克隆抗體，并置入濕盒內，4℃ 過夜；對照組加 PBS 代替一抗。PBS 洗滌 5 min，重復 3 次。用抗體稀釋液緩沖液稀釋二抗室溫避光孵育 1 h。DAPI 染色 1 min，95% 甘油封片，倒置相差熒光顯微鏡觀察；隨機選擇 4 個不同視野計數陽性細胞，并按以下公式計算陽性細胞百分比：陽性細胞數/細胞總數×100%。
1.3.3 Western blot 檢測 S-100、p75 和 GFAP 蛋白表達
收集第 3 代培養 6 d 的 hAMSCs 及 SCs-like cells，用 RIPA 裂解液裂解細胞，收集細胞總蛋白。以 BCA 法測定蛋白濃度，每組取 40 μg 蛋白進行電泳轉膜，以含 5% 脫脂奶粉的 TBST 浸泡聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，室溫搖床封閉 2 h，分別加入一抗兔抗 S-100 單克隆抗體（1∶2 000）、兔抗 p75 單克隆抗體（1∶10 000）、兔抗 GFAP 多克隆抗體（1∶10 000）以及兔抗 GAPDH 多克隆抗體（1∶1 000），4℃ 孵育過夜。TBST 充分洗滌 PVDF 膜 5～6 次，每次 5 min，加入用封閉液按 1∶50 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，37℃ 搖床孵育 2 h；以 GAPDH 為內參蛋白。將 ECL 試劑中增強液與穩定的過氧化物酶溶液按 1∶1 比例混勻，滴加工作液于 PVDF 膜上，反應數分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X 線片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。沖洗膠片，晾干膠片，掃描膠片，用 BandScan 軟件分析膠片灰度值。
1.3.4 qPCR 檢測 S-100、p75 和 GFAP 基因表達
收集第 3 代培養 6 d 的 hAMSCs 及 SCs-like cells，用 Trizol 試劑提取各自的總 RNA，每 1×106 個細胞加入 1 mL Trizol 試劑，并加入 200 μL 氯仿，用力振搖 15 s，室溫靜置 10 min，4℃、12 000×g 離心 15 min。取上層無色液體轉移至新的 EP 管中，等體積異丙醇洗滌后以 75% 無水乙醇洗滌，取沉淀物加入 20 μL DEPC 水溶解，使用 ND1000 型微量紫外可見分光光度計檢測所提取的總 RNA 濃度及吸光度（A）值，取 A 值范圍為 1.8～2.0 的 RNA 備用。利用逆轉錄試劑盒為原料將總 RNA 反轉錄成 cDNA。用 qPCR 儀檢測各基因表達，以 GAPDH 作為內參基因。各基因引物序列及產物長度見表 1。PCR 循環程序：94℃、3 min，94℃、20 s，55℃、20 s，72℃、20 s，40 個循環。采用 2–ΔΔCt法分析各基因 mRNA 相對表達量。
表1
qPCR 檢測基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product length for qPCR
1.3.5 ELISA 檢測細胞上清液中 BDNF 和 NGF 表達
取第 3 代培養 6 d 的 hAMSCs，提取上清液，1 000×g 離心 20 min，收集其上清液（記為 1 組）；更換誘導液 1 和誘導液 2 培養時，分別提取上清液（分別為誘導 1、4 d 時的上清液），1 000×g 離心 20 min，收集其上清液（記為 2、3 組）；更換誘導液 3 后，每隔 3 d 換液 1 次，換液時提取上清液（分別為誘導 7、10、13、16、19 d 時的上清液），1 000×g 離心 20 min，收集其上清液（分別記為 4、5、6、7、8 組）。根據 ELISA 檢測試劑盒說明書測量 BDNF 和 NGF 表達量。
1.4 動物實驗
1.4.1 建立大鼠腹壁失神經支配穿支皮瓣模型
造模前 24 h 所有大鼠均使用 8% 硫化鈉脫毛，術前使用 3.6% 水合氯醛腹腔注射麻醉。于腹部尋找皮瓣穿支點，以此穿支點為中心設計皮瓣模型，并標記。常規消毒，并依次切開皮膚至筋膜層，術中仔細分離、保留 1 支腹壁穿支作為皮瓣蒂部，剩余穿支及神經纖維全部離斷，止血，采用 3-0 絲線原位縫合皮瓣，建立大鼠腹壁失神經支配穿支皮瓣模型。在穿支血管旁 1 cm 處標記，作為注射細胞位置。
1.4.2 實驗分組
將造模大鼠隨機分為 3 組：hAMSCs 移植組（A 組）、SCs-like cells 移植組（B 組）及穿支皮瓣模型對照組（C 組），每組 25 只。造模后 1 d 所有皮瓣均存活，A、B、C 組分別于標記處向皮瓣及其周圍正常皮膚組織皮內注射培養 6 d 處于增殖期的第 3 代 hAMSCs 1×106 個、SCs-like cells 1×106 個和等體積 PBS，使其形成皮丘。過程中嚴格遵循無菌原則。術后 7 d 傷口愈合，皮瓣色澤、質地與周圍正常皮膚無明顯差異。
1.4.3 免疫熒光法染色檢測皮瓣神經再生
細胞移植后 2、5、7、9、14 d，每組分別采用過量水合氯醛腹腔注射處死 5 只動物，切取細胞注射標記部位皮瓣組織，放入預冷 4% 多聚甲醛中固定 4～6 h，然后轉移到 30% 蔗糖溶液中 48～60 h，直至皮瓣組織沉底；包埋后立即置于–20℃ 冰凍切片機內速凍 40 min，在與皮瓣邊緣垂直方向上對皮瓣組織行連續切片，厚 10 μm，用多聚賴氨酸包被的載玻片制作貼片，PBS 洗滌 10 min，重復 3 次，10%FBS 室溫封閉 1 h，用抗體稀釋液緩沖液稀釋一抗鼠抗 NF-01 單克隆抗體，并置入濕盒內，4℃ 過夜；對照組加 PBS 代替一抗。PBS 洗滌 10 min，重復 3 次，用抗體稀釋液緩沖液稀釋二抗室溫避光孵育 1 h，倒置相差熒光顯微鏡觀察。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hAMSCs 形態學觀察及鑒定
細胞接種 48 h 換液，hAMSCs 形態多樣，隨后細胞數量明顯增多，逐漸變為長梭形；培養 5～6 d 密度可達 90% 以上，多呈旋渦狀生長。傳代后 hAMSCs 增殖迅速，4～6 d 密度可達 80%～90%，形態呈長梭形，旋渦狀生長。見圖 1。
圖1
hAMSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40）
a. 原代培養 48 h；b. 第 3 代培養 6 d
Figure1. Morphological observation of hAMSCs (Inverted phase contrast microscope×40)a. Primary hAMSCs cultured for 48 hours; b. Third generation of hAMSCs cultured for 6 days
流式細胞儀檢測示：hAMSCs 表面標志 CD90（99.61%）、CD44（99.64%）、CD73（99.82%）、CD105（91.84%）表達陽性，陰性混合組（0.12%）表達陰性，符合 MSCs 表面標志特點。見圖 2。免疫熒光法鑒定示：hAMSCs 高表達 Vimentin，未表達 CK19，說明培養的為高純度 hAMSCs。見圖 3。
圖2
流式細胞儀檢測 hAMSCs 表面標志
a. CD90; b. CD44; c. CD105; d. CD73; e. 陰性混合組
Figure2. Surface marker identification of hAMSCs by flow cytometerya. CD90; b. CD44; c. CD105; d. CD73; e. Negative mixed group
圖3
免疫熒光法鑒定 hAMSCs（倒置相差熒光顯微鏡×100）
從左至右分別為檢測因子、DAPI 及二者組合 a.Vimentin；b. CK19
Figure3. Identification of hAMSCs by immunofluorescence (Inverted phase contrast fluorescence microscopy×100)From left to right for test factors, DAPI, and a combination respectively a. Vimentin; b. CK19
2.2 hAMSCs 體外誘導分化為 SCs-like cells 相關觀測
2.2.1 SCs-like cells 形態學觀察
第 3 代 hAMSCs 培養 6 d 后可見細胞密度達 90%；加入誘導液 1 誘導 24 h 后，細胞形態未見明顯變化，仍呈長梭形、旋渦狀生長，但少量細胞脫落、死亡；更換誘導液 2 誘導 72 h 后，細胞大部分仍呈梭形，細胞較前增殖明顯，旋渦狀排列；更換誘導液 3 后，誘導 15 d，可見部分細胞的細胞核變大、立體感強、周圍出現光暈、突起細長、呈紡錘形及旋渦狀生長。見圖 4。
圖4
hAMSCs 在體外誘導分化為 SCs-like cells 形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 第 3 代 hAMSCs 培養 6 d；b. 誘導液 1 誘導 24 h；c. 誘導液 2 誘導 72 h；d. 誘導液 3 誘導 3 d；e. 誘導液 3 誘導 6 d；f. 誘導液 3 誘導 9 d；g. 誘導液 3 誘導 12 d；h. 誘導液 3 誘導 15 d
Figure4. Morphological observation of SCs-like cells induced from hAMSCs in vitro (Inverted phase contrast microscope×100)a. Third generation of hAMSCs cultured for 6 days; b. Induced liquid 1 induced for 24 hours; c. Induced liquid 2 induced for 72 hours; d. Induction fluid 3 induced for 3 days; e. Induction fluid 3 induced for 6 days; f. Induction fluid 3 induced for 9 days; g. Induction fluid 3 induced for 12 days; h. Induction fluid 3 induced for 15 days
2.2.2 免疫熒光法檢測 S-100、p75 和 GFAP 表達
倒置相差熒光顯微鏡下觀察示，hAMSCs 與 SCs-like cells 均可見發綠色熒光的 S-100、p75 和 GFAP 陽性細胞表達，SCs-like cells 陽性表達明顯強于 hAMSCs。見圖 5。SCs-like cells 的 S-100、p75、GFAP 陽性細胞百分比分別為 84.675%±1.217%、70.495%±3.003%、83.648%±2.351%，均顯著高于 hAMSCs 的 56.010%±4.186%、45.640%±3.101%、69.045%±1.791%，差異均有統計學意義（t=13.151，P=0.000；t=11.524，P=0.000；t=9.880，P=0.000）。
圖5
免疫熒光法檢測 hAMSCs 和 SCs-like cells 各因子表達（倒置相差熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 S-100、p75 和 GFAPa. hAMSCs；b. SCs-like cells
Figure5. The factor expression of hAMSCs and SCs-like cells detected by immunofluorescence (Inverted phase contrast fluorescence microscopy×100)From left to right for S-100, p75, and GFAP respectively a. hAMSCs; b. SCs-like cells
2.2.3 Western blot 檢測 S-100、p75 和 GFAP 蛋白表達
SCs-like cells 的 S-100、p75 和 GFAP 蛋白表達量分別為 0.870 3±0.007 8、0.846 8±0.027 3、0.891 1±0.020 6，均顯著高于 hAMSCs 的 0.420 7±0.021 2、0.469 8±0.049 1、0.306 0±0.009 2，差異均有統計學意義（t=42.922，P=0.000；t=15.880，P=0.000；t=52.435，P=0.000）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測 hAMSCs 和 SCs-like cells S-100、p75、GFAP 蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：hAMSCs 2：SCs-like cells
Figure6. Protein expression of S-100, p75, and GFAP in hAMSCs group and SCs-like cells group by Western blotMr: Relative molecular mass 1: hAMSCs 2: SCs-like cells
2.2.4 qPCR 檢測 S-100、p75 和 GFAP 基因表達
SCs-like cells 的 S-100、p75、GFAP 基因相對表達量分別為 0.014 1±0.006 3、0.005 3±0.001 4、0.018 7±0.010 2，均明顯高于 hAMSCs 的 0.001 4±0.000 3、0.002 2±0.000 8、0.007 8±0.001 9，差異均有統計學意義（t=5.371，P=0.000；t=5.370，P=0.000；t=2.317，P=0.036）。
2.2.5 ELISA 檢測細胞上清液中 BDNF 和 NGF 表達
1 組 hAMSCs 培養 6 d 后 BDNF 和 NGF 均有表達，但表達量低；更換誘導液 1 后，2 組 BDNF 和 NGF 表達量明顯下降；更換誘導液 2 后，3 組可見 BDNF 和 NGF 再次分泌，且表達量高于 1 組；更換誘導液 3 后，隨誘導時間延長，BDNF 和 NGF 的表達量逐漸升高。各組間比較 BDNF 和 NGF 表達量差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
ELISA 檢測細胞上清液中 BDNF 和 NGF 表達量 （n=8，pg/mL，
）
Table2.
The concentration of BDNF and NGF in supernatant was detected by ELISA (n=8, pg/mL,
)
2.3 免疫熒光法染色檢測大鼠皮瓣神經再生
細胞移植后 2 d，各組均可見少量散在排列以及短而細的神經纖維；隨時間延長，A、B 組中神經纖維數量逐漸增多，C 組神經纖維數量逐漸減少。A、B 組神經纖維數量均明顯多于 C 組，B 組多于 A 組。見圖 7。
圖7
免疫熒光法染色檢測細胞移植后各時間點神經纖維再生情況（倒置相差熒光顯微鏡×200）
箭頭示再生神經纖維 從左至右依次為 A、B、C 組 a. 2 d；b. 5 d；c. 7 d；d. 9 d；e. 14 d
Figure7. The regeneration of nerve fibers at various time points after cell transplantation detected by immunofluorescence staining (Inverted phase contrast fluorescence microscopy×200)Arrow indicated regeneration nerve fiber From left to right for groups A, B, and C respectively a. At 2 days; b. At 5 days; c. At 7 days; d. At 9 days; e. At 14 days
3 討論
臨床上常使用皮瓣移植修復創面，且成功率越來越高。但創傷后引起的神經損傷成為整形外科急需解決的一個難題，其治療費用昂貴、療效不理想，損傷后可能導致神經功能完全或永久性喪失。失神經支配的創面易發生感染，導致皮瓣壞死，由于缺乏神經營養的支持，皮瓣易產生麻木感等[3]。皮瓣神經功能恢復一般有兩種方法：一種是通過周圍途徑，使受區神經纖維長入皮瓣[4]；另一種是通過中央途徑，采用顯微外科技術將受區與供區的神經進行吻合。這兩種途徑各有其優缺點：盡管皮瓣可通過周圍途徑從周圍組織重新獲得神經支配，但其組織內無有髓神經纖維，故對于精細感覺與兩點辨別覺恢復差，易導致破潰、凍傷及瘙癢等嚴重后果[5-6]；中央途徑利用神經纖維對合引導的原理，使兩端的 SCs 直接接觸，使其恢復通道，進而使新生神經重新長入遠端神經內膜管腔中，然而吻合皮瓣神經難度很大。因此，為了恢復神經感覺和功能，可通過促進皮瓣神經再生來實現。臨床上常采用帶神經蒂皮瓣移植修復創面，取得了較好的效果，且移植后的皮瓣很少發生破潰及凍傷等[7]。近幾年，隨著再生醫學與組織工程學的發展，采用細胞療法來治療周圍神經損傷被眾人所關注。SCs 是支持周圍神經再生的種子細胞，但由于存在各種缺點，使其無法廣泛應用。
100 多年以前，人羊膜組織就被作為一種生物材料用于外科治療中，并成功應用于皮膚移植。人羊膜是一層半透明的生物薄膜，其厚度為 0.02～0.05 mm，結實、柔軟、光滑，無神經、肌肉和淋巴管，整張羊膜展開可達 2 m2，有 2 億左右細胞，由從內向外 5 個組織層構成：上皮層、基質膜層、無細胞致密層、間質細胞層及較為疏松的海綿層[8]。人羊膜細胞可分為 hAMSCs 和 hAECs[9-10]。通過對 hAMSCs 超微結構分析發現其具有微絨毛與較多線粒體，此外還擁有合成蛋白質及分泌生長因子的能力，這些特點說明 hAMSCs 不僅具有促進細胞增殖與分化的能力，而且本身也屬于一種增殖活躍細胞[11]，這為其在再生醫學領域方面的應用奠定了基礎。
3.1 hAMSCs 的分離、培養及純化
目前，主要采用胰蛋白酶/膠原酶二步消化法分離提取 hAMSCs。hAMSCs 細胞數量大，在體外培養過程中，細胞生長速度快，原代細胞接種 48h 后倒置顯微鏡下可見部分細胞生長，細胞形態多樣，呈短梭形、多角形或星形等，中間可見卵圓形細胞核。在 hAMSCs 提取過程中，盡管先行胰蛋白酶消化，但是也不可能除盡混雜在內的 hAECs，因而原代細胞中常混有少量的 hAECs。為了獲得高純度的 hAMSCs，我們利用 hAMSCs 貼壁先于 hAECs 的特點，在原代培養 48 h 后細胞換液以去除 hAECs；同時在細胞消化傳代過程中，hAMSCs 比 hAECs 更容易從瓶壁消化脫落，因此通過采用胰蛋白酶消化和差速貼壁法，可去除混雜在 hAMSCs 內的 hAECs；經過 1～2 代傳代后，可獲得大量高純度的 hAMSCs。雖然差速貼壁法是利用兩種細胞貼壁速度不同而去除貼壁速度較慢的 hAECs，但這種方法也會造成部分 hAMSCs 的丟失。hAMSCs 培養 4～6 d 時為其對數生長期，此期細胞增殖活躍，呈指數級遞增，因此通常選擇培養 4～6 d 的細胞進行傳代或誘導。
3.2 hAMSCs 生物學特性
2004 年首次證明 hAMSCs 表達了神經干細胞的特異性標志蛋白——巢蛋白（Nestin）[12]。隨后的研究表明，hAMSCs 可表達 GFAP 和神經元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）[13]。hAMSCs 還表達 OCT3/4、C-MYC、SOX2、NANOG 以及 SSEA-3 等各種干細胞標記[14]。此外，hAMSCs 低表達 HLA-ABC，不表達 HLA-DR，這使得其在移植后不會發生免疫排斥反應，可用于異體干細胞間移植。同時有研究報道，hAMSCs 不具有致瘤性，通過 Western blot 檢測到 hAMSCs 還表達了抗凋亡因子 Akt-1，這在細胞的生存中扮演了非常關鍵的角色[15]。近幾年，研究表明 hAMSCs 具有控制血管生成的潛能，即局部注射 hAMSCs 進入受損神經部位能夠改善神經病變，hAMSCs 移植進入受損神經部位后展現出了神經血管的趨化性，并增強了血液灌注和毛細血管密度，從而具有誘導神經血管再生的潛能，但主要機制還未完全闡明清楚，有一種猜測認為可能是 hAMSCs 移植進入神經損傷部位后，增加了 Ang-1、FGF-1、IGF-1 和 VEGF-a 等血管生成因子表達，這些上調的血管生成因子可能展現出了促進神經營養和逆轉神經病變的作用[16]。
研究表明干細胞可向 SCs-like cells 分化，但其具體機制尚未解釋清楚[17]。hAMSCs 具有干細胞特性[14]，且 hAMSCs 還具有很強的可塑性和多向分化潛能，在適當因子的調節下能夠向所有 3 個胚層（外胚層、中胚層和內胚層）細胞系分化[18-21]。對于 hAMSCs 移植治療機制，一種推測可能是與 hAMSCs 移植到宿主體內后分泌一些特定的細胞因子相關聯，通過旁分泌機制來調節宿主體內并激活處于休眠狀態的干細胞分化來發揮作用。
3.3 SCs 在神經再生通道建立中的作用及其用于周圍神經修復中的局限
周圍神經再生是一個復雜和緩慢的過程，但在一定程度上具有內在的再生能力[22]。SCs 是支持周圍神經再生的種子細胞，也是髓鞘形成細胞，對神經元的存活和再生起到了非常重要的作用。神經再生的過程中，SCs 可形成一條實心細胞索即 Büngner 帶[23-24]，充當了軸突再生的途徑。SCs 可以清除位于損傷部位的髓鞘碎片[23]。同時 SCs 能夠分泌 GDNF、NGF、BDNF 以及 NT-3 等神經生長因子，這些因子可以促進軸突生長[25]，還可表達細胞外基質蛋白（層粘連蛋白以及纖維蛋白等）和黏附分子[26]。SCs 對于肌肉間突觸的形成與活動起到了調制作用[27]。綜上，SCs 能夠增強軸突的再生并協調形成髓鞘，在動物實驗模型中表現出了修復周圍神經損傷的效果。然而，由于 SCs 有絲分裂活動受到了限制，在體外培養過程中獲取困難、增殖少、細胞量不足、存活率較低、來源有限以及可能產生供區并發癥等因素，限制了其在臨床上的廣泛應用。
3.4 hAMSCs 在體外向 SCs-like cells 誘導分化
MSCs 具有強大的自我更新能力、多向分化潛能以及分泌細胞因子等特點[28]，使之成為了替代 SCs 用于修復周圍神經損傷的理想細胞。MSCs 不僅能夠促進神經再生，還可誘導分化為 SCs-like cells。經過特定化學因子的刺激，神經干細胞[2]、脂肪干細胞[29]、BMSCs[30]、肌源性干細胞[31]、牙髓干細胞[32]以及人臍帶間充質干細胞[33]等均能誘導分化為 SCs-like cells，但這些干細胞都存在各自的利弊，且具體的誘導機制仍未解釋清楚，所以還需要進一步深入研究。
根據對 hAMSCs 形態學及生物學特性的研究，發現 hAMSCs 表達了神經干細胞的特異性標志蛋白——Nestin，還表達 OCT3/4、C-MYC、SOX2、NANOG 以及 SSEA-3 等各種干細胞標記，這些發現證明 hAMSCs 具有神經干細胞特性[14]。此外，hAMSCs 能夠向神經細胞樣細胞分化，且表達 GFAP 和 NSE[13]。因此，以上研究為 hAMSCs 能夠治療神經損傷提供了強有力的證據。BMSCs 是目前研究比較成熟的 SCs 來源；同時，hAMSCs 表面標志物與 BMSCs 類似。因此我們推測，hAMSCs 在體外是否也能誘導分化為 SCs-like cells，進一步加強對于神經損傷的修復。
本研究采用 hAMSCs 在體外通過適當的化學因子調節可向 SCs-like cells 誘導分化。β-巰基乙醇能夠提高細胞內環磷酸腺苷水平，可減輕過氧化物對細胞的損害，在體外有助于神經元細胞的存活[34]。β-巰基乙醇還具有在無血清培養基的情況下保護神經元細胞的功能，并可提高其發出神經突起的能力[35]。ATRA 能夠促進細胞分化與有絲分裂的作用，通過細胞表面 RXRs 和 RARs 來調節 MASH1 和 Neuro D 等編碼因子的表達，對于干細胞向神經分化，這些因子發揮了極其關鍵的作用[36]。另外，ATRA 還是參與機體生理機能和活動不可或缺的條件[37]。因此認為 β-巰基乙醇和 ATRA 可能是 MSCs 向 SCs 分化的啟動因素，但 β-巰基乙醇對細胞也具有一定的毒性作用，使用時必須嚴格控制其濃度。PDGF-AA 對于 MSCs 的影響是多方面的，一方面能夠影響細胞的遷移能力，另一方面 PDGF-AA 是一種重要的促有絲分裂因子，可以刺激細胞的分裂及增殖。bFGF 屬于多肽生長因子，具有增強微血管分化、增加毛細血管數量以及促進細胞增殖等作用[38]。bFGF 和 PDGF-AA 均具有使神經細胞向 SCs 發育的作用[39]。Forskolin 為有絲分裂因子，同時還是腺苷酸環化酶激活劑，可使腺苷酸環化酶激活，使細胞內環磷酸腺苷水平增高[40]。Heregulin 為 EGF 分支[41-42]，是重要的軸突源性信號之一，可阻滯前體 SCs 凋亡，在神經脊細胞誘導分化為 SCs 過程中起了非常重要的作用[43]。
綜上述，采用胰蛋白酶/膠原酶雙酶消化法可分離提取大量 hAMSCs，利用胰蛋白酶消化和差速貼壁法，可獲得高純度的 hAMSCs。hAMSCs 在體外通過適當的化學因子調節可誘導分化為 SCs-like cells，且在誘導分化過程中釋放了大量促進神經生長的因子。hAMSCs 與 SCs-like cells 在移植進入大鼠腹壁失神經支配穿支皮瓣模型后，均可促進神經纖維再生，SCs-like cells 通過釋放神經營養因子，在神經纖維再生數量方面優于 hAMSCs，從而提供了一種新的潛在的促進神經再生的方法。然而，對于這些化學因子具體的誘導機制尚未闡明，且在體內 hAMSCs 是否也可通過上述化學因子的刺激被誘導分化為 SCs-like cells，這些問題還需要深入研究和探討；此外，還可進一步探索 hAECs 在體外誘導分化為 SCs-like cells，并比較兩種細胞的誘導率以及促進神經再生的情況。
周圍神經損傷是外科領域常見疾病，可由創傷、腫瘤等原因引起，其損傷后可能導致神經功能完全或永久性喪失。盡管自體神經移植是其修復的金標準，但存在供體有限、供區部位失神經而引起并發癥（如感覺障礙、神經瘤等）以及供區神經直徑和長度與受區不匹配等因素，導致其無法在臨床中廣泛應用[1]。雪旺細胞（Schwann cells，SCs）是支持周圍神經再生的種子細胞，但其存在獲取困難、增殖少、細胞量不足、存活率較低、來源有限以及可能產生供區并發癥等問題，限制了其在臨床上的廣泛應用[2]。近幾年，干細胞治療周圍神經損傷成為了研究熱點。本研究中，我們擬在體外將人羊膜間充質干細胞（human amniotic membrane mesenchymal stem cells，hAMSCs）誘導分化為 SCs 樣細胞（SCs-like cells），采用免疫熒光染色法、Western blot、實時熒光定量 PCR（real time fluorescent quantitative PCR，qPCR）以及 ELISA 法檢測相應標志，并在大鼠腹壁失神經支配的穿支皮瓣模型中觀察 hAMSCs 和 SCs-like cells 促進神經再生的情況，為臨床上皮瓣感覺功能的恢復提供一種新的選擇。
1 材料與方法
1.1 實驗材料、動物及主要試劑、儀器
經產婦及家屬知情同意，并經遵義醫學院附屬醫院倫理委員會批準后，對本院婦產科產前檢測人類乙型肝炎病毒 5 項、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒、梅毒等其他相關傳染性指標均呈陰性的健康足月剖宮產胎盤（產婦年齡<30 歲），無菌條件下剝離羊膜。
健康成年 SD 雌性大鼠 75 只，體質量（200±10）g，購于第三軍醫大學實驗動物中心。
DMEM/F12 培養基、0.25% 胰蛋白酶+EDTA（HyClone 公司，美國）；L-谷氨酰胺（Amresco 公司，美國）；FBS、Ⅱ 型膠原酶（GIBCO 公司，美國）；青鏈雙抗、β-巰基乙醇（北京索萊寶科技有限公司）；全反式維甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）、Forskolin（Sigma 公司，美國）；PDGF-AA、bFGF、調蛋白 β-1（Heregulin β-1；Peprotech 公司，美國）；兔抗 p75 單克隆抗體、兔抗 S-100 單克隆抗體、兔抗神經膠質酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、小鼠抗神經絲重鏈多肽抗體（neurofilament heavy polypeptide antibody，NF-01）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG（Abcam 公司，美國）。CO2 細胞培養箱（Thermo Scientific 公司，美國）；倒置相差熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；qPCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；酶標儀（Tecan 公司，奧地利）；冰凍切片機（Leica 公司，德國）；ND1000 型微量紫外可見分光光度計（Thermo Scientific 公司，美國）。
1.2 hAMSCs 分離、培養及鑒定
1.2.1 hAMSCs 分離、培養
取羊膜用含雙抗的無菌 PBS 溶液沖洗，用 2 個載玻片輕輕刮除羊膜表面的血管和黏液并剪碎，0.05% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化液 37℃、200 r/min 消化 30 min；移除消化液，按上述步驟再次消化，300 目細胞過濾篩過濾以去除人羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）；剩余組織用 PBS 沖洗 3 次，加入0.5 mg/mLⅡ 型膠原酶-0.05 mg/mL DnaseⅠ，37℃、200 r/min 消化 1 h；300 目細胞過濾篩過濾，收集細胞濾液，終止消化，以半徑 20 cm、1 500 r/min 離心 10 min，棄上清，用完全培養基（含 10%FBS、1% L-谷氨酰胺、1% 雙抗、10 ng/mL bFGF 的 DMEM/F12 培養基）重懸細胞，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養，48 h 后進行細胞換液。待細胞匯合達 80%～90% 時，0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.2.2 hAMSCs 鑒定
① 流式細胞術檢測 hAMSCs 免疫表型：待第 3 代細胞密度達 90% 時，0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化，以半徑 20 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，沉淀物用 PBS 洗滌 2 遍，調節細胞濃度為 1×106 個/L，分別加入抗大鼠 CD90、CD44、CD73、CD105 和陰性混合組抗體（包含 CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR），用 PBS 洗滌多余抗體后采用流式細胞儀分析。
② 免疫熒光法鑒定 hAMSCs：將干凈蓋片置入 6 孔板內，取第 3 代 hAMSCs 以 2×105 個/孔密度接種于蓋片上，待細胞密度達 80%～90% 時，4% 多聚甲醛室溫固定 30 min。PBS 洗滌 5 min，重復 3 次，室溫封閉 30 min。分別用抗體稀釋液緩沖液[1×PBS，1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）]稀釋一抗大鼠抗波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體和大鼠抗細胞角蛋白 19（cytokeratin 19，CK19）單克隆抗體，并置入濕盒內，4℃ 過夜；對照組加 PBS 代替一抗。PBS 洗滌 5 min，重復 3 次。用抗體稀釋緩沖液稀釋二抗室溫避光孵育 1 h。DAPI 染色 1 min，95% 甘油封片，倒置相差熒光顯微鏡觀察。
1.3 hAMSCs 體外誘導分化為 SCs-like cells 及相關觀測
1.3.1 hAMSCs 體外誘導分化為 SCs-like cells
待 6 孔板內第 3 代 hAMSCs 密度達 80%～90% 時，PBS 漂洗 3 次，加入誘導液 1[含 1 mmol/L β-巰基乙醇的 DMEM/F12 培養液]，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內培養 24 h；PBS 漂洗 3 次，加入誘導液 2（含 35 ng/mL ATRA 及 10%FBS 的 DMEM/F12 培養液），置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內開放培養 72 h；PBS 漂洗 3 次，加入誘導液 3[含 10%FBS、5 mmol/L Forskolin、10 ng/mL bFGF、 5 ng/mL PDGF-AA 以及 200 ng/mL Heregulin β-1 的 DMEM/F12 培養液]，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內開放培養，每隔 3 d 換液 1 次，培養 2 周。每次更換誘導液時均在倒置相差顯微鏡下觀察。
1.3.2 免疫熒光法檢測 S-100、p75 和 GFAP 表達
取第 3 代 hAMSCs 及 SCs-like cells，PBS 洗滌 5 min，重復 3 次，室溫封閉 30 min。分別用抗體稀釋液緩沖液稀釋一抗兔抗 S-100 單克隆抗體、兔抗 p75 單克隆抗體以及兔抗 GFAP 多克隆抗體，并置入濕盒內，4℃ 過夜；對照組加 PBS 代替一抗。PBS 洗滌 5 min，重復 3 次。用抗體稀釋液緩沖液稀釋二抗室溫避光孵育 1 h。DAPI 染色 1 min，95% 甘油封片，倒置相差熒光顯微鏡觀察；隨機選擇 4 個不同視野計數陽性細胞，并按以下公式計算陽性細胞百分比：陽性細胞數/細胞總數×100%。
1.3.3 Western blot 檢測 S-100、p75 和 GFAP 蛋白表達
收集第 3 代培養 6 d 的 hAMSCs 及 SCs-like cells，用 RIPA 裂解液裂解細胞，收集細胞總蛋白。以 BCA 法測定蛋白濃度，每組取 40 μg 蛋白進行電泳轉膜，以含 5% 脫脂奶粉的 TBST 浸泡聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，室溫搖床封閉 2 h，分別加入一抗兔抗 S-100 單克隆抗體（1∶2 000）、兔抗 p75 單克隆抗體（1∶10 000）、兔抗 GFAP 多克隆抗體（1∶10 000）以及兔抗 GAPDH 多克隆抗體（1∶1 000），4℃ 孵育過夜。TBST 充分洗滌 PVDF 膜 5～6 次，每次 5 min，加入用封閉液按 1∶50 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，37℃ 搖床孵育 2 h；以 GAPDH 為內參蛋白。將 ECL 試劑中增強液與穩定的過氧化物酶溶液按 1∶1 比例混勻，滴加工作液于 PVDF 膜上，反應數分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X 線片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影。沖洗膠片，晾干膠片，掃描膠片，用 BandScan 軟件分析膠片灰度值。
1.3.4 qPCR 檢測 S-100、p75 和 GFAP 基因表達
收集第 3 代培養 6 d 的 hAMSCs 及 SCs-like cells，用 Trizol 試劑提取各自的總 RNA，每 1×106 個細胞加入 1 mL Trizol 試劑，并加入 200 μL 氯仿，用力振搖 15 s，室溫靜置 10 min，4℃、12 000×g 離心 15 min。取上層無色液體轉移至新的 EP 管中，等體積異丙醇洗滌后以 75% 無水乙醇洗滌，取沉淀物加入 20 μL DEPC 水溶解，使用 ND1000 型微量紫外可見分光光度計檢測所提取的總 RNA 濃度及吸光度（A）值，取 A 值范圍為 1.8～2.0 的 RNA 備用。利用逆轉錄試劑盒為原料將總 RNA 反轉錄成 cDNA。用 qPCR 儀檢測各基因表達，以 GAPDH 作為內參基因。各基因引物序列及產物長度見表 1。PCR 循環程序：94℃、3 min，94℃、20 s，55℃、20 s，72℃、20 s，40 個循環。采用 2–ΔΔCt法分析各基因 mRNA 相對表達量。
表1
qPCR 檢測基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and product length for qPCR
1.3.5 ELISA 檢測細胞上清液中 BDNF 和 NGF 表達
取第 3 代培養 6 d 的 hAMSCs，提取上清液，1 000×g 離心 20 min，收集其上清液（記為 1 組）；更換誘導液 1 和誘導液 2 培養時，分別提取上清液（分別為誘導 1、4 d 時的上清液），1 000×g 離心 20 min，收集其上清液（記為 2、3 組）；更換誘導液 3 后，每隔 3 d 換液 1 次，換液時提取上清液（分別為誘導 7、10、13、16、19 d 時的上清液），1 000×g 離心 20 min，收集其上清液（分別記為 4、5、6、7、8 組）。根據 ELISA 檢測試劑盒說明書測量 BDNF 和 NGF 表達量。
1.4 動物實驗
1.4.1 建立大鼠腹壁失神經支配穿支皮瓣模型
造模前 24 h 所有大鼠均使用 8% 硫化鈉脫毛，術前使用 3.6% 水合氯醛腹腔注射麻醉。于腹部尋找皮瓣穿支點，以此穿支點為中心設計皮瓣模型，并標記。常規消毒，并依次切開皮膚至筋膜層，術中仔細分離、保留 1 支腹壁穿支作為皮瓣蒂部，剩余穿支及神經纖維全部離斷，止血，采用 3-0 絲線原位縫合皮瓣，建立大鼠腹壁失神經支配穿支皮瓣模型。在穿支血管旁 1 cm 處標記，作為注射細胞位置。
1.4.2 實驗分組
將造模大鼠隨機分為 3 組：hAMSCs 移植組（A 組）、SCs-like cells 移植組（B 組）及穿支皮瓣模型對照組（C 組），每組 25 只。造模后 1 d 所有皮瓣均存活，A、B、C 組分別于標記處向皮瓣及其周圍正常皮膚組織皮內注射培養 6 d 處于增殖期的第 3 代 hAMSCs 1×106 個、SCs-like cells 1×106 個和等體積 PBS，使其形成皮丘。過程中嚴格遵循無菌原則。術后 7 d 傷口愈合，皮瓣色澤、質地與周圍正常皮膚無明顯差異。
1.4.3 免疫熒光法染色檢測皮瓣神經再生
細胞移植后 2、5、7、9、14 d，每組分別采用過量水合氯醛腹腔注射處死 5 只動物，切取細胞注射標記部位皮瓣組織，放入預冷 4% 多聚甲醛中固定 4～6 h，然后轉移到 30% 蔗糖溶液中 48～60 h，直至皮瓣組織沉底；包埋后立即置于–20℃ 冰凍切片機內速凍 40 min，在與皮瓣邊緣垂直方向上對皮瓣組織行連續切片，厚 10 μm，用多聚賴氨酸包被的載玻片制作貼片，PBS 洗滌 10 min，重復 3 次，10%FBS 室溫封閉 1 h，用抗體稀釋液緩沖液稀釋一抗鼠抗 NF-01 單克隆抗體，并置入濕盒內，4℃ 過夜；對照組加 PBS 代替一抗。PBS 洗滌 10 min，重復 3 次，用抗體稀釋液緩沖液稀釋二抗室溫避光孵育 1 h，倒置相差熒光顯微鏡觀察。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hAMSCs 形態學觀察及鑒定
細胞接種 48 h 換液，hAMSCs 形態多樣，隨后細胞數量明顯增多，逐漸變為長梭形；培養 5～6 d 密度可達 90% 以上，多呈旋渦狀生長。傳代后 hAMSCs 增殖迅速，4～6 d 密度可達 80%～90%，形態呈長梭形，旋渦狀生長。見圖 1。
圖1
hAMSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40）
a. 原代培養 48 h；b. 第 3 代培養 6 d
Figure1. Morphological observation of hAMSCs (Inverted phase contrast microscope×40)a. Primary hAMSCs cultured for 48 hours; b. Third generation of hAMSCs cultured for 6 days
流式細胞儀檢測示：hAMSCs 表面標志 CD90（99.61%）、CD44（99.64%）、CD73（99.82%）、CD105（91.84%）表達陽性，陰性混合組（0.12%）表達陰性，符合 MSCs 表面標志特點。見圖 2。免疫熒光法鑒定示：hAMSCs 高表達 Vimentin，未表達 CK19，說明培養的為高純度 hAMSCs。見圖 3。
圖2
流式細胞儀檢測 hAMSCs 表面標志
a. CD90; b. CD44; c. CD105; d. CD73; e. 陰性混合組
Figure2. Surface marker identification of hAMSCs by flow cytometerya. CD90; b. CD44; c. CD105; d. CD73; e. Negative mixed group
圖3
免疫熒光法鑒定 hAMSCs（倒置相差熒光顯微鏡×100）
從左至右分別為檢測因子、DAPI 及二者組合 a.Vimentin；b. CK19
Figure3. Identification of hAMSCs by immunofluorescence (Inverted phase contrast fluorescence microscopy×100)From left to right for test factors, DAPI, and a combination respectively a. Vimentin; b. CK19
2.2 hAMSCs 體外誘導分化為 SCs-like cells 相關觀測
2.2.1 SCs-like cells 形態學觀察
第 3 代 hAMSCs 培養 6 d 后可見細胞密度達 90%；加入誘導液 1 誘導 24 h 后，細胞形態未見明顯變化，仍呈長梭形、旋渦狀生長，但少量細胞脫落、死亡；更換誘導液 2 誘導 72 h 后，細胞大部分仍呈梭形，細胞較前增殖明顯，旋渦狀排列；更換誘導液 3 后，誘導 15 d，可見部分細胞的細胞核變大、立體感強、周圍出現光暈、突起細長、呈紡錘形及旋渦狀生長。見圖 4。
圖4
hAMSCs 在體外誘導分化為 SCs-like cells 形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 第 3 代 hAMSCs 培養 6 d；b. 誘導液 1 誘導 24 h；c. 誘導液 2 誘導 72 h；d. 誘導液 3 誘導 3 d；e. 誘導液 3 誘導 6 d；f. 誘導液 3 誘導 9 d；g. 誘導液 3 誘導 12 d；h. 誘導液 3 誘導 15 d
Figure4. Morphological observation of SCs-like cells induced from hAMSCs in vitro (Inverted phase contrast microscope×100)a. Third generation of hAMSCs cultured for 6 days; b. Induced liquid 1 induced for 24 hours; c. Induced liquid 2 induced for 72 hours; d. Induction fluid 3 induced for 3 days; e. Induction fluid 3 induced for 6 days; f. Induction fluid 3 induced for 9 days; g. Induction fluid 3 induced for 12 days; h. Induction fluid 3 induced for 15 days
2.2.2 免疫熒光法檢測 S-100、p75 和 GFAP 表達
倒置相差熒光顯微鏡下觀察示，hAMSCs 與 SCs-like cells 均可見發綠色熒光的 S-100、p75 和 GFAP 陽性細胞表達，SCs-like cells 陽性表達明顯強于 hAMSCs。見圖 5。SCs-like cells 的 S-100、p75、GFAP 陽性細胞百分比分別為 84.675%±1.217%、70.495%±3.003%、83.648%±2.351%，均顯著高于 hAMSCs 的 56.010%±4.186%、45.640%±3.101%、69.045%±1.791%，差異均有統計學意義（t=13.151，P=0.000；t=11.524，P=0.000；t=9.880，P=0.000）。
圖5
免疫熒光法檢測 hAMSCs 和 SCs-like cells 各因子表達（倒置相差熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為 S-100、p75 和 GFAPa. hAMSCs；b. SCs-like cells
Figure5. The factor expression of hAMSCs and SCs-like cells detected by immunofluorescence (Inverted phase contrast fluorescence microscopy×100)From left to right for S-100, p75, and GFAP respectively a. hAMSCs; b. SCs-like cells
2.2.3 Western blot 檢測 S-100、p75 和 GFAP 蛋白表達
SCs-like cells 的 S-100、p75 和 GFAP 蛋白表達量分別為 0.870 3±0.007 8、0.846 8±0.027 3、0.891 1±0.020 6，均顯著高于 hAMSCs 的 0.420 7±0.021 2、0.469 8±0.049 1、0.306 0±0.009 2，差異均有統計學意義（t=42.922，P=0.000；t=15.880，P=0.000；t=52.435，P=0.000）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測 hAMSCs 和 SCs-like cells S-100、p75、GFAP 蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：hAMSCs 2：SCs-like cells
Figure6. Protein expression of S-100, p75, and GFAP in hAMSCs group and SCs-like cells group by Western blotMr: Relative molecular mass 1: hAMSCs 2: SCs-like cells
2.2.4 qPCR 檢測 S-100、p75 和 GFAP 基因表達
SCs-like cells 的 S-100、p75、GFAP 基因相對表達量分別為 0.014 1±0.006 3、0.005 3±0.001 4、0.018 7±0.010 2，均明顯高于 hAMSCs 的 0.001 4±0.000 3、0.002 2±0.000 8、0.007 8±0.001 9，差異均有統計學意義（t=5.371，P=0.000；t=5.370，P=0.000；t=2.317，P=0.036）。
2.2.5 ELISA 檢測細胞上清液中 BDNF 和 NGF 表達
1 組 hAMSCs 培養 6 d 后 BDNF 和 NGF 均有表達，但表達量低；更換誘導液 1 后，2 組 BDNF 和 NGF 表達量明顯下降；更換誘導液 2 后，3 組可見 BDNF 和 NGF 再次分泌，且表達量高于 1 組；更換誘導液 3 后，隨誘導時間延長，BDNF 和 NGF 的表達量逐漸升高。各組間比較 BDNF 和 NGF 表達量差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
ELISA 檢測細胞上清液中 BDNF 和 NGF 表達量 （n=8，pg/mL，
）
Table2.
The concentration of BDNF and NGF in supernatant was detected by ELISA (n=8, pg/mL,
)
2.3 免疫熒光法染色檢測大鼠皮瓣神經再生
細胞移植后 2 d，各組均可見少量散在排列以及短而細的神經纖維；隨時間延長，A、B 組中神經纖維數量逐漸增多，C 組神經纖維數量逐漸減少。A、B 組神經纖維數量均明顯多于 C 組，B 組多于 A 組。見圖 7。
圖7
免疫熒光法染色檢測細胞移植后各時間點神經纖維再生情況（倒置相差熒光顯微鏡×200）
箭頭示再生神經纖維 從左至右依次為 A、B、C 組 a. 2 d；b. 5 d；c. 7 d；d. 9 d；e. 14 d
Figure7. The regeneration of nerve fibers at various time points after cell transplantation detected by immunofluorescence staining (Inverted phase contrast fluorescence microscopy×200)Arrow indicated regeneration nerve fiber From left to right for groups A, B, and C respectively a. At 2 days; b. At 5 days; c. At 7 days; d. At 9 days; e. At 14 days
3 討論
臨床上常使用皮瓣移植修復創面，且成功率越來越高。但創傷后引起的神經損傷成為整形外科急需解決的一個難題，其治療費用昂貴、療效不理想，損傷后可能導致神經功能完全或永久性喪失。失神經支配的創面易發生感染，導致皮瓣壞死，由于缺乏神經營養的支持，皮瓣易產生麻木感等[3]。皮瓣神經功能恢復一般有兩種方法：一種是通過周圍途徑，使受區神經纖維長入皮瓣[4]；另一種是通過中央途徑，采用顯微外科技術將受區與供區的神經進行吻合。這兩種途徑各有其優缺點：盡管皮瓣可通過周圍途徑從周圍組織重新獲得神經支配，但其組織內無有髓神經纖維，故對于精細感覺與兩點辨別覺恢復差，易導致破潰、凍傷及瘙癢等嚴重后果[5-6]；中央途徑利用神經纖維對合引導的原理，使兩端的 SCs 直接接觸，使其恢復通道，進而使新生神經重新長入遠端神經內膜管腔中，然而吻合皮瓣神經難度很大。因此，為了恢復神經感覺和功能，可通過促進皮瓣神經再生來實現。臨床上常采用帶神經蒂皮瓣移植修復創面，取得了較好的效果，且移植后的皮瓣很少發生破潰及凍傷等[7]。近幾年，隨著再生醫學與組織工程學的發展，采用細胞療法來治療周圍神經損傷被眾人所關注。SCs 是支持周圍神經再生的種子細胞，但由于存在各種缺點，使其無法廣泛應用。
100 多年以前，人羊膜組織就被作為一種生物材料用于外科治療中，并成功應用于皮膚移植。人羊膜是一層半透明的生物薄膜，其厚度為 0.02～0.05 mm，結實、柔軟、光滑，無神經、肌肉和淋巴管，整張羊膜展開可達 2 m2，有 2 億左右細胞，由從內向外 5 個組織層構成：上皮層、基質膜層、無細胞致密層、間質細胞層及較為疏松的海綿層[8]。人羊膜細胞可分為 hAMSCs 和 hAECs[9-10]。通過對 hAMSCs 超微結構分析發現其具有微絨毛與較多線粒體，此外還擁有合成蛋白質及分泌生長因子的能力，這些特點說明 hAMSCs 不僅具有促進細胞增殖與分化的能力，而且本身也屬于一種增殖活躍細胞[11]，這為其在再生醫學領域方面的應用奠定了基礎。
3.1 hAMSCs 的分離、培養及純化
目前，主要采用胰蛋白酶/膠原酶二步消化法分離提取 hAMSCs。hAMSCs 細胞數量大，在體外培養過程中，細胞生長速度快，原代細胞接種 48h 后倒置顯微鏡下可見部分細胞生長，細胞形態多樣，呈短梭形、多角形或星形等，中間可見卵圓形細胞核。在 hAMSCs 提取過程中，盡管先行胰蛋白酶消化，但是也不可能除盡混雜在內的 hAECs，因而原代細胞中常混有少量的 hAECs。為了獲得高純度的 hAMSCs，我們利用 hAMSCs 貼壁先于 hAECs 的特點，在原代培養 48 h 后細胞換液以去除 hAECs；同時在細胞消化傳代過程中，hAMSCs 比 hAECs 更容易從瓶壁消化脫落，因此通過采用胰蛋白酶消化和差速貼壁法，可去除混雜在 hAMSCs 內的 hAECs；經過 1～2 代傳代后，可獲得大量高純度的 hAMSCs。雖然差速貼壁法是利用兩種細胞貼壁速度不同而去除貼壁速度較慢的 hAECs，但這種方法也會造成部分 hAMSCs 的丟失。hAMSCs 培養 4～6 d 時為其對數生長期，此期細胞增殖活躍，呈指數級遞增，因此通常選擇培養 4～6 d 的細胞進行傳代或誘導。
3.2 hAMSCs 生物學特性
2004 年首次證明 hAMSCs 表達了神經干細胞的特異性標志蛋白——巢蛋白（Nestin）[12]。隨后的研究表明，hAMSCs 可表達 GFAP 和神經元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）[13]。hAMSCs 還表達 OCT3/4、C-MYC、SOX2、NANOG 以及 SSEA-3 等各種干細胞標記[14]。此外，hAMSCs 低表達 HLA-ABC，不表達 HLA-DR，這使得其在移植后不會發生免疫排斥反應，可用于異體干細胞間移植。同時有研究報道，hAMSCs 不具有致瘤性，通過 Western blot 檢測到 hAMSCs 還表達了抗凋亡因子 Akt-1，這在細胞的生存中扮演了非常關鍵的角色[15]。近幾年，研究表明 hAMSCs 具有控制血管生成的潛能，即局部注射 hAMSCs 進入受損神經部位能夠改善神經病變，hAMSCs 移植進入受損神經部位后展現出了神經血管的趨化性，并增強了血液灌注和毛細血管密度，從而具有誘導神經血管再生的潛能，但主要機制還未完全闡明清楚，有一種猜測認為可能是 hAMSCs 移植進入神經損傷部位后，增加了 Ang-1、FGF-1、IGF-1 和 VEGF-a 等血管生成因子表達，這些上調的血管生成因子可能展現出了促進神經營養和逆轉神經病變的作用[16]。
研究表明干細胞可向 SCs-like cells 分化，但其具體機制尚未解釋清楚[17]。hAMSCs 具有干細胞特性[14]，且 hAMSCs 還具有很強的可塑性和多向分化潛能，在適當因子的調節下能夠向所有 3 個胚層（外胚層、中胚層和內胚層）細胞系分化[18-21]。對于 hAMSCs 移植治療機制，一種推測可能是與 hAMSCs 移植到宿主體內后分泌一些特定的細胞因子相關聯，通過旁分泌機制來調節宿主體內并激活處于休眠狀態的干細胞分化來發揮作用。
3.3 SCs 在神經再生通道建立中的作用及其用于周圍神經修復中的局限
周圍神經再生是一個復雜和緩慢的過程，但在一定程度上具有內在的再生能力[22]。SCs 是支持周圍神經再生的種子細胞，也是髓鞘形成細胞，對神經元的存活和再生起到了非常重要的作用。神經再生的過程中，SCs 可形成一條實心細胞索即 Büngner 帶[23-24]，充當了軸突再生的途徑。SCs 可以清除位于損傷部位的髓鞘碎片[23]。同時 SCs 能夠分泌 GDNF、NGF、BDNF 以及 NT-3 等神經生長因子，這些因子可以促進軸突生長[25]，還可表達細胞外基質蛋白（層粘連蛋白以及纖維蛋白等）和黏附分子[26]。SCs 對于肌肉間突觸的形成與活動起到了調制作用[27]。綜上，SCs 能夠增強軸突的再生并協調形成髓鞘，在動物實驗模型中表現出了修復周圍神經損傷的效果。然而，由于 SCs 有絲分裂活動受到了限制，在體外培養過程中獲取困難、增殖少、細胞量不足、存活率較低、來源有限以及可能產生供區并發癥等因素，限制了其在臨床上的廣泛應用。
3.4 hAMSCs 在體外向 SCs-like cells 誘導分化
MSCs 具有強大的自我更新能力、多向分化潛能以及分泌細胞因子等特點[28]，使之成為了替代 SCs 用于修復周圍神經損傷的理想細胞。MSCs 不僅能夠促進神經再生，還可誘導分化為 SCs-like cells。經過特定化學因子的刺激，神經干細胞[2]、脂肪干細胞[29]、BMSCs[30]、肌源性干細胞[31]、牙髓干細胞[32]以及人臍帶間充質干細胞[33]等均能誘導分化為 SCs-like cells，但這些干細胞都存在各自的利弊，且具體的誘導機制仍未解釋清楚，所以還需要進一步深入研究。
根據對 hAMSCs 形態學及生物學特性的研究，發現 hAMSCs 表達了神經干細胞的特異性標志蛋白——Nestin，還表達 OCT3/4、C-MYC、SOX2、NANOG 以及 SSEA-3 等各種干細胞標記，這些發現證明 hAMSCs 具有神經干細胞特性[14]。此外，hAMSCs 能夠向神經細胞樣細胞分化，且表達 GFAP 和 NSE[13]。因此，以上研究為 hAMSCs 能夠治療神經損傷提供了強有力的證據。BMSCs 是目前研究比較成熟的 SCs 來源；同時，hAMSCs 表面標志物與 BMSCs 類似。因此我們推測，hAMSCs 在體外是否也能誘導分化為 SCs-like cells，進一步加強對于神經損傷的修復。
本研究采用 hAMSCs 在體外通過適當的化學因子調節可向 SCs-like cells 誘導分化。β-巰基乙醇能夠提高細胞內環磷酸腺苷水平，可減輕過氧化物對細胞的損害，在體外有助于神經元細胞的存活[34]。β-巰基乙醇還具有在無血清培養基的情況下保護神經元細胞的功能，并可提高其發出神經突起的能力[35]。ATRA 能夠促進細胞分化與有絲分裂的作用，通過細胞表面 RXRs 和 RARs 來調節 MASH1 和 Neuro D 等編碼因子的表達，對于干細胞向神經分化，這些因子發揮了極其關鍵的作用[36]。另外，ATRA 還是參與機體生理機能和活動不可或缺的條件[37]。因此認為 β-巰基乙醇和 ATRA 可能是 MSCs 向 SCs 分化的啟動因素，但 β-巰基乙醇對細胞也具有一定的毒性作用，使用時必須嚴格控制其濃度。PDGF-AA 對于 MSCs 的影響是多方面的，一方面能夠影響細胞的遷移能力，另一方面 PDGF-AA 是一種重要的促有絲分裂因子，可以刺激細胞的分裂及增殖。bFGF 屬于多肽生長因子，具有增強微血管分化、增加毛細血管數量以及促進細胞增殖等作用[38]。bFGF 和 PDGF-AA 均具有使神經細胞向 SCs 發育的作用[39]。Forskolin 為有絲分裂因子，同時還是腺苷酸環化酶激活劑，可使腺苷酸環化酶激活，使細胞內環磷酸腺苷水平增高[40]。Heregulin 為 EGF 分支[41-42]，是重要的軸突源性信號之一，可阻滯前體 SCs 凋亡，在神經脊細胞誘導分化為 SCs 過程中起了非常重要的作用[43]。
綜上述，采用胰蛋白酶/膠原酶雙酶消化法可分離提取大量 hAMSCs，利用胰蛋白酶消化和差速貼壁法，可獲得高純度的 hAMSCs。hAMSCs 在體外通過適當的化學因子調節可誘導分化為 SCs-like cells，且在誘導分化過程中釋放了大量促進神經生長的因子。hAMSCs 與 SCs-like cells 在移植進入大鼠腹壁失神經支配穿支皮瓣模型后，均可促進神經纖維再生，SCs-like cells 通過釋放神經營養因子，在神經纖維再生數量方面優于 hAMSCs，從而提供了一種新的潛在的促進神經再生的方法。然而，對于這些化學因子具體的誘導機制尚未闡明，且在體內 hAMSCs 是否也可通過上述化學因子的刺激被誘導分化為 SCs-like cells，這些問題還需要深入研究和探討；此外，還可進一步探索 hAECs 在體外誘導分化為 SCs-like cells，并比較兩種細胞的誘導率以及促進神經再生的情況。
