引用本文： 代志鵬, 鄭稼, 高延征, 劉珂, 楊述華, 許偉華. 谷胱甘肽在激素誘導的 BMSCs 功能失調中的作用. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(1): 91-98. doi: 10.7507/1002-1892.201703129 復制
臨床上糖皮質激素常用以治療各種疾病，比如器官移植后的抗免疫排斥治療、系統性紅斑狼瘡、風濕性疾病、哮喘等。然而大量使用激素的一個重要不良反應是導致股骨頭壞死，故激素性股骨頭壞死成為非創傷性股骨頭壞死的重要類型。激素性股骨頭壞死的發病機制尚不明確[1]，一般認為與骨細胞代謝平衡紊亂和凋亡密切相關[2]。近年來，諸多學者研究認為，激素誘導的 BMSCs 成骨、成脂分化異常，在股骨頭壞死發病過程中起著重要作用[3-4]。我們前期研究也發現，激素性股骨頭壞死來源的 BMSCs 成骨分化能力減弱，成脂分化能力增強，且激素可誘導細胞內活性氧水平升高[5]。研究表明[6]，使用激素后，機體的骨組織受到活性氧帶來的氧化損傷，接受激素干預的小鼠體內可檢測到 DNA 的氧化損傷。外源性氧化物可通過增強細胞內活性氧的水平誘導小鼠發生股骨頭壞死[7]。這些研究表明氧化應激在股骨頭壞死中起一定作用。
谷光甘肽（glutathione，GSH）是細胞內含有巰基的抗氧化劑，通過直接參與抗氧化酶的酶促反應，起到抗氧化、抗凋亡作用[8]。本實驗選取人 BMSCs 為研究對象，在 BMSCs 體外培養過程中加入激素建立激素性股骨頭壞死模型，采用不同濃度的 GSH 進行干預，檢測細胞內活性氧水平的改變，同時檢測 BMSCs 成骨分化相關基因和成脂分化相關基因的表達水平，探索細胞內活性氧水平對 BMSCs 成骨、成脂分化的影響，以及能否通過 GSH 降低細胞內活性氧的水平逆轉分化的失衡，從而為治療激素性股骨頭壞死提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
人單核細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；兔抗人 Runx2 多克隆抗體、兔抗人過氧化物酶體增殖激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ，PPAR-γ）多克隆抗體、兔抗人 CCAAT 增強結合蛋白（CCAAT/enhancer-binding family of proteins，C/EBP）多克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；羊抗兔二抗 IgG（武漢博士德生物科技有限公司）；RT-PCR 試劑盒（Takara 公司，日本）。
流式細胞儀（BD 公司，美國）；分光光度計（Millipore 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；凝膠顯像儀（北京六一儀器廠）。
1.2 標本獲取及 BMSCs 分離培養
納入標準：① 股骨頸骨折患者，均為頭下型且 Garden Ⅳ型；② 年齡>65 歲；③ 需行髖關節置換手術。排除標準：① 長期吸煙；② 長期飲酒；③ 長期服用激素；④ 患有強直性脊柱炎或類風濕性疾病；⑤ 有腦卒中病史。經河南省人民醫院倫理委員會批準和患者及家屬書面同意，選取符合標準的 3 例股骨頸骨折患者，于髖關節置換術中，股骨擴髓時用預裝有 2 mL 肝素的 50 mL 注射器抽取約 10 mL 骨髓，2 h 內對骨髓進行離心。
采用密度梯度離心聯合貼壁法進行 BMSCs 的分離、培養和純化。將細胞重懸于含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液，按 1.0×105個/mL 密度接種于 25 mL 培養瓶，置 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養；48 h 后更換培養液，棄非貼壁細胞，以后 3～4 d 換液 1 次；待貼壁細胞達 80%～90% 融合后，用 0.25% 胰蛋白酶–0.02%EDTA 消化；10%FBS 培養基中止消化，離心（1 000 r/min 離心 10 min）去除上清，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液懸浮，反復吹打后計數，以 1×104個/mL 密度傳代接種于 25 mL 培養瓶，連續傳代培養。經流式細胞術檢測細胞表面抗原，證實培養細胞為 BMSCs。
1.3 實驗分組
取第 3 代 BMSCs 分為 5 組：A 組，單純 BMSCs 組（1×105個/mL）；B 組，BMSCs（1×105個/mL）+10 μmol/L 地塞米松；C 組，BMSCs（1×105個/mL）+10 μmol/L 地塞米松+5 μmol/L GSH；D 組，BMSCs（1×105個/mL）+10 μmol/L 地塞米松+10 μmol/L GSH；E 組，BMSCs（1×105個/mL）+10 μmol/L 地塞米松+50 μmol/L GSH。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞內活性氧水平檢測
培養 7 d，將待測細胞從培養瓶內消化、反復吹打、混勻，配成細胞懸液；細胞重懸于稀釋的二氯熒光黃雙乙酸鹽，調整細胞密度為 2.0×106～2.0×107個/mL。于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內孵育 20 min，每 5 分鐘顛倒 1 次，使探針和細胞充分接觸。利用流式細胞儀于發射波長 525 nm、激發波長 488 nm 條件下檢測綠色熒光強度，根據陽性對照 Rosup 的熒光信號，檢測出細胞內活性氧水平。
1.4.2 油紅 O 染色觀察
培養 21 d 取各組細胞，PBS 漂洗 3 次，加入 4% 多聚甲醛 2 mL 固定 30 min，加入預先配制好的油紅 O 染液，靜置染色 10 min，干燥，封片，倒置相差顯微鏡下觀察細胞染色情況。于每孔加入 1 mL 異丙醇，利用異丙醇對著色油紅 O 的激發作用，采用分光光度計在 490 nm 波長下檢測每組吸光度（A）值。
1.4.3 RT-PCR 及實時熒光定量 PCR 檢測
培養 7 d 取各組細胞，采用 RT-PCR 檢測細胞內超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase）mRNA 表達水平。另外取各組細胞，用 Trizol 法提取 RNA，采用分光光度計檢測 RNA 濃度，參照試劑盒設置反轉錄體系和定量 PCR 體系。參照 GeneBank 中基因 mRNA 序列的有效編碼序列，通過 Primer Premier 5.0 軟件設計引物。引物由美國 Invitrogen 公司上海分公司合成，引物序列見表 1。PCR 反應條件：94℃、2 min，94℃、30 s，退火溫度 55℃、30 s，72℃、1 min，45 個循環。以 β-actin 為內參，計算各目的基因相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 基因引物序列
Table1.
Primer sequences in real-time fluorescence quantitative PCR
1.4.4 Western blot 檢測
培養 21 d 收集各組細胞，加入蛋白裂解液，充分混勻，分離總蛋白。利用分光光度計檢測提取蛋白的濃度，用 Loading Buffer 調整蛋白濃度，并標記備用，上樣電泳；電泳結束后，取出薄膜和凝膠；1% 脫脂奶粉封閉 1 h，預先將一抗（兔抗人 Runx2 多克隆抗體、兔抗人 PPAR-γ 多克隆抗體兔抗人 C/EBP 多克隆抗體、兔抗人 ALP 多克隆抗體）稀釋為 1∶1 000，滴加至聚偏氟乙烯膜上，4℃ 冰箱內孵育過夜，加入二抗（羊抗兔二抗 IgG，1∶2 000），孵育 30 min。將顯色液 ECL 滴加至聚偏氟乙烯膜上，3～5 min 后在凝膠顯像儀上觀察、拍照，分析各組條帶亮度值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞內活性氧水平檢測
培養 7 d，B 組細胞內活性氧水平顯著高于其余各組，C 組高于 A、D、E 組，D、E 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
2.2 油紅 O 染色觀察
培養 21 d 倒置相差顯微鏡觀察示，B 組油紅 O 染色陽性細胞明顯多于其余各組，C、D、E、A 組依次減少。各組 A 值比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
2.3 RT-PCR 檢測及實時熒光定量 PCR 檢測
培養 7 d RT-PCR 檢測示，B 組 SOD 和 Catalase mRNA 相對表達量較其余各組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；C 組較 B 組有所提高，但仍顯著低于 A、D、E 組，D、E 組低于 A 組（P<0.05）； D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
實時熒光定量 PCR 檢測示，B 組成脂轉錄因子 PPAR-γ 和 C/EBP mRNA 相對表達量較其余各組顯著提高，差異有統計學意義（P<0.05）。C 組較 B 組有所下降，但仍顯著高于 A、D、E 組，D、E 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。B 組成骨轉錄因子 Runx2 和 ALP mRNA 相對表達量較其余各組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。C 組較 B 組有所提高，但仍顯著低于 A、D、E 組，D、E 組低于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
2.4 Western blot 檢測
培養 21 d，B 組成脂轉錄因子 PPAR-γ 和 C/EBP 蛋白相對表達量較其余各組顯著提高，差異有統計學意義（P<0.05）；C、D、E、A 組呈逐漸下降趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。B 組成骨轉錄因子 Runx2 和 ALP 蛋白相對表達量較其余各組顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）；C、D、E、A 組呈逐漸上升趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
圖1
培養 7 d 各組細胞內活性氧水平比較
Figure1.
Comparison of intracellular reactive oxygen species level between groups after cultured for 7 days
圖2
培養 21 d 各組油紅 O 染色觀察
a～e. 分別為 A、B、C、D、E 組倒置相差顯微鏡下觀察（×100）；f. 各組 A 值比較
Figure2. Oil red O staining of each group after cultured for 21 daysa-e. Inverted phase contrast microscope observation of groups A, B, C, and D respectively (×100); f. Comparison of A value of each group
圖3
培養 7 d RT-PCR 檢測各組 SOD 和 Catalase mRNA 相對表達量
a. SOD；b. Catalase
Figure3. Relative expressions of SOD and Catalase mRNA detected by RT-PCR after cultured for 7 daysa. SOD; b. Catalase
圖4
培養 7 d 實時熒光定量 PCR 檢測各組成脂和成骨轉錄因子 mRNA 相對表達量
a. PPAR-γ；b. C/EBP；c. Runx2；d. ALP
Figure4. Relative expressions of adipogenic and osteogenic transcription factors mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCRa. PPAR-γ; b. C/EBP; c. Runx2; d. ALP
圖5
培養 21 d Western blot 檢測各組各蛋白表達電泳圖
1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 5：E 組
Figure5. Electrophoretic diagram of protein expressions of each group detected by Western blot after cultured for 21 days1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E
圖6
培養 21 d Western blot 檢測各組各蛋白相對表達量
a. PPAR-γ；b. C/EBP；c. Runx2；d. ALP
Figure6. Relative protein expressions of each group detected by Western blot after cultured for 21 daysa. PPAR-γ; b. C/EBP; c. Runx2; d. ALP
3 討論
本研究中，我們探索了抗氧化劑 GSH 對激素誘導的人 BMSCs 成脂、成骨分化的作用。在各組細胞培養 7 d 后，我們采用流式細胞儀檢測各組細胞內活性氧水平，同時采用實時熒光定量 PCR 技術檢測成脂和成骨特異性基因的表達水平。在細胞培養 21 d 對各組細胞進行油紅 O 染色，檢測成脂分化程度，同時利用 Western blot 技術檢測相關基因蛋白表達水平，實驗結果表明，一定濃度的激素可誘導 BMSCs 向脂肪細胞分化，在分化過程中活性氧起到促進成脂分化和抑制成骨分化的作用；外源性加入抗氧化物質，可以拮抗細胞內活性氧水平的增加，逆轉了由激素誘導的抗氧化物酶 Catalase 和 SOD 的降低，恢復了細胞內正常氧化水平，改善了激素誘導的 BMSCs 成脂、成骨分化水平的改變。
BMSCs 來源于正常人的骨髓組織，是一類具有自我增殖和多向分化潛能的成體干細胞，在體外特定條件下可分化為多種中胚層細胞，包括成骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經細胞和上皮細胞[5]等。前期實驗檢測了所培養細胞的表面抗原和多向分化潛能，結果證實我們采用的 BMSCs 純度較高，均一性較好。
GSH 是細胞內一種含有巰基的抗氧化劑，通過直接或間接參與抗氧化酶的酶促反應，起到抗氧化/抗凋亡作用[9]，因此，GSH 對維持細胞內穩定的活性氧水平起到重要作用，防止 DNA 損傷，延緩細胞衰老[10]。另外，GSH 還可與親電子化合物結合從而發揮解毒抗氧化的作用。GSH 代謝產物中包含甘氨酸，甘氨酸可以起到穩定細胞膜的作用，因此外源的 GSH 可以抵抗細胞內異常增加的活性氧水平，還可以維持生物細胞膜的完整性，穩定細胞膜蛋白，減輕細胞損傷，促進修復[11]。Huang 等[12]研究通過楊梅苷干預 MC3T3 細胞系和 MSCs 增強 GSH 的活性，降低細胞內活性氧水平，可用于治療骨代謝相關疾病。可見，GSH 在治療骨相關疾病方面發揮著重要作用。
相關研究報道，激素可降低成骨細胞中Ⅰ型膠原和骨鈣素基因的水平，誘導成骨細胞和骨細胞凋亡[13-14]。本研究結果表明，激素可以下調 Runx2 和 ALP 表達水平，同時上調 PPAR-γ 和 C/EBP 的表達。激素通過上調成脂轉錄因子促進 BMSCs 向脂肪細胞分化，下調成骨轉錄因子抑制其向成骨細胞分化，最終導致成骨、成脂分化失衡和骨丟失。因此，如果有一種藥物能夠促進骨的新生，同時抑制由激素誘導的成脂分化，或許能為由激素治療帶來的不良反應（如股骨頭壞死）起到預防和控制作用。
Mody 等[15]研究發現，包括過氧化氫在內的諸多氧化劑可以明顯抑制 MC3T-1 細胞系和骨髓間質細胞系 M2-10B4 成骨分化，而且抗氧化物質能逆轉這種改變。Barbagallo 等[16]研究報道血紅素氧合酶作為一種抗氧化物質，可明顯促進人成骨干細胞的成骨分化。Cremers 等[17]研究發現，血紅素氧合酶通過產生細胞保護分子（如鐵/鐵蛋白）降低細胞內氧化應激水平和炎性反應程度，減少脂肪來源 MSCs 的凋亡，同時也發現 N-乙酰半胱氨酸和 GSH 也有類似血紅素氧合酶的作用。迄今為止，諸多學者通過向動物體內注入激素成功建立了激素型股骨頭壞死動物模型，說明激素可誘導股骨頭壞死形成。其中一個兔模型研究報道維生素 E 可對激素型股骨頭壞死起到預防作用，這也說明了抗氧化物在預防股骨頭壞死方面的重要作用[18]。本研究以激素作用下對 BMSCs 進行細胞培養，模擬激素性股骨頭壞死細胞模型，選取氧化劑 GSH 進行干預，通過降低 BMSCs 內 ROS 的水平，從而逆轉成骨、成脂分化程度，改善分化平衡。本實驗中 GSH 設置了 5、10、50 μmol/L 3 個濃度組進行干預實驗，結果發現在細胞培養 21 d，成脂分化水平均明顯下降，且隨著濃度增高，BMSCs 成脂分化水平逐漸下降，呈濃度依賴關系。本實驗中，50 μmol/L GSH 效果最好。因此在一定濃度范圍內，GSH 的濃度越高，對降低細胞內 ROS 的作用越強，降低成脂分化的效果越明顯。
綜上述，激素誘導 BMSCs 成脂分化增強、成骨分化減弱，是激素性股骨頭壞死發病機制中的一個重要方面。我們首次提出 GSH 可作為抗氧化劑，通過抵抗 MSCs 內活性氧的水平治療激素性股骨頭壞死，而且在一定范圍內，濃度越高，效果越明顯。GSH 或其他抗氧化物可能成為有效預防或早期治療激素性股骨頭壞死的藥物，為治療股骨頭壞死提供了一個理論依據。但本實驗仍存在一些不足，比如 GSH 對人 BMSCs 功能的影響是在體外實驗條件下完成的，缺乏體內實驗證據，我們后續實驗將進一步研究 GSH 在動物體內的作用。
臨床上糖皮質激素常用以治療各種疾病，比如器官移植后的抗免疫排斥治療、系統性紅斑狼瘡、風濕性疾病、哮喘等。然而大量使用激素的一個重要不良反應是導致股骨頭壞死，故激素性股骨頭壞死成為非創傷性股骨頭壞死的重要類型。激素性股骨頭壞死的發病機制尚不明確[1]，一般認為與骨細胞代謝平衡紊亂和凋亡密切相關[2]。近年來，諸多學者研究認為，激素誘導的 BMSCs 成骨、成脂分化異常，在股骨頭壞死發病過程中起著重要作用[3-4]。我們前期研究也發現，激素性股骨頭壞死來源的 BMSCs 成骨分化能力減弱，成脂分化能力增強，且激素可誘導細胞內活性氧水平升高[5]。研究表明[6]，使用激素后，機體的骨組織受到活性氧帶來的氧化損傷，接受激素干預的小鼠體內可檢測到 DNA 的氧化損傷。外源性氧化物可通過增強細胞內活性氧的水平誘導小鼠發生股骨頭壞死[7]。這些研究表明氧化應激在股骨頭壞死中起一定作用。
谷光甘肽（glutathione，GSH）是細胞內含有巰基的抗氧化劑，通過直接參與抗氧化酶的酶促反應，起到抗氧化、抗凋亡作用[8]。本實驗選取人 BMSCs 為研究對象，在 BMSCs 體外培養過程中加入激素建立激素性股骨頭壞死模型，采用不同濃度的 GSH 進行干預，檢測細胞內活性氧水平的改變，同時檢測 BMSCs 成骨分化相關基因和成脂分化相關基因的表達水平，探索細胞內活性氧水平對 BMSCs 成骨、成脂分化的影響，以及能否通過 GSH 降低細胞內活性氧的水平逆轉分化的失衡，從而為治療激素性股骨頭壞死提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
人單核細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；兔抗人 Runx2 多克隆抗體、兔抗人過氧化物酶體增殖激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ，PPAR-γ）多克隆抗體、兔抗人 CCAAT 增強結合蛋白（CCAAT/enhancer-binding family of proteins，C/EBP）多克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；羊抗兔二抗 IgG（武漢博士德生物科技有限公司）；RT-PCR 試劑盒（Takara 公司，日本）。
流式細胞儀（BD 公司，美國）；分光光度計（Millipore 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；凝膠顯像儀（北京六一儀器廠）。
1.2 標本獲取及 BMSCs 分離培養
納入標準：① 股骨頸骨折患者，均為頭下型且 Garden Ⅳ型；② 年齡>65 歲；③ 需行髖關節置換手術。排除標準：① 長期吸煙；② 長期飲酒；③ 長期服用激素；④ 患有強直性脊柱炎或類風濕性疾病；⑤ 有腦卒中病史。經河南省人民醫院倫理委員會批準和患者及家屬書面同意，選取符合標準的 3 例股骨頸骨折患者，于髖關節置換術中，股骨擴髓時用預裝有 2 mL 肝素的 50 mL 注射器抽取約 10 mL 骨髓，2 h 內對骨髓進行離心。
采用密度梯度離心聯合貼壁法進行 BMSCs 的分離、培養和純化。將細胞重懸于含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液，按 1.0×105個/mL 密度接種于 25 mL 培養瓶，置 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養；48 h 后更換培養液，棄非貼壁細胞，以后 3～4 d 換液 1 次；待貼壁細胞達 80%～90% 融合后，用 0.25% 胰蛋白酶–0.02%EDTA 消化；10%FBS 培養基中止消化，離心（1 000 r/min 離心 10 min）去除上清，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 培養液懸浮，反復吹打后計數，以 1×104個/mL 密度傳代接種于 25 mL 培養瓶，連續傳代培養。經流式細胞術檢測細胞表面抗原，證實培養細胞為 BMSCs。
1.3 實驗分組
取第 3 代 BMSCs 分為 5 組：A 組，單純 BMSCs 組（1×105個/mL）；B 組，BMSCs（1×105個/mL）+10 μmol/L 地塞米松；C 組，BMSCs（1×105個/mL）+10 μmol/L 地塞米松+5 μmol/L GSH；D 組，BMSCs（1×105個/mL）+10 μmol/L 地塞米松+10 μmol/L GSH；E 組，BMSCs（1×105個/mL）+10 μmol/L 地塞米松+50 μmol/L GSH。
1.4 觀測指標
1.4.1 細胞內活性氧水平檢測
培養 7 d，將待測細胞從培養瓶內消化、反復吹打、混勻，配成細胞懸液；細胞重懸于稀釋的二氯熒光黃雙乙酸鹽，調整細胞密度為 2.0×106～2.0×107個/mL。于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱內孵育 20 min，每 5 分鐘顛倒 1 次，使探針和細胞充分接觸。利用流式細胞儀于發射波長 525 nm、激發波長 488 nm 條件下檢測綠色熒光強度，根據陽性對照 Rosup 的熒光信號，檢測出細胞內活性氧水平。
1.4.2 油紅 O 染色觀察
培養 21 d 取各組細胞，PBS 漂洗 3 次，加入 4% 多聚甲醛 2 mL 固定 30 min，加入預先配制好的油紅 O 染液，靜置染色 10 min，干燥，封片，倒置相差顯微鏡下觀察細胞染色情況。于每孔加入 1 mL 異丙醇，利用異丙醇對著色油紅 O 的激發作用，采用分光光度計在 490 nm 波長下檢測每組吸光度（A）值。
1.4.3 RT-PCR 及實時熒光定量 PCR 檢測
培養 7 d 取各組細胞，采用 RT-PCR 檢測細胞內超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase）mRNA 表達水平。另外取各組細胞，用 Trizol 法提取 RNA，采用分光光度計檢測 RNA 濃度，參照試劑盒設置反轉錄體系和定量 PCR 體系。參照 GeneBank 中基因 mRNA 序列的有效編碼序列，通過 Primer Premier 5.0 軟件設計引物。引物由美國 Invitrogen 公司上海分公司合成，引物序列見表 1。PCR 反應條件：94℃、2 min，94℃、30 s，退火溫度 55℃、30 s，72℃、1 min，45 個循環。以 β-actin 為內參，計算各目的基因相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 基因引物序列
Table1.
Primer sequences in real-time fluorescence quantitative PCR
1.4.4 Western blot 檢測
培養 21 d 收集各組細胞，加入蛋白裂解液，充分混勻，分離總蛋白。利用分光光度計檢測提取蛋白的濃度，用 Loading Buffer 調整蛋白濃度，并標記備用，上樣電泳；電泳結束后，取出薄膜和凝膠；1% 脫脂奶粉封閉 1 h，預先將一抗（兔抗人 Runx2 多克隆抗體、兔抗人 PPAR-γ 多克隆抗體兔抗人 C/EBP 多克隆抗體、兔抗人 ALP 多克隆抗體）稀釋為 1∶1 000，滴加至聚偏氟乙烯膜上，4℃ 冰箱內孵育過夜，加入二抗（羊抗兔二抗 IgG，1∶2 000），孵育 30 min。將顯色液 ECL 滴加至聚偏氟乙烯膜上，3～5 min 后在凝膠顯像儀上觀察、拍照，分析各組條帶亮度值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 細胞內活性氧水平檢測
培養 7 d，B 組細胞內活性氧水平顯著高于其余各組，C 組高于 A、D、E 組，D、E 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
2.2 油紅 O 染色觀察
培養 21 d 倒置相差顯微鏡觀察示，B 組油紅 O 染色陽性細胞明顯多于其余各組，C、D、E、A 組依次減少。各組 A 值比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
2.3 RT-PCR 檢測及實時熒光定量 PCR 檢測
培養 7 d RT-PCR 檢測示，B 組 SOD 和 Catalase mRNA 相對表達量較其余各組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；C 組較 B 組有所提高，但仍顯著低于 A、D、E 組，D、E 組低于 A 組（P<0.05）； D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
實時熒光定量 PCR 檢測示，B 組成脂轉錄因子 PPAR-γ 和 C/EBP mRNA 相對表達量較其余各組顯著提高，差異有統計學意義（P<0.05）。C 組較 B 組有所下降，但仍顯著高于 A、D、E 組，D、E 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。B 組成骨轉錄因子 Runx2 和 ALP mRNA 相對表達量較其余各組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。C 組較 B 組有所提高，但仍顯著低于 A、D、E 組，D、E 組低于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
2.4 Western blot 檢測
培養 21 d，B 組成脂轉錄因子 PPAR-γ 和 C/EBP 蛋白相對表達量較其余各組顯著提高，差異有統計學意義（P<0.05）；C、D、E、A 組呈逐漸下降趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。B 組成骨轉錄因子 Runx2 和 ALP 蛋白相對表達量較其余各組顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）；C、D、E、A 組呈逐漸上升趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
圖1
培養 7 d 各組細胞內活性氧水平比較
Figure1.
Comparison of intracellular reactive oxygen species level between groups after cultured for 7 days
圖2
培養 21 d 各組油紅 O 染色觀察
a～e. 分別為 A、B、C、D、E 組倒置相差顯微鏡下觀察（×100）；f. 各組 A 值比較
Figure2. Oil red O staining of each group after cultured for 21 daysa-e. Inverted phase contrast microscope observation of groups A, B, C, and D respectively (×100); f. Comparison of A value of each group
圖3
培養 7 d RT-PCR 檢測各組 SOD 和 Catalase mRNA 相對表達量
a. SOD；b. Catalase
Figure3. Relative expressions of SOD and Catalase mRNA detected by RT-PCR after cultured for 7 daysa. SOD; b. Catalase
圖4
培養 7 d 實時熒光定量 PCR 檢測各組成脂和成骨轉錄因子 mRNA 相對表達量
a. PPAR-γ；b. C/EBP；c. Runx2；d. ALP
Figure4. Relative expressions of adipogenic and osteogenic transcription factors mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCRa. PPAR-γ; b. C/EBP; c. Runx2; d. ALP
圖5
培養 21 d Western blot 檢測各組各蛋白表達電泳圖
1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 5：E 組
Figure5. Electrophoretic diagram of protein expressions of each group detected by Western blot after cultured for 21 days1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E
圖6
培養 21 d Western blot 檢測各組各蛋白相對表達量
a. PPAR-γ；b. C/EBP；c. Runx2；d. ALP
Figure6. Relative protein expressions of each group detected by Western blot after cultured for 21 daysa. PPAR-γ; b. C/EBP; c. Runx2; d. ALP
3 討論
本研究中，我們探索了抗氧化劑 GSH 對激素誘導的人 BMSCs 成脂、成骨分化的作用。在各組細胞培養 7 d 后，我們采用流式細胞儀檢測各組細胞內活性氧水平，同時采用實時熒光定量 PCR 技術檢測成脂和成骨特異性基因的表達水平。在細胞培養 21 d 對各組細胞進行油紅 O 染色，檢測成脂分化程度，同時利用 Western blot 技術檢測相關基因蛋白表達水平，實驗結果表明，一定濃度的激素可誘導 BMSCs 向脂肪細胞分化，在分化過程中活性氧起到促進成脂分化和抑制成骨分化的作用；外源性加入抗氧化物質，可以拮抗細胞內活性氧水平的增加，逆轉了由激素誘導的抗氧化物酶 Catalase 和 SOD 的降低，恢復了細胞內正常氧化水平，改善了激素誘導的 BMSCs 成脂、成骨分化水平的改變。
BMSCs 來源于正常人的骨髓組織，是一類具有自我增殖和多向分化潛能的成體干細胞，在體外特定條件下可分化為多種中胚層細胞，包括成骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經細胞和上皮細胞[5]等。前期實驗檢測了所培養細胞的表面抗原和多向分化潛能，結果證實我們采用的 BMSCs 純度較高，均一性較好。
GSH 是細胞內一種含有巰基的抗氧化劑，通過直接或間接參與抗氧化酶的酶促反應，起到抗氧化/抗凋亡作用[9]，因此，GSH 對維持細胞內穩定的活性氧水平起到重要作用，防止 DNA 損傷，延緩細胞衰老[10]。另外，GSH 還可與親電子化合物結合從而發揮解毒抗氧化的作用。GSH 代謝產物中包含甘氨酸，甘氨酸可以起到穩定細胞膜的作用，因此外源的 GSH 可以抵抗細胞內異常增加的活性氧水平，還可以維持生物細胞膜的完整性，穩定細胞膜蛋白，減輕細胞損傷，促進修復[11]。Huang 等[12]研究通過楊梅苷干預 MC3T3 細胞系和 MSCs 增強 GSH 的活性，降低細胞內活性氧水平，可用于治療骨代謝相關疾病。可見，GSH 在治療骨相關疾病方面發揮著重要作用。
相關研究報道，激素可降低成骨細胞中Ⅰ型膠原和骨鈣素基因的水平，誘導成骨細胞和骨細胞凋亡[13-14]。本研究結果表明，激素可以下調 Runx2 和 ALP 表達水平，同時上調 PPAR-γ 和 C/EBP 的表達。激素通過上調成脂轉錄因子促進 BMSCs 向脂肪細胞分化，下調成骨轉錄因子抑制其向成骨細胞分化，最終導致成骨、成脂分化失衡和骨丟失。因此，如果有一種藥物能夠促進骨的新生，同時抑制由激素誘導的成脂分化，或許能為由激素治療帶來的不良反應（如股骨頭壞死）起到預防和控制作用。
Mody 等[15]研究發現，包括過氧化氫在內的諸多氧化劑可以明顯抑制 MC3T-1 細胞系和骨髓間質細胞系 M2-10B4 成骨分化，而且抗氧化物質能逆轉這種改變。Barbagallo 等[16]研究報道血紅素氧合酶作為一種抗氧化物質，可明顯促進人成骨干細胞的成骨分化。Cremers 等[17]研究發現，血紅素氧合酶通過產生細胞保護分子（如鐵/鐵蛋白）降低細胞內氧化應激水平和炎性反應程度，減少脂肪來源 MSCs 的凋亡，同時也發現 N-乙酰半胱氨酸和 GSH 也有類似血紅素氧合酶的作用。迄今為止，諸多學者通過向動物體內注入激素成功建立了激素型股骨頭壞死動物模型，說明激素可誘導股骨頭壞死形成。其中一個兔模型研究報道維生素 E 可對激素型股骨頭壞死起到預防作用，這也說明了抗氧化物在預防股骨頭壞死方面的重要作用[18]。本研究以激素作用下對 BMSCs 進行細胞培養，模擬激素性股骨頭壞死細胞模型，選取氧化劑 GSH 進行干預，通過降低 BMSCs 內 ROS 的水平，從而逆轉成骨、成脂分化程度，改善分化平衡。本實驗中 GSH 設置了 5、10、50 μmol/L 3 個濃度組進行干預實驗，結果發現在細胞培養 21 d，成脂分化水平均明顯下降，且隨著濃度增高，BMSCs 成脂分化水平逐漸下降，呈濃度依賴關系。本實驗中，50 μmol/L GSH 效果最好。因此在一定濃度范圍內，GSH 的濃度越高，對降低細胞內 ROS 的作用越強，降低成脂分化的效果越明顯。
綜上述，激素誘導 BMSCs 成脂分化增強、成骨分化減弱，是激素性股骨頭壞死發病機制中的一個重要方面。我們首次提出 GSH 可作為抗氧化劑，通過抵抗 MSCs 內活性氧的水平治療激素性股骨頭壞死，而且在一定范圍內，濃度越高，效果越明顯。GSH 或其他抗氧化物可能成為有效預防或早期治療激素性股骨頭壞死的藥物，為治療股骨頭壞死提供了一個理論依據。但本實驗仍存在一些不足，比如 GSH 對人 BMSCs 功能的影響是在體外實驗條件下完成的，缺乏體內實驗證據，我們后續實驗將進一步研究 GSH 在動物體內的作用。
