引用本文： 肖飛, 焦競, 黃玉成, 徐海軍, 左偉, 王俊文. CD44 分子巖藻糖基化修飾對兔 BMSCs 流體黏附力的影響. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(1): 99-103. doi: 10.7507/1002-1892.201704012 復制
MSCs 是一種具有多向分化潛能的干細胞，可來源于骨髓、臍帶血、臍靜脈內皮下層、外周血等各種組織中，在特定的刺激作用下可以向成骨細胞、軟骨細胞等中胚層細胞轉化[1-2]。由于此類細胞具有易于獲取、擴增表型穩定且免疫原性較低等特點，成為組織工程及干細胞相關研究的主要種子細胞[3]。現已證實 BMSCs 可作為支架載體材料或復合生物材料，應用于動物骨缺損模型的治療中[4-5]；但在臨床中應用的效果并不理想，這主要是由于其在體內定向歸巢能力較差以及體內誘導分化為成骨細胞能力較弱所致[6]。針對 BMSCs 在體內定向歸巢能力較差的問題，本研究初步設想通過 BMSCs 表面 CD44 分子巖藻糖基化修飾，增強 E-選擇素與其配體 P-選擇素糖蛋白配體 1 的相互作用，提高 BMSCs 在血管內高血流剪切力下的滾動能力，并增強其自身對血管壁的黏附力作用，最終使 BMSCs 能夠有效地結合到血管內皮細胞表面，進一步遷移到受損組織，為臨床上提高 BMSCs 治療骨缺損的療效提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 月齡新西蘭兔 6 只，雌雄不限，體質量 1.5～2.0 kg，購于長沙天勤生物技術有限公司，相同條件下分籠飼養。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部 2006 年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。
人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vascular endothelial cells，HUVEC）由本課題組原代分離而成。GDP-巖藻酸（Santa Cruz 公司，美國）；α-1，3-巖藻糖轉移酶Ⅵ（α-1，3-fucosyltransferase Ⅵ，FTⅥ）、E 選擇素/人 IgG 嵌合體抗體（R&D 公司，美國）；CD44 抗體、CD34 抗體、CD29 抗體、CD105 抗體、小鼠抗人 CD15s 抗體（BD 公司，美國）；山羊抗小鼠 IgM-FITC 二抗、山羊抗人 IgG-FITC 二抗（Abcam 公司，美國）。FACS Calibur 流式細胞儀（BD 公司，美國）；平行平板流動腔（Glycotech 公司，美國）；BM2100 生物顯微鏡（南京麥迪森儀器有限公司）。
1.2 兔 BMSCs 原代分離、培養及鑒定
1.2.1 兔 BMSCs 原代分離、培養
取實驗動物，以 3% 戊巴比妥鈉（35 mg/kg）經耳緣靜脈注射麻醉；使用骨穿針鉆入兔股骨骨髓腔，15 mL 含肝素鈉（1 200 U/mL）的生理鹽水注入骨髓腔，經 200 目濾網過濾沖出物，以半徑 5 cm、1 200 r/min 離心 10 min，棄上清，用無血清 DMEM 培養基重懸細胞，按 1∶2 比例加入 Percoll 分離液，以半徑 5 cm、1 200 r/min 離心 15 min，吸取含單個核細胞的乳白色界面層至另一離心管中，PBS 洗滌 1 次后，用 5 mL 含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的 DMEM 培養基重懸并轉移至 25 cm2培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。48 h 后首次換液，待細胞生長至 90% 融合時進行傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.2.2 流式細胞儀鑒定
取生長狀態較好的第 3 代細胞，棄培養基使用 0.2% 胰蛋白酶消化 1 min，收集于 15 mL 離心管中，以半徑 5 cm、1 200 r/min 離心 5 min；PBS 洗滌 1 次后，細胞計數分管，各管中分別加入單克隆抗體 CD44、CD34、CD29、CD105，同時每管設置陰性對照，避光孵育 40 min。PBS 洗滌 2 次后，500 μL PBS 重懸，流式細胞儀上機檢測。
1.3 兔 BMSCs 的巖藻糖基化處理及相關檢測
1.3.1 兔 BMSCs 的巖藻糖基化處理
收集生長狀態良好的第 3 代兔 BMSCs，用 Hank 平衡鹽溶液（Hank balanced salt solution，HBSS）清洗 2 次，加入提前配置好的 FTⅥ反應體系[將終濃度 60 mU/mL的 FTⅥ溶于 5 mL 含 20 mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（hydroxyethyl piperazine ethyl sulfonic acid，HEPES）、1% 人血清白蛋白（human serum albumin，HAS）及 1 mmol/L GDP-巖藻酸的 HBSS]，37℃、5%CO2 孵育 40 min。以半徑 5 cm、1 200 r/min 離心 5 min；棄上清，用 HBSS 清洗 1 次，重懸細胞于含 2%FBS 的 PBS 中備用。
1.3.2 流式細胞儀檢測唾液酸化 LewisX（sialyl-LewisX，sLeX）陽性率和 E-選擇素結合率
將巖藻糖基化修飾的兔 BMSCs 用 PBS 清洗后制成單細胞懸液，作為實驗組；同時設置未經巖藻糖基化修飾的兔 BMSCs 作為對照組。于兩組細胞中加入小鼠抗人 CD15s 抗體或 E-選擇素/人 IgG 嵌合體抗體，室溫避光孵育 3 h；PBS 清洗 2 次，加入二抗山羊抗小鼠 IgM-FITC 抗體或山羊抗人 IgG-FITC 抗體，室溫避光孵育 30 min；PBS 清洗 2 次，500 μL PBS 重懸，流式細胞儀上機檢測，CELL Quest 軟件分析，實驗重復 3 次，取均值。
1.3.3 平行板流室黏附試驗檢測兔 BMSCs 流體黏附力
在平行平板流動腔中單層培養 HUVEC，給予 3 ng/mL IL-1β 和 20 ng/mL NF-α 刺激，待細胞匯合后加入用含 10 mmol/L HEPES、2 mmol/L CaCl2 的 HBSS 溶液重懸的巖藻糖基化兔 BMSCs 作為實驗組（A 組），并用未經巖藻糖基化修飾的 BMSCs 作為研究對照組（B 組），添加 EDTA 沖洗的巖藻糖基化修飾 BMSCs 作為陰性對照組（C 組）。將流體剪切力由 0.5 dyne/cm2逐漸提高到 30 dyne/cm2，在 0.5、1、2、5、10、20、30 dyne/cm2時，分別記錄 3 組 HUVEC 表面黏附的 BMSCs 細胞數，實驗重復 3 次，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 t 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡觀察示，原代培養 48 h 換液，可見部分細胞貼壁生長，呈梭形或多邊形；培養至 3 d 時，細胞呈梭形，集落逐漸增大，呈漩渦狀；培養至 9 d 時，細胞逐漸融合成片，形成單層細胞，細胞形態均一呈梭形且生長旺盛。見圖 1。流式細胞儀檢測示，培養的第 3 代兔 BMSCs 表面 CD44（97.09%）、CD29（77.48%）、CD105（58.96%）表達呈陽性，而 CD34（2.92%）呈陰性。見圖 2。
2.2 sLex 陽性率和 E-選擇素結合率檢測
實驗組 sLeX 陽性率為 32.52%±1.76%，顯著高于對照組的 1.48%±0.51%，差異有統計學意義（t=29.277，P=0.000）。見圖 3。實驗組 E-選擇素結合率為 41.05%±1.84%，顯著高于對照組的 4.33%±0.92%，差異有統計學意義（t=35.674，P=0.000）。見圖 4。
2.3 平行板流室黏附試驗檢測兔 BMSCs 流體黏附力
隨著流體剪切力（0.5、1、2、5、10、30 dyne/cm2）的增加，A 組經巖藻糖基化處理的兔 BMSCs 與細胞因子刺激后的 HUVEC 間的黏附力升高后降低，2 dyne/cm2剪切力下達峰值；B、C 組 HUVEC 表面幾乎無 BMSCs 黏附。各剪切力下，A 組 HUVEC 表面黏附的 BMSCs 細胞數均顯著多于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05），B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖1
BMSCs 形態學觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 培養 3 d；b. 培養 9 d
Figure1. Morphological observation of BMSCs (Inverted microscope×100)a. Cultured for 3 days; b. Cultured for 9 days
圖2
第 3 代 BMSCs 流式細胞術鑒定
a. CD34；b. CD44；c. CD29；d. CD105
Figure2. Identification of third generation BMSCs by flow cytometrya. CD34; b. CD44; c. CD29; d. CD105
圖3
兔 BMSCs sLex 陽性率檢測
a. 對照組；b. 實驗組
Figure3. Detection of the sLex positive rate in rabbit BMSCsa. Control group; b. Experimental group
圖4
兔 BMSCs E-選擇素結合率檢測
a. 對照組；b. 實驗組
Figure4. Detection of the E-selectin binding rate in rabbit BMSCsa. Control group; b. Experimental group
圖5
平行板流室黏附試驗檢測各組兔 BMSCs 流體黏附力
Figure5.
The fluid adhesion of rabbit BMSCs in each group detec ted by parallel plate flow chamber system
3 討論
近年來干細胞在骨科疾病方面的應用研究進展一直受到人們關注，其中 BMSCs 移植治療骨科疾病被認為是最具有潛力的治療方法，但其治療效果受到各方面的限制。有研究表明[7-8]，經靜脈、動脈、局部注射途徑給予 BMSCs 治療時，僅有小部分 BMSCs 能成功到達損傷組織，且存活率較低。如何提高 BMSCs 定向歸巢能力一直是國內外學者研究的熱點問題。體外培養的 BMSCs 定向到達受損的骨區域，必須經過兩個階段：第一，BMSCs 必須要克服血管內血流的剪切力，滾動到靶組織血管內皮細胞表面；第二，BMSCs 需要通過一系列黏附分子牢固地結合到內皮細胞表面，進而遷移到受損組織。有研究表明[9]，在血液中 BMSCs 的滾動和黏附能力，取決于 BMSCs 表面歸巢相關因子造血細胞 E 和 L 受體（hematopoietic cell E- and L-selectin ligand，HCELL）與廣泛表達于骨髓微血管內表皮的 E-選擇素之間的耦合作用。
雖然 BMSCs 不表達 E-選擇素配體，但表達 CD44 分子，而 CD44 分子上含有 a-2，3-唾液酸化糖型位點。Sackstein 等[10]研究發現表達于骨髓微血管內表皮上的 E-選擇素能夠識別各種不同配體上的唾液巖藻糖苷決定子。而位于 BMSCs 表面的 HCELL 恰好是一種唾液巖藻糖苷糖型，能夠與 CD44 上 a-2，3-唾液酸化糖型位點結合，最終被 E-選擇素識別，促使 BMSCs 在血液中的滾動和黏附[11-12]。HCELL 在其半乳糖端連接有 α-2，3-唾液酸基團，N-乙酰胺基葡萄糖端連接有 α-1，3-巖藻糖基團，形成一個 sLeX 的結構，這種 sLeX 結構正是與 E-選擇素耦合的分子基礎[13]。CD44 分子與 HCELL 的區別在于其 N-乙酰胺基葡聚糖端缺乏 α-1，3-巖藻糖基團的修飾[14-15]，于是我們設想如果能將 α-1，3-巖藻糖基團連接于 CD44 分子 N-乙酰胺基葡萄糖端，將使 BMSCs 表面具有足夠多類似 HCELL 的分子結構，從而增強 BMSCs 在血液中的滾動和黏附能力。已有研究證實[16]，使用 GDP-巖藻糖作供體，FTⅥ處理 CD34+人臍帶血細胞，能使后者成功獲得與 E-選擇素和 P-選擇素耦合的能力。因此，本研究擬用 GDP-巖藻糖作供體，FTⅥ處理 BMSCs，增強其與 E-選擇素耦合能力，觀察 CD44 分子糖基化修飾后 BMSCs 流體黏附力變化情況。
目前，獲得 BMSCs 的方法主要有全骨髓貼壁培養法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠分選法[17]。本研究以兔 BMSCs 為研究材料，采用密度梯度離心結合貼壁培養的方法體外分離純化獲得兔 BMSCs，傳代至第 3 代時，細胞形態均一呈梭形且生長旺盛。流式細胞術檢測結果顯示，兔 BMSCs 表面 CD44 分子陽性表達率為 97.09%，完全符合巖藻糖基化修飾的需求。羅世君等[18]也采用密度梯度離心法結合貼壁篩選法分離培養兔 BMSCs，流式細胞術檢測兔 BMSCs 表面 CD44 分子陽性表達率也高達 96.8%。本研究使用 GDP-巖藻糖作供體，FTⅥ處理兔 BMSCs，流式細胞數檢測結果顯示，與未經 FTⅥ處理的對照組比較，經 FTⅥ處理的實驗組兔 BMSCs 的 sLeX 陽性率顯著上升（P<0.05），說明巖藻糖基化修飾能夠顯著增強兔 BMSCs sLeX 結構的形成。同時，實驗組 E-選擇素結合率顯著高于對照組（P<0.05），說明 CD44 分子糖基化修飾能夠增強兔 BMSCs 的 E-選擇素結合力。Pachón-Pe?a 等[19]研究也顯示，人脂肪來源間充質干細胞表面 CD44 分子經過 FTⅥ巖藻糖基化修飾后，細胞表面的 sLeX陽性率顯著上升，E-選擇素結合率增強。平行板流室黏附試驗結果顯示，CD44 分子巖藻糖基化修飾可顯著增強兔 BMSCs 在動態環境下與 HUVEC 的黏附作用。Chou 等[20]在缺血性腎損傷的動物模型中證實，CD44 分子巖藻糖基化修飾可提高 MSCs 定向歸巢能力。
綜上述，BMSCs 細胞表面分子 CD44 巖藻糖基化修飾可以使 BMSCs 表面形成大量的 sLeX 結構，增強與 E-選擇素的結合力，從而提高 BMSCs 在血流高剪切力環境下的黏附力，為 BMSCs 定向歸巢提供了有利條件。
MSCs 是一種具有多向分化潛能的干細胞，可來源于骨髓、臍帶血、臍靜脈內皮下層、外周血等各種組織中，在特定的刺激作用下可以向成骨細胞、軟骨細胞等中胚層細胞轉化[1-2]。由于此類細胞具有易于獲取、擴增表型穩定且免疫原性較低等特點，成為組織工程及干細胞相關研究的主要種子細胞[3]。現已證實 BMSCs 可作為支架載體材料或復合生物材料，應用于動物骨缺損模型的治療中[4-5]；但在臨床中應用的效果并不理想，這主要是由于其在體內定向歸巢能力較差以及體內誘導分化為成骨細胞能力較弱所致[6]。針對 BMSCs 在體內定向歸巢能力較差的問題，本研究初步設想通過 BMSCs 表面 CD44 分子巖藻糖基化修飾，增強 E-選擇素與其配體 P-選擇素糖蛋白配體 1 的相互作用，提高 BMSCs 在血管內高血流剪切力下的滾動能力，并增強其自身對血管壁的黏附力作用，最終使 BMSCs 能夠有效地結合到血管內皮細胞表面，進一步遷移到受損組織，為臨床上提高 BMSCs 治療骨缺損的療效提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 月齡新西蘭兔 6 只，雌雄不限，體質量 1.5～2.0 kg，購于長沙天勤生物技術有限公司，相同條件下分籠飼養。實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部 2006 年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。
人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vascular endothelial cells，HUVEC）由本課題組原代分離而成。GDP-巖藻酸（Santa Cruz 公司，美國）；α-1，3-巖藻糖轉移酶Ⅵ（α-1，3-fucosyltransferase Ⅵ，FTⅥ）、E 選擇素/人 IgG 嵌合體抗體（R&D 公司，美國）；CD44 抗體、CD34 抗體、CD29 抗體、CD105 抗體、小鼠抗人 CD15s 抗體（BD 公司，美國）；山羊抗小鼠 IgM-FITC 二抗、山羊抗人 IgG-FITC 二抗（Abcam 公司，美國）。FACS Calibur 流式細胞儀（BD 公司，美國）；平行平板流動腔（Glycotech 公司，美國）；BM2100 生物顯微鏡（南京麥迪森儀器有限公司）。
1.2 兔 BMSCs 原代分離、培養及鑒定
1.2.1 兔 BMSCs 原代分離、培養
取實驗動物，以 3% 戊巴比妥鈉（35 mg/kg）經耳緣靜脈注射麻醉；使用骨穿針鉆入兔股骨骨髓腔，15 mL 含肝素鈉（1 200 U/mL）的生理鹽水注入骨髓腔，經 200 目濾網過濾沖出物，以半徑 5 cm、1 200 r/min 離心 10 min，棄上清，用無血清 DMEM 培養基重懸細胞，按 1∶2 比例加入 Percoll 分離液，以半徑 5 cm、1 200 r/min 離心 15 min，吸取含單個核細胞的乳白色界面層至另一離心管中，PBS 洗滌 1 次后，用 5 mL 含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的 DMEM 培養基重懸并轉移至 25 cm2培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。48 h 后首次換液，待細胞生長至 90% 融合時進行傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.2.2 流式細胞儀鑒定
取生長狀態較好的第 3 代細胞，棄培養基使用 0.2% 胰蛋白酶消化 1 min，收集于 15 mL 離心管中，以半徑 5 cm、1 200 r/min 離心 5 min；PBS 洗滌 1 次后，細胞計數分管，各管中分別加入單克隆抗體 CD44、CD34、CD29、CD105，同時每管設置陰性對照，避光孵育 40 min。PBS 洗滌 2 次后，500 μL PBS 重懸，流式細胞儀上機檢測。
1.3 兔 BMSCs 的巖藻糖基化處理及相關檢測
1.3.1 兔 BMSCs 的巖藻糖基化處理
收集生長狀態良好的第 3 代兔 BMSCs，用 Hank 平衡鹽溶液（Hank balanced salt solution，HBSS）清洗 2 次，加入提前配置好的 FTⅥ反應體系[將終濃度 60 mU/mL的 FTⅥ溶于 5 mL 含 20 mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（hydroxyethyl piperazine ethyl sulfonic acid，HEPES）、1% 人血清白蛋白（human serum albumin，HAS）及 1 mmol/L GDP-巖藻酸的 HBSS]，37℃、5%CO2 孵育 40 min。以半徑 5 cm、1 200 r/min 離心 5 min；棄上清，用 HBSS 清洗 1 次，重懸細胞于含 2%FBS 的 PBS 中備用。
1.3.2 流式細胞儀檢測唾液酸化 LewisX（sialyl-LewisX，sLeX）陽性率和 E-選擇素結合率
將巖藻糖基化修飾的兔 BMSCs 用 PBS 清洗后制成單細胞懸液，作為實驗組；同時設置未經巖藻糖基化修飾的兔 BMSCs 作為對照組。于兩組細胞中加入小鼠抗人 CD15s 抗體或 E-選擇素/人 IgG 嵌合體抗體，室溫避光孵育 3 h；PBS 清洗 2 次，加入二抗山羊抗小鼠 IgM-FITC 抗體或山羊抗人 IgG-FITC 抗體，室溫避光孵育 30 min；PBS 清洗 2 次，500 μL PBS 重懸，流式細胞儀上機檢測，CELL Quest 軟件分析，實驗重復 3 次，取均值。
1.3.3 平行板流室黏附試驗檢測兔 BMSCs 流體黏附力
在平行平板流動腔中單層培養 HUVEC，給予 3 ng/mL IL-1β 和 20 ng/mL NF-α 刺激，待細胞匯合后加入用含 10 mmol/L HEPES、2 mmol/L CaCl2 的 HBSS 溶液重懸的巖藻糖基化兔 BMSCs 作為實驗組（A 組），并用未經巖藻糖基化修飾的 BMSCs 作為研究對照組（B 組），添加 EDTA 沖洗的巖藻糖基化修飾 BMSCs 作為陰性對照組（C 組）。將流體剪切力由 0.5 dyne/cm2逐漸提高到 30 dyne/cm2，在 0.5、1、2、5、10、20、30 dyne/cm2時，分別記錄 3 組 HUVEC 表面黏附的 BMSCs 細胞數，實驗重復 3 次，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 t 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡觀察示，原代培養 48 h 換液，可見部分細胞貼壁生長，呈梭形或多邊形；培養至 3 d 時，細胞呈梭形，集落逐漸增大，呈漩渦狀；培養至 9 d 時，細胞逐漸融合成片，形成單層細胞，細胞形態均一呈梭形且生長旺盛。見圖 1。流式細胞儀檢測示，培養的第 3 代兔 BMSCs 表面 CD44（97.09%）、CD29（77.48%）、CD105（58.96%）表達呈陽性，而 CD34（2.92%）呈陰性。見圖 2。
2.2 sLex 陽性率和 E-選擇素結合率檢測
實驗組 sLeX 陽性率為 32.52%±1.76%，顯著高于對照組的 1.48%±0.51%，差異有統計學意義（t=29.277，P=0.000）。見圖 3。實驗組 E-選擇素結合率為 41.05%±1.84%，顯著高于對照組的 4.33%±0.92%，差異有統計學意義（t=35.674，P=0.000）。見圖 4。
2.3 平行板流室黏附試驗檢測兔 BMSCs 流體黏附力
隨著流體剪切力（0.5、1、2、5、10、30 dyne/cm2）的增加，A 組經巖藻糖基化處理的兔 BMSCs 與細胞因子刺激后的 HUVEC 間的黏附力升高后降低，2 dyne/cm2剪切力下達峰值；B、C 組 HUVEC 表面幾乎無 BMSCs 黏附。各剪切力下，A 組 HUVEC 表面黏附的 BMSCs 細胞數均顯著多于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05），B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖1
BMSCs 形態學觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 培養 3 d；b. 培養 9 d
Figure1. Morphological observation of BMSCs (Inverted microscope×100)a. Cultured for 3 days; b. Cultured for 9 days
圖2
第 3 代 BMSCs 流式細胞術鑒定
a. CD34；b. CD44；c. CD29；d. CD105
Figure2. Identification of third generation BMSCs by flow cytometrya. CD34; b. CD44; c. CD29; d. CD105
圖3
兔 BMSCs sLex 陽性率檢測
a. 對照組；b. 實驗組
Figure3. Detection of the sLex positive rate in rabbit BMSCsa. Control group; b. Experimental group
圖4
兔 BMSCs E-選擇素結合率檢測
a. 對照組；b. 實驗組
Figure4. Detection of the E-selectin binding rate in rabbit BMSCsa. Control group; b. Experimental group
圖5
平行板流室黏附試驗檢測各組兔 BMSCs 流體黏附力
Figure5.
The fluid adhesion of rabbit BMSCs in each group detec ted by parallel plate flow chamber system
3 討論
近年來干細胞在骨科疾病方面的應用研究進展一直受到人們關注，其中 BMSCs 移植治療骨科疾病被認為是最具有潛力的治療方法，但其治療效果受到各方面的限制。有研究表明[7-8]，經靜脈、動脈、局部注射途徑給予 BMSCs 治療時，僅有小部分 BMSCs 能成功到達損傷組織，且存活率較低。如何提高 BMSCs 定向歸巢能力一直是國內外學者研究的熱點問題。體外培養的 BMSCs 定向到達受損的骨區域，必須經過兩個階段：第一，BMSCs 必須要克服血管內血流的剪切力，滾動到靶組織血管內皮細胞表面；第二，BMSCs 需要通過一系列黏附分子牢固地結合到內皮細胞表面，進而遷移到受損組織。有研究表明[9]，在血液中 BMSCs 的滾動和黏附能力，取決于 BMSCs 表面歸巢相關因子造血細胞 E 和 L 受體（hematopoietic cell E- and L-selectin ligand，HCELL）與廣泛表達于骨髓微血管內表皮的 E-選擇素之間的耦合作用。
雖然 BMSCs 不表達 E-選擇素配體，但表達 CD44 分子，而 CD44 分子上含有 a-2，3-唾液酸化糖型位點。Sackstein 等[10]研究發現表達于骨髓微血管內表皮上的 E-選擇素能夠識別各種不同配體上的唾液巖藻糖苷決定子。而位于 BMSCs 表面的 HCELL 恰好是一種唾液巖藻糖苷糖型，能夠與 CD44 上 a-2，3-唾液酸化糖型位點結合，最終被 E-選擇素識別，促使 BMSCs 在血液中的滾動和黏附[11-12]。HCELL 在其半乳糖端連接有 α-2，3-唾液酸基團，N-乙酰胺基葡萄糖端連接有 α-1，3-巖藻糖基團，形成一個 sLeX 的結構，這種 sLeX 結構正是與 E-選擇素耦合的分子基礎[13]。CD44 分子與 HCELL 的區別在于其 N-乙酰胺基葡聚糖端缺乏 α-1，3-巖藻糖基團的修飾[14-15]，于是我們設想如果能將 α-1，3-巖藻糖基團連接于 CD44 分子 N-乙酰胺基葡萄糖端，將使 BMSCs 表面具有足夠多類似 HCELL 的分子結構，從而增強 BMSCs 在血液中的滾動和黏附能力。已有研究證實[16]，使用 GDP-巖藻糖作供體，FTⅥ處理 CD34+人臍帶血細胞，能使后者成功獲得與 E-選擇素和 P-選擇素耦合的能力。因此，本研究擬用 GDP-巖藻糖作供體，FTⅥ處理 BMSCs，增強其與 E-選擇素耦合能力，觀察 CD44 分子糖基化修飾后 BMSCs 流體黏附力變化情況。
目前，獲得 BMSCs 的方法主要有全骨髓貼壁培養法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠分選法[17]。本研究以兔 BMSCs 為研究材料，采用密度梯度離心結合貼壁培養的方法體外分離純化獲得兔 BMSCs，傳代至第 3 代時，細胞形態均一呈梭形且生長旺盛。流式細胞術檢測結果顯示，兔 BMSCs 表面 CD44 分子陽性表達率為 97.09%，完全符合巖藻糖基化修飾的需求。羅世君等[18]也采用密度梯度離心法結合貼壁篩選法分離培養兔 BMSCs，流式細胞術檢測兔 BMSCs 表面 CD44 分子陽性表達率也高達 96.8%。本研究使用 GDP-巖藻糖作供體，FTⅥ處理兔 BMSCs，流式細胞數檢測結果顯示，與未經 FTⅥ處理的對照組比較，經 FTⅥ處理的實驗組兔 BMSCs 的 sLeX 陽性率顯著上升（P<0.05），說明巖藻糖基化修飾能夠顯著增強兔 BMSCs sLeX 結構的形成。同時，實驗組 E-選擇素結合率顯著高于對照組（P<0.05），說明 CD44 分子糖基化修飾能夠增強兔 BMSCs 的 E-選擇素結合力。Pachón-Pe?a 等[19]研究也顯示，人脂肪來源間充質干細胞表面 CD44 分子經過 FTⅥ巖藻糖基化修飾后，細胞表面的 sLeX陽性率顯著上升，E-選擇素結合率增強。平行板流室黏附試驗結果顯示，CD44 分子巖藻糖基化修飾可顯著增強兔 BMSCs 在動態環境下與 HUVEC 的黏附作用。Chou 等[20]在缺血性腎損傷的動物模型中證實，CD44 分子巖藻糖基化修飾可提高 MSCs 定向歸巢能力。
綜上述，BMSCs 細胞表面分子 CD44 巖藻糖基化修飾可以使 BMSCs 表面形成大量的 sLeX 結構，增強與 E-選擇素的結合力，從而提高 BMSCs 在血流高剪切力環境下的黏附力，為 BMSCs 定向歸巢提供了有利條件。
