引用本文： 陳琪, 石芳芳, 楊曦, 劉立岷, 宋躍明. 不同代次髓核細胞生物學特性的比較研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(6): 660-667. doi: 10.7507/1002-1892.201707017 復制
隨著中國步入老齡化社會，腰椎間盤退變逐漸成為影響人類健康及降低生活質量的臨床常見病、多發病[1-3]。因此，對腰椎間盤退變機制的研究，將為防治此類疾病、改善患者生活質量提供巨大幫助。組織病理學觀察已證實在椎間盤退變過程中，髓核組織出現明顯退變，包括髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）形態改變、細胞凋亡增多、合成代謝減少、分解代謝加快等[4-5]。這些散在分布的 NPCs 產生和分泌細胞因子及細胞外基質，對維持椎間盤營養物質擴散、代謝廢物排出等內環境穩定起主要決定作用。因此，髓核組織，尤其是其中的 NPCs，是椎間盤退變病理變化的主要始動因素，對這一機制的研究或許是治療腰椎間盤退變病理變化的關鍵途徑。這些研究的前提是 NPCs 退變模型的建立，而目前對 NPCs 退變模型的研究較少且不成熟。本研究擬通過自然傳代培養法構建 NPCs 退變模型，比較不同代次 NPCs 的生物學特性，為進一步研究腰椎間盤退變機制提供可靠的、符合人體腰椎間盤退變規律的動物細胞模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡新西蘭大白兔 4 只，雌雄不限，體質量 1.5～2.5 kg，由四川大學華西醫院/華西臨床醫學院動物實驗中心提供。
0.25% 胰蛋白酶（Life 公司，美國）；Ⅱ 型膠原酶凍干粉末（Sigma 公司，美國）；FBS（Biological Industries 公司，以色列）；DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；青-鏈霉素雙抗、牛血清白蛋白（GIBCO 公司，美國）；PBS 緩沖液粉末、FITC 標記抗鼠 IgG 二抗、多聚賴氨酸（北京中杉金橋生物工程有限公司）；抗缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）抗體、抗聚集蛋白聚糖（Aggrecan）抗體（Novus 公司，美國）；抗 Ⅱ 型膠原抗體、抗基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）抗體（Abcam 公司，英國）；4% 多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）；膜聯蛋白 Ⅴ（Annexin Ⅴ）-FITC 凋亡檢測試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）。
CO2 培養箱、–150℃ 超低溫細胞庫（SANYO 公司，日本）；Imager.Z2 全自動熒光顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；1X71 生物倒置相差熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；–20℃ 冰箱（青島海爾公司）；–80℃ 冰箱、低溫高速離心機（Thermo Forma 公司，美國）；大容量水平式低溫離心機、高速離心機（Heraeus 公司，德國）；電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫療儀器廠）；80-6418-77 垂直電泳系統、TE22 濕轉系統（Amersham 公司，美國）；流式細胞儀（NAVIOS 公司，美國）；60 mm 細胞培養皿、6 孔細胞培養板、24 孔細胞培養板、離心管（Corning 公司，美國）；0.22 μm 無菌針頭濾器（Millipore 公司，美國）；200 目細胞篩網（上海捷瑞生物工程有限公司）；細胞爬片（NEST 公司，美國）；細胞凍存管（NUNC 公司，丹麥）。
1.2 兔 NPCs 分離培養及鑒定
取 4 只新西蘭大白兔采用空氣栓塞法處死，經后正中入路完整取下胸腰椎節段，含 10% 青-鏈霉素雙抗的 PBS 沖洗液沖洗標本 3 次；60 mm 培養皿中加入 4℃ 預冷的 DMEM/F12 基礎培養基 8 mL 備用。從椎間盤腹側緊貼上或下軟骨終板，沿脊柱軸位切開椎間盤至椎管前緣，可見髓核組織呈膠凍狀位于椎間盤中間；使用無齒鑷完整取出髓核組織，置于 DMEM/F12 基礎培養基中；同法依次切開脊柱節段各椎間盤；將含有髓核組織的培養基轉移入 50 mL 離心管，含 10% 青-鏈霉素雙抗的 PBS 漂洗 2～3 次后，以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min 后吸去上層培養基；加入 0.25% 胰蛋白酶 10 mL，置入 37℃ 恒溫水浴搖床消化 5～10 min；加入 15%FBS 中和胰蛋白酶，以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min 后吸去上層液體，加入 0.2%Ⅱ 型膠原酶溶液 10～15 mL，置入 37℃ 恒溫水浴搖床中，30 min 后吸取離心管中溶液，經 200 目細胞篩網過濾，轉入 15 mL 離心管；若離心管中仍有未完全消化的組織塊，可再次加入 0.2%Ⅱ型膠原酶溶液，重復上述步驟直至組織塊消化完全，行梯度消化；消化后液體以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min，去除上層液體、細胞重懸后，使用 DMEM/F12 基礎培養基漂洗 3 次。原代細胞計數后，按 1×105 個/孔密度接種于 6 孔板，加入 3 mL 含 15%FBS、1% 青-鏈霉素雙抗的 DMEM/F12 細胞培養基，記作 P0 代細胞。將細胞置于 37℃、5%CO2 孵箱培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。采用免疫細胞熒光染色法檢測培養細胞的 HIF-1α、Aggrecan、Ⅱ 型膠原、MMP-2 蛋白表達，驗證 NPCs 表型。
1.3 兔 NPCs 自然退變模型建立
待上述 P0 代 NPCs 生長融合至 95% 以上后，吸去細胞培養基，加入 0.25% 胰蛋白酶消化，倒置相差顯微鏡觀察，待細胞形態變化、部分細胞懸浮后，使用 15%FBS 中止消化。將未完全懸浮的細胞輕微吹打懸浮后轉入 15 mL 離心管，以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min；去除上清液后重懸細胞，按 1×105 個/孔接種于 6 孔板中，加入 3 mL 細胞培養基后分瓶培養，記作 P1 代細胞。將 P1 代細胞放置于 37℃、5%CO2 培養箱培養，每 2～3 天換液；以此順序自然培養、傳代細胞，得到 P2、P3 代細胞。倒置相差顯微鏡下觀察培養過程中細胞形態變化。
1.4 觀測指標
1.4.1 免疫細胞熒光染色檢測
取 4 塊 24 孔板分別用于 P0～P3 代 NPCs，每塊板選 5 個孔，將細胞爬片鋪被于孔底面，每孔加入多聚賴氨酸溶液覆蓋底面，37℃ 過夜；吸去多聚賴氨酸溶液，DMEM/F12 基礎培養基清洗 1 次，將同代 NPCs 按 1×104個/孔密度接種入孔中，加入 1 mL 含 15%FBS 的 DMEM/F12 細胞培養基，置于 37℃、5%CO2 培養箱培養，每 2～3 天換液 1 次；待細胞貼壁，生長融合至 60%～70% 時吸去細胞培養基，PBS 漂洗細胞 3 次；加入 4% 多聚甲醛 4℃ 固定 5～10 min 后，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；加入 10% 牛血清白蛋白常溫封閉蛋白 20 min；棄去牛血清白蛋白后在相應孔內添加配制好的 HIF-1α、Aggrecan、Ⅱ型膠原、MMP-2 一抗溶液，4℃ 過夜；PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，避光加入配制好的 FITC 標記抗鼠 IgG 二抗，37℃ 避光靜置 1 h；PBS 再次避光漂洗 3 次，每次 5 min；甘油封片后熒光顯微鏡下觀察熒光染色情況。
1.4.2 細胞凋亡檢測
采用 Annexin-Ⅴ/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染流式細胞術檢測細胞調亡。取各代 NPCs，用 0.25% 胰蛋白酶消化重懸，15%FBS 中和消化，以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min，去除上清液；4℃ 預冷的 PBS 清洗細胞 2 次后，用 250 μL 結合緩沖液（Annexin Ⅴ-FITC 凋亡檢測試劑盒自帶）重懸細胞，移入流式管；避光依次加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和 10 μL 20 μg/mL PI 溶液，混勻后室溫避光孵育 15 min；上流式細胞儀分析 P0～P3 代細胞凋亡率。
1.4.3 Western blot 檢測
將 6 孔板內培養的 P0～P3 代 NPCs，待其于孔內生長融合至 95% 以上時，使用細胞刮輕柔刮下細胞，移入 15 mL 離心管，以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min 后，PBS 清洗 2～3 次；移入 EP 管內高速離心（4℃、12 000×g 離心 2 min），吸去上清液后將樣品放入–80℃ 冰箱保存備用。將 P0～P3 代細胞樣品冰浴復溫，加入預冷的蛋白裂解液，超聲破碎儀破碎（100～200 W）2 次，每次 3 s；4℃、12 000×g 離心 2 min 提取蛋白；取少量上清行 BCA 蛋白定量后，將所有蛋白樣品調至等濃度；取等量蛋白上樣至 12.6%SDS-PAGE 分離凝膠中進行電泳，分離出相對分子質量不等的蛋白。分別使用抗 HIF-1α、抗 Aggrecan、抗 Ⅱ 型膠原、抗 MMP-2 單克隆抗體（作為一抗）以及對應二抗進行 Western blot 分析；GAPDH 用來確定等量上樣。采用 ECL 發光系統曝光顯影，使用 Image J 軟件分析蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 兔 NPCs 細胞表型鑒定
免疫細胞熒光染色示，P0 代兔 NPCs 均能表達 HIF-1α、MMP-2、Ⅱ 型膠原、Aggrecan 蛋白，其中 HIF-1α、Ⅱ 型膠原主要在細胞核表達，Aggrecan、MMP-2 主要在細胞質中表達。見圖 1。
圖1
P0 代兔 NPCs 免疫細胞熒光染色鑒定（熒光顯微鏡×200）
a. HIF-1α；b. Ⅱ 型膠原；c. Aggrecan；d. MMP-2
Figure1. Immunofluorescence identification of P0 generation rabbit NPCs (Fluorescence microscope×200)a. HIF-1α; b. Collagen type Ⅱ; c. Aggrecan; d. MMP-2
2.2 各代兔 NPCs 形態學變化
P0 代細胞貼壁能力較差，7～10 d 完全貼壁，細胞呈三角形、多角形或紡錘形，偽足較短；部分細胞相互融合成細胞團，并沿細胞團向四周逐漸生長倍增出多邊形的細胞，無明顯偽足；部分細胞出現特征性的空泡結構。細胞生長緩慢，3～4 周后才可傳代。見圖 2a。
圖2
倒置相差顯微鏡觀察各代兔NPCs形態學變化
a. P0 代細胞 從左至右依次為培養 10 d（×40）、10 d（×200）、20 d（×40）、20 d（×200）；b. P1 代細胞 從左至右依次為培養 1 d（×40）、1 d（×200）、5 d（×40）、5 d（×200）；c. P2 代細胞 從左至右依次為培養 3 d（×40）、3 d（×200）、10 d（×40）、10 d（×200）；d. P3 代細胞 從左至右依次為培養 3 d（×40）、3 d（×200）、14 d（×40）、14 d（×200）
Figure2. The morphological changes of each generation rabbit NPCs by inverted phase contrast microscopea. P0 generation NPCs From left to right for 10 days (×40), 10 days (×200), 20 days (×40), and 20 days (×200), respectively; b. P1 generation NPCs From left to right for 1 day (×40), 1 day (×200), 5 days (×40), and 5 days (×200), respectively; c. P2 generation NPCs From left to right for 3 days (×40), 3 days (×200), 10 days (×40), and 10 days (×200), respectively; d. P3 generation NPCs From left to right for 3 days (×40), 3 days (×200), 14 days (×40), and 14 days (×200), respectively
P1 代細胞貼壁及生長倍增能力明顯增強，1 d 后即已完全貼壁，1 周后即可再次傳代；細胞形態多為紡錘形，少部分仍為多角性，含空泡結構的細胞增多。見圖 2b。
P2 代細胞貼壁能力尚可，傳代后 2～3 d 貼壁，生長倍增時間稍延長，1～2 周可再次傳代；細胞形態逐漸以紡錘形或梭形為主，偽足變長，部分細胞含有空泡，較前代減少，出現退變改變。見圖 2c。
P3 代細胞貼壁能力明顯變弱，少部分細胞經過 1 周培養后仍無法貼壁；細胞以梭形或大多角形為主，細胞體積變大，細胞質鋪開，極少見含空泡細胞；細胞生長倍增時間明顯延長，培養 2 周后仍未見明顯生長增殖，細胞出現明顯退變。見圖 2d。
2.3 各代兔 NPCs 免疫細胞熒光染色檢測
隨著培養代數的增加，HIF-1α、Ⅱ 型膠原和 Aggrecan 熒光強度逐漸減小，MMP-2 熒光強度逐漸增加。見圖 3。
圖3
各代兔 NPCs 免疫細胞熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
從左至右依次為 P0、P1、P2、P3 代細胞 a. HIF-1α；b. Ⅱ 型膠原；c. Aggrecan；d. MMP-2
Figure3. Immunofluorescence staining observation of each generation rabbit NPCs (Fluorescence microscope×200)From left to right for P0, P1, P2, and P3 generations NPCs a. HIF-1α; b. Collagen type Ⅱ; c. Aggrecan; d. MMP-2
2.4 各代兔 NPCs 凋亡檢測
P0～P3 代兔 NPCs 細胞凋亡率分別為 5.47%±0.91%、13.77%±2.42%、33.46%±1.82%、38.76%±1.50%，隨著培養代數增加，細胞凋亡率明顯增加，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
流式細胞儀檢測各代兔 NPCs 凋亡情況
a. P0 代；b. P1 代；c. P2 代；d. P3 代
Figure4. Apoptosis detection of each generation rabbit NPCs by flow cytometrya. P0 generation; b. P1 generation; c. P2 generation; d. P3 generation
2.5 Western blot 檢測
HIF-1α 蛋白相對表達量在 P0 代較高，P1 代有升高趨勢，而后逐漸降低，各代次間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。Ⅱ 型膠原蛋白相對表達量從 P0～P3 代逐漸降低，各代次間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。Aggrecan 蛋白相對表達量從 P0～P2 代逐漸降低，P0～P2 代間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；P2 代與 P3 代間比較差異無統計學意義（P>0.05）。MMP-2 蛋白相對表達量在 P3 代有明顯升高，除 P0 代與 P2 代間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各代次間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測各代兔 NPCs 相關蛋白表達
a. 電泳圖 1：P0 代 2：P1 代 3：P2 代 4：P3 代；b. 蛋白相對表達量
Figure5. Protein expression of each generation rabbit NPCs by Western blot detectiona. Electrophorogram 1: P0 generation 2: P1 generation3: P2 generation 4: P3 generation; b. Protein relative expression
3 討論
3.1 NPCs 的作用
椎間盤的主要作用為連接椎體，傳導、緩沖、吸收應力和維持脊柱正常生理活動。髓核組織因承擔了大部分功能而作為椎間盤主要結構區域，其中的 NPCs 由胚胎時期的脊索細胞演變而來，具有類似于關節軟骨表型，故而被稱為類軟骨細胞。NPCs 分泌的 Ⅱ 型膠原和蛋白多糖是髓核組織主要的細胞外基質，對維持椎間盤功能起關鍵作用[6]；其次，NPCs 通過分泌細胞因子，調節合成代謝和分解代謝的平衡，維持細胞外基質物質的恒定及功能的發揮；再次，NPCs 可發揮部分吞噬細胞功能，通過吞噬細胞碎片及壞死物質，減輕髓核內炎性反應，維持內環境穩定[7]。另外，NPCs 表達的 FasL 可與入侵髓核組織的活化 T 細胞表面的 Fas 結合，促使 T 細胞凋亡，并抑制病理性過多的新生血管侵入，維持髓核組織處于免疫豁免狀態[8]。由此，NPCs 在保持髓核組織內環境穩定，繼而維持椎間盤結構和功能方面起著核心作用[9]。
椎間盤退變是由遺傳和環境因素共同作用而導致的椎間盤內細胞數量減少、功能降低、細胞外基質分解加快、物質交換能力減弱等一系列病理過程，將導致椎間盤突出、椎管狹窄、椎體滑脫、脊柱節段失穩等臨床病變，進而引起臨床癥狀，導致患者勞動能力喪失、生活質量下降，甚至出現癱瘓等后果。目前，組織病理學觀察已證實在椎間盤退變過程中，髓核組織出現明顯退變，包括 NPCs 形態改變、細胞凋亡增多、合成代謝減少、分解代謝加快等[4-5]。Haefeli 等[10]也發現，在椎間盤退變中，髓核組織退變要早于其他組織。而 NPCs 數量減少、表型向纖維軟骨樣細胞轉變，被認為是上述病理過程的始動因素[11-14]。因此，對 NPCs 的研究有望揭開椎間盤退變的機制。
3.2 NPCs 退變模型建立
目前，NPCs 退變模型的建立方法主要包括自然培養退變法和靜水壓培養法。NPCs 表型向纖維軟骨樣細胞轉變的現象提示其可能存在自發退變。Ma 等[15]對人 NPCs 進行培養觀察，發現原代 NPCs 呈多邊形或三角形，偽足較短，傳代后細胞形態逐漸變長，成紡錘形或梭形，偽足變長，培養至第 4 代后，細胞生長明顯減慢，貼壁能力變差，提示細胞出現退變。武海軍等[16]培養兔原代 NPCs 并傳代至第 4 代，對各代細胞表型以及 Aggrecan、Ⅱ 型膠原蛋白含量和 mRNA 表達水平進行分析，發現隨著培養代數增加，細胞形態變化，Aggrecan、Ⅱ 型膠原蛋白含量和 mRNA 表達均明顯下降，NPCs 發生退變。其他相關研究也同樣證實了 NPCs 自然培養傳代后，會出現明顯退變[17-20]。
靜水壓培養法通過模擬體內 NPCs 所處的壓力和振動頻率，對體外培養的 NPCs 施加類似的力學性質，判斷所處力學環境對 NPCs 生長、蛋白合成和分解的影響。Kasra 等[21]將兔 NPCs 在海藻酸鈉中進行三維培養，并施加不同壓力和頻率的靜水壓，發現短時間（3 d）內，增加靜水壓施加頻率和壓力可以促進 NPCs 合成代謝，降低分解代謝；但長時間（超過 9 d）施加靜水壓，將抑制 NPCs 合成代謝，增強分解代謝而導致 NPCs 退變。MacLean 等[22]同樣發現，長時間的靜水壓刺激 NPCs，將抑制其合成膠原蛋白和蛋白多糖，引起 NPCs 退變。
本研究采用了自然傳代培養退變法，將各代 NPCs 按同樣數量于同樣底面面積培養器內進行培養，觀察發現隨著培養代數的增加，NPCs 形態從脊索細胞樣的多角形向纖維軟骨樣的梭形轉變，偽足變長，細胞質逐漸鋪開，出現衰老征象，并且細胞貼壁和增殖能力變弱；HIF-1α、Ⅱ 型膠原、Aggrecan 等反映合成代謝活性的蛋白減少，分解代謝蛋白 MMP-2 增加，細胞逐漸出現退變。表明 NPCs 隨著自然傳代培養，可出現退變，并且這一變化過程與人 NPCs 退變過程中的病理改變一致。
3.3 椎間盤退變髓核組織變化
髓核組織為椎間盤主要結構，呈膠凍樣，包含 NPCs 和細胞外基質，細胞外基質主要由 Ⅱ 型膠原和蛋白多糖組成，而 Aggrecan 為主要的蛋白多糖成分[23-24]，少量 Ⅲ 型、Ⅴ 型、Ⅵ 型、Ⅸ 型、Ⅺ 型膠原均勻分布在髓核組織內[25-27]。其中，Ⅱ 型膠原和蛋白多糖分別占髓核組織干重的 20% 和 50%[28]。在腰椎退行性疾病發生早期，NPCs 合成膠原增加，尤其以 Ⅱ 型膠原合成明顯增加，以此作為一種修復機制[29]。當椎間盤退變進一步發展時，NPCs 凋亡增加，數量減少，合成能力減弱，再生修復能力逐漸消失，合成 Ⅱ 型膠原和 Aggrecan 能力下降，而由 MMP 主導的 Ⅱ 型膠原和 Aggrecan 分解代謝能力提高，導致髓核組織中細胞外基質減少，水分含量下降。這些改變引起髓核組織吸收、緩沖、傳導負荷能力下降，細胞外大分子基質物質形成的滲透壓和靜水壓減弱，營養物質和代謝廢物的擴散能力惡化，NPCs 生存的內環境失去原有狀態，NPCs 大量凋亡，進一步使髓核組織退變，形成惡性循環。
因此，髓核組織退變過程包括有 NPCs 的凋亡和細胞外基質成分的減少。本實驗同樣驗證了這一變化，NPCs 隨著退變的發生，其凋亡率逐漸升高，細胞生存能力減弱。并且，NPCs 合成細胞外基質的活性也逐漸下降，主要的細胞外基質成分 Ⅱ 型膠原和 Aggrecan 蛋白的合成逐漸減少。
綜上述，本研究結果顯示，通過自然傳代培養法可以構建 NPCs 退變模型。在 NPCs 退變過程中，合成和分解代謝出現不平衡，合成代謝減慢、分解代謝增快，引起 NPCs 內環境紊亂，進一步刺激 NPCs 退變。但 NPCs 退變的誘因仍未知，有待進一步研究。
隨著中國步入老齡化社會，腰椎間盤退變逐漸成為影響人類健康及降低生活質量的臨床常見病、多發病[1-3]。因此，對腰椎間盤退變機制的研究，將為防治此類疾病、改善患者生活質量提供巨大幫助。組織病理學觀察已證實在椎間盤退變過程中，髓核組織出現明顯退變，包括髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）形態改變、細胞凋亡增多、合成代謝減少、分解代謝加快等[4-5]。這些散在分布的 NPCs 產生和分泌細胞因子及細胞外基質，對維持椎間盤營養物質擴散、代謝廢物排出等內環境穩定起主要決定作用。因此，髓核組織，尤其是其中的 NPCs，是椎間盤退變病理變化的主要始動因素，對這一機制的研究或許是治療腰椎間盤退變病理變化的關鍵途徑。這些研究的前提是 NPCs 退變模型的建立，而目前對 NPCs 退變模型的研究較少且不成熟。本研究擬通過自然傳代培養法構建 NPCs 退變模型，比較不同代次 NPCs 的生物學特性，為進一步研究腰椎間盤退變機制提供可靠的、符合人體腰椎間盤退變規律的動物細胞模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡新西蘭大白兔 4 只，雌雄不限，體質量 1.5～2.5 kg，由四川大學華西醫院/華西臨床醫學院動物實驗中心提供。
0.25% 胰蛋白酶（Life 公司，美國）；Ⅱ 型膠原酶凍干粉末（Sigma 公司，美國）；FBS（Biological Industries 公司，以色列）；DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；青-鏈霉素雙抗、牛血清白蛋白（GIBCO 公司，美國）；PBS 緩沖液粉末、FITC 標記抗鼠 IgG 二抗、多聚賴氨酸（北京中杉金橋生物工程有限公司）；抗缺氧誘導因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）抗體、抗聚集蛋白聚糖（Aggrecan）抗體（Novus 公司，美國）；抗 Ⅱ 型膠原抗體、抗基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）抗體（Abcam 公司，英國）；4% 多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）；膜聯蛋白 Ⅴ（Annexin Ⅴ）-FITC 凋亡檢測試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）。
CO2 培養箱、–150℃ 超低溫細胞庫（SANYO 公司，日本）；Imager.Z2 全自動熒光顯微鏡（Zeiss 公司，德國）；1X71 生物倒置相差熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；–20℃ 冰箱（青島海爾公司）；–80℃ 冰箱、低溫高速離心機（Thermo Forma 公司，美國）；大容量水平式低溫離心機、高速離心機（Heraeus 公司，德國）；電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫療儀器廠）；80-6418-77 垂直電泳系統、TE22 濕轉系統（Amersham 公司，美國）；流式細胞儀（NAVIOS 公司，美國）；60 mm 細胞培養皿、6 孔細胞培養板、24 孔細胞培養板、離心管（Corning 公司，美國）；0.22 μm 無菌針頭濾器（Millipore 公司，美國）；200 目細胞篩網（上海捷瑞生物工程有限公司）；細胞爬片（NEST 公司，美國）；細胞凍存管（NUNC 公司，丹麥）。
1.2 兔 NPCs 分離培養及鑒定
取 4 只新西蘭大白兔采用空氣栓塞法處死，經后正中入路完整取下胸腰椎節段，含 10% 青-鏈霉素雙抗的 PBS 沖洗液沖洗標本 3 次；60 mm 培養皿中加入 4℃ 預冷的 DMEM/F12 基礎培養基 8 mL 備用。從椎間盤腹側緊貼上或下軟骨終板，沿脊柱軸位切開椎間盤至椎管前緣，可見髓核組織呈膠凍狀位于椎間盤中間；使用無齒鑷完整取出髓核組織，置于 DMEM/F12 基礎培養基中；同法依次切開脊柱節段各椎間盤；將含有髓核組織的培養基轉移入 50 mL 離心管，含 10% 青-鏈霉素雙抗的 PBS 漂洗 2～3 次后，以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min 后吸去上層培養基；加入 0.25% 胰蛋白酶 10 mL，置入 37℃ 恒溫水浴搖床消化 5～10 min；加入 15%FBS 中和胰蛋白酶，以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min 后吸去上層液體，加入 0.2%Ⅱ 型膠原酶溶液 10～15 mL，置入 37℃ 恒溫水浴搖床中，30 min 后吸取離心管中溶液，經 200 目細胞篩網過濾，轉入 15 mL 離心管；若離心管中仍有未完全消化的組織塊，可再次加入 0.2%Ⅱ型膠原酶溶液，重復上述步驟直至組織塊消化完全，行梯度消化；消化后液體以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min，去除上層液體、細胞重懸后，使用 DMEM/F12 基礎培養基漂洗 3 次。原代細胞計數后，按 1×105 個/孔密度接種于 6 孔板，加入 3 mL 含 15%FBS、1% 青-鏈霉素雙抗的 DMEM/F12 細胞培養基，記作 P0 代細胞。將細胞置于 37℃、5%CO2 孵箱培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。采用免疫細胞熒光染色法檢測培養細胞的 HIF-1α、Aggrecan、Ⅱ 型膠原、MMP-2 蛋白表達，驗證 NPCs 表型。
1.3 兔 NPCs 自然退變模型建立
待上述 P0 代 NPCs 生長融合至 95% 以上后，吸去細胞培養基，加入 0.25% 胰蛋白酶消化，倒置相差顯微鏡觀察，待細胞形態變化、部分細胞懸浮后，使用 15%FBS 中止消化。將未完全懸浮的細胞輕微吹打懸浮后轉入 15 mL 離心管，以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min；去除上清液后重懸細胞，按 1×105 個/孔接種于 6 孔板中，加入 3 mL 細胞培養基后分瓶培養，記作 P1 代細胞。將 P1 代細胞放置于 37℃、5%CO2 培養箱培養，每 2～3 天換液；以此順序自然培養、傳代細胞，得到 P2、P3 代細胞。倒置相差顯微鏡下觀察培養過程中細胞形態變化。
1.4 觀測指標
1.4.1 免疫細胞熒光染色檢測
取 4 塊 24 孔板分別用于 P0～P3 代 NPCs，每塊板選 5 個孔，將細胞爬片鋪被于孔底面，每孔加入多聚賴氨酸溶液覆蓋底面，37℃ 過夜；吸去多聚賴氨酸溶液，DMEM/F12 基礎培養基清洗 1 次，將同代 NPCs 按 1×104個/孔密度接種入孔中，加入 1 mL 含 15%FBS 的 DMEM/F12 細胞培養基，置于 37℃、5%CO2 培養箱培養，每 2～3 天換液 1 次；待細胞貼壁，生長融合至 60%～70% 時吸去細胞培養基，PBS 漂洗細胞 3 次；加入 4% 多聚甲醛 4℃ 固定 5～10 min 后，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；加入 10% 牛血清白蛋白常溫封閉蛋白 20 min；棄去牛血清白蛋白后在相應孔內添加配制好的 HIF-1α、Aggrecan、Ⅱ型膠原、MMP-2 一抗溶液，4℃ 過夜；PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，避光加入配制好的 FITC 標記抗鼠 IgG 二抗，37℃ 避光靜置 1 h；PBS 再次避光漂洗 3 次，每次 5 min；甘油封片后熒光顯微鏡下觀察熒光染色情況。
1.4.2 細胞凋亡檢測
采用 Annexin-Ⅴ/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染流式細胞術檢測細胞調亡。取各代 NPCs，用 0.25% 胰蛋白酶消化重懸，15%FBS 中和消化，以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min，去除上清液；4℃ 預冷的 PBS 清洗細胞 2 次后，用 250 μL 結合緩沖液（Annexin Ⅴ-FITC 凋亡檢測試劑盒自帶）重懸細胞，移入流式管；避光依次加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和 10 μL 20 μg/mL PI 溶液，混勻后室溫避光孵育 15 min；上流式細胞儀分析 P0～P3 代細胞凋亡率。
1.4.3 Western blot 檢測
將 6 孔板內培養的 P0～P3 代 NPCs，待其于孔內生長融合至 95% 以上時，使用細胞刮輕柔刮下細胞，移入 15 mL 離心管，以離心半徑 13.5 cm、1 200 r/min 離心 5 min 后，PBS 清洗 2～3 次；移入 EP 管內高速離心（4℃、12 000×g 離心 2 min），吸去上清液后將樣品放入–80℃ 冰箱保存備用。將 P0～P3 代細胞樣品冰浴復溫，加入預冷的蛋白裂解液，超聲破碎儀破碎（100～200 W）2 次，每次 3 s；4℃、12 000×g 離心 2 min 提取蛋白；取少量上清行 BCA 蛋白定量后，將所有蛋白樣品調至等濃度；取等量蛋白上樣至 12.6%SDS-PAGE 分離凝膠中進行電泳，分離出相對分子質量不等的蛋白。分別使用抗 HIF-1α、抗 Aggrecan、抗 Ⅱ 型膠原、抗 MMP-2 單克隆抗體（作為一抗）以及對應二抗進行 Western blot 分析；GAPDH 用來確定等量上樣。采用 ECL 發光系統曝光顯影，使用 Image J 軟件分析蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 兔 NPCs 細胞表型鑒定
免疫細胞熒光染色示，P0 代兔 NPCs 均能表達 HIF-1α、MMP-2、Ⅱ 型膠原、Aggrecan 蛋白，其中 HIF-1α、Ⅱ 型膠原主要在細胞核表達，Aggrecan、MMP-2 主要在細胞質中表達。見圖 1。
圖1
P0 代兔 NPCs 免疫細胞熒光染色鑒定（熒光顯微鏡×200）
a. HIF-1α；b. Ⅱ 型膠原；c. Aggrecan；d. MMP-2
Figure1. Immunofluorescence identification of P0 generation rabbit NPCs (Fluorescence microscope×200)a. HIF-1α; b. Collagen type Ⅱ; c. Aggrecan; d. MMP-2
2.2 各代兔 NPCs 形態學變化
P0 代細胞貼壁能力較差，7～10 d 完全貼壁，細胞呈三角形、多角形或紡錘形，偽足較短；部分細胞相互融合成細胞團，并沿細胞團向四周逐漸生長倍增出多邊形的細胞，無明顯偽足；部分細胞出現特征性的空泡結構。細胞生長緩慢，3～4 周后才可傳代。見圖 2a。
圖2
倒置相差顯微鏡觀察各代兔NPCs形態學變化
a. P0 代細胞 從左至右依次為培養 10 d（×40）、10 d（×200）、20 d（×40）、20 d（×200）；b. P1 代細胞 從左至右依次為培養 1 d（×40）、1 d（×200）、5 d（×40）、5 d（×200）；c. P2 代細胞 從左至右依次為培養 3 d（×40）、3 d（×200）、10 d（×40）、10 d（×200）；d. P3 代細胞 從左至右依次為培養 3 d（×40）、3 d（×200）、14 d（×40）、14 d（×200）
Figure2. The morphological changes of each generation rabbit NPCs by inverted phase contrast microscopea. P0 generation NPCs From left to right for 10 days (×40), 10 days (×200), 20 days (×40), and 20 days (×200), respectively; b. P1 generation NPCs From left to right for 1 day (×40), 1 day (×200), 5 days (×40), and 5 days (×200), respectively; c. P2 generation NPCs From left to right for 3 days (×40), 3 days (×200), 10 days (×40), and 10 days (×200), respectively; d. P3 generation NPCs From left to right for 3 days (×40), 3 days (×200), 14 days (×40), and 14 days (×200), respectively
P1 代細胞貼壁及生長倍增能力明顯增強，1 d 后即已完全貼壁，1 周后即可再次傳代；細胞形態多為紡錘形，少部分仍為多角性，含空泡結構的細胞增多。見圖 2b。
P2 代細胞貼壁能力尚可，傳代后 2～3 d 貼壁，生長倍增時間稍延長，1～2 周可再次傳代；細胞形態逐漸以紡錘形或梭形為主，偽足變長，部分細胞含有空泡，較前代減少，出現退變改變。見圖 2c。
P3 代細胞貼壁能力明顯變弱，少部分細胞經過 1 周培養后仍無法貼壁；細胞以梭形或大多角形為主，細胞體積變大，細胞質鋪開，極少見含空泡細胞；細胞生長倍增時間明顯延長，培養 2 周后仍未見明顯生長增殖，細胞出現明顯退變。見圖 2d。
2.3 各代兔 NPCs 免疫細胞熒光染色檢測
隨著培養代數的增加，HIF-1α、Ⅱ 型膠原和 Aggrecan 熒光強度逐漸減小，MMP-2 熒光強度逐漸增加。見圖 3。
圖3
各代兔 NPCs 免疫細胞熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
從左至右依次為 P0、P1、P2、P3 代細胞 a. HIF-1α；b. Ⅱ 型膠原；c. Aggrecan；d. MMP-2
Figure3. Immunofluorescence staining observation of each generation rabbit NPCs (Fluorescence microscope×200)From left to right for P0, P1, P2, and P3 generations NPCs a. HIF-1α; b. Collagen type Ⅱ; c. Aggrecan; d. MMP-2
2.4 各代兔 NPCs 凋亡檢測
P0～P3 代兔 NPCs 細胞凋亡率分別為 5.47%±0.91%、13.77%±2.42%、33.46%±1.82%、38.76%±1.50%，隨著培養代數增加，細胞凋亡率明顯增加，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
流式細胞儀檢測各代兔 NPCs 凋亡情況
a. P0 代；b. P1 代；c. P2 代；d. P3 代
Figure4. Apoptosis detection of each generation rabbit NPCs by flow cytometrya. P0 generation; b. P1 generation; c. P2 generation; d. P3 generation
2.5 Western blot 檢測
HIF-1α 蛋白相對表達量在 P0 代較高，P1 代有升高趨勢，而后逐漸降低，各代次間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。Ⅱ 型膠原蛋白相對表達量從 P0～P3 代逐漸降低，各代次間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。Aggrecan 蛋白相對表達量從 P0～P2 代逐漸降低，P0～P2 代間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；P2 代與 P3 代間比較差異無統計學意義（P>0.05）。MMP-2 蛋白相對表達量在 P3 代有明顯升高，除 P0 代與 P2 代間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各代次間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測各代兔 NPCs 相關蛋白表達
a. 電泳圖 1：P0 代 2：P1 代 3：P2 代 4：P3 代；b. 蛋白相對表達量
Figure5. Protein expression of each generation rabbit NPCs by Western blot detectiona. Electrophorogram 1: P0 generation 2: P1 generation3: P2 generation 4: P3 generation; b. Protein relative expression
3 討論
3.1 NPCs 的作用
椎間盤的主要作用為連接椎體，傳導、緩沖、吸收應力和維持脊柱正常生理活動。髓核組織因承擔了大部分功能而作為椎間盤主要結構區域，其中的 NPCs 由胚胎時期的脊索細胞演變而來，具有類似于關節軟骨表型，故而被稱為類軟骨細胞。NPCs 分泌的 Ⅱ 型膠原和蛋白多糖是髓核組織主要的細胞外基質，對維持椎間盤功能起關鍵作用[6]；其次，NPCs 通過分泌細胞因子，調節合成代謝和分解代謝的平衡，維持細胞外基質物質的恒定及功能的發揮；再次，NPCs 可發揮部分吞噬細胞功能，通過吞噬細胞碎片及壞死物質，減輕髓核內炎性反應，維持內環境穩定[7]。另外，NPCs 表達的 FasL 可與入侵髓核組織的活化 T 細胞表面的 Fas 結合，促使 T 細胞凋亡，并抑制病理性過多的新生血管侵入，維持髓核組織處于免疫豁免狀態[8]。由此，NPCs 在保持髓核組織內環境穩定，繼而維持椎間盤結構和功能方面起著核心作用[9]。
椎間盤退變是由遺傳和環境因素共同作用而導致的椎間盤內細胞數量減少、功能降低、細胞外基質分解加快、物質交換能力減弱等一系列病理過程，將導致椎間盤突出、椎管狹窄、椎體滑脫、脊柱節段失穩等臨床病變，進而引起臨床癥狀，導致患者勞動能力喪失、生活質量下降，甚至出現癱瘓等后果。目前，組織病理學觀察已證實在椎間盤退變過程中，髓核組織出現明顯退變，包括 NPCs 形態改變、細胞凋亡增多、合成代謝減少、分解代謝加快等[4-5]。Haefeli 等[10]也發現，在椎間盤退變中，髓核組織退變要早于其他組織。而 NPCs 數量減少、表型向纖維軟骨樣細胞轉變，被認為是上述病理過程的始動因素[11-14]。因此，對 NPCs 的研究有望揭開椎間盤退變的機制。
3.2 NPCs 退變模型建立
目前，NPCs 退變模型的建立方法主要包括自然培養退變法和靜水壓培養法。NPCs 表型向纖維軟骨樣細胞轉變的現象提示其可能存在自發退變。Ma 等[15]對人 NPCs 進行培養觀察，發現原代 NPCs 呈多邊形或三角形，偽足較短，傳代后細胞形態逐漸變長，成紡錘形或梭形，偽足變長，培養至第 4 代后，細胞生長明顯減慢，貼壁能力變差，提示細胞出現退變。武海軍等[16]培養兔原代 NPCs 并傳代至第 4 代，對各代細胞表型以及 Aggrecan、Ⅱ 型膠原蛋白含量和 mRNA 表達水平進行分析，發現隨著培養代數增加，細胞形態變化，Aggrecan、Ⅱ 型膠原蛋白含量和 mRNA 表達均明顯下降，NPCs 發生退變。其他相關研究也同樣證實了 NPCs 自然培養傳代后，會出現明顯退變[17-20]。
靜水壓培養法通過模擬體內 NPCs 所處的壓力和振動頻率，對體外培養的 NPCs 施加類似的力學性質，判斷所處力學環境對 NPCs 生長、蛋白合成和分解的影響。Kasra 等[21]將兔 NPCs 在海藻酸鈉中進行三維培養，并施加不同壓力和頻率的靜水壓，發現短時間（3 d）內，增加靜水壓施加頻率和壓力可以促進 NPCs 合成代謝，降低分解代謝；但長時間（超過 9 d）施加靜水壓，將抑制 NPCs 合成代謝，增強分解代謝而導致 NPCs 退變。MacLean 等[22]同樣發現，長時間的靜水壓刺激 NPCs，將抑制其合成膠原蛋白和蛋白多糖，引起 NPCs 退變。
本研究采用了自然傳代培養退變法，將各代 NPCs 按同樣數量于同樣底面面積培養器內進行培養，觀察發現隨著培養代數的增加，NPCs 形態從脊索細胞樣的多角形向纖維軟骨樣的梭形轉變，偽足變長，細胞質逐漸鋪開，出現衰老征象，并且細胞貼壁和增殖能力變弱；HIF-1α、Ⅱ 型膠原、Aggrecan 等反映合成代謝活性的蛋白減少，分解代謝蛋白 MMP-2 增加，細胞逐漸出現退變。表明 NPCs 隨著自然傳代培養，可出現退變，并且這一變化過程與人 NPCs 退變過程中的病理改變一致。
3.3 椎間盤退變髓核組織變化
髓核組織為椎間盤主要結構，呈膠凍樣，包含 NPCs 和細胞外基質，細胞外基質主要由 Ⅱ 型膠原和蛋白多糖組成，而 Aggrecan 為主要的蛋白多糖成分[23-24]，少量 Ⅲ 型、Ⅴ 型、Ⅵ 型、Ⅸ 型、Ⅺ 型膠原均勻分布在髓核組織內[25-27]。其中，Ⅱ 型膠原和蛋白多糖分別占髓核組織干重的 20% 和 50%[28]。在腰椎退行性疾病發生早期，NPCs 合成膠原增加，尤其以 Ⅱ 型膠原合成明顯增加，以此作為一種修復機制[29]。當椎間盤退變進一步發展時，NPCs 凋亡增加，數量減少，合成能力減弱，再生修復能力逐漸消失，合成 Ⅱ 型膠原和 Aggrecan 能力下降，而由 MMP 主導的 Ⅱ 型膠原和 Aggrecan 分解代謝能力提高，導致髓核組織中細胞外基質減少，水分含量下降。這些改變引起髓核組織吸收、緩沖、傳導負荷能力下降，細胞外大分子基質物質形成的滲透壓和靜水壓減弱，營養物質和代謝廢物的擴散能力惡化，NPCs 生存的內環境失去原有狀態，NPCs 大量凋亡，進一步使髓核組織退變，形成惡性循環。
因此，髓核組織退變過程包括有 NPCs 的凋亡和細胞外基質成分的減少。本實驗同樣驗證了這一變化，NPCs 隨著退變的發生，其凋亡率逐漸升高，細胞生存能力減弱。并且，NPCs 合成細胞外基質的活性也逐漸下降，主要的細胞外基質成分 Ⅱ 型膠原和 Aggrecan 蛋白的合成逐漸減少。
綜上述，本研究結果顯示，通過自然傳代培養法可以構建 NPCs 退變模型。在 NPCs 退變過程中，合成和分解代謝出現不平衡，合成代謝減慢、分解代謝增快，引起 NPCs 內環境紊亂，進一步刺激 NPCs 退變。但 NPCs 退變的誘因仍未知，有待進一步研究。
