引用本文： 陳曦, 范永恒, 肖志峰, 李星, 楊斌, 趙燕南, 侯祥林, 韓素芳, 戴建武. 膠原支架結合腦源性神經營養因子移植促進全橫斷脊髓損傷大鼠軸突再生及運動功能恢復的研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(6): 650-659. doi: 10.7507/1002-1892.201803094 復制
脊髓損傷可造成損傷平面以下運動和感覺功能不同程度的喪失[1]，損傷后脊髓微環境的改變可導致軸突回縮及再生低下[2]。應用生物支架材料橋接損傷的脊髓兩端從而引導軸突再生，已成為脊髓損傷修復研究領域一個重要的治療策略[3-5]。線性有序膠原支架（linear ordered collagen scaffolds，LOCS）不僅能為脊髓損傷后形成的缺損提供機械性支撐作用，還能結合生長因子和細胞作為其載體，參與脊髓損傷后微環境的重建[6-9]。NGF 可以對神經元起到營養保護作用，還能有助于軸突生長和神經環路的重建[10]。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是中樞神經系統創傷修復中最為常用的因子之一[11]。融合了膠原結合結構域（collagen binding domain，CBD）的 BDNF（CBD-BDNF）能特異性地結合在基于膠原的生物材料上，防止因子在體內發生快速擴散，從而在體內維持較為均勻的釋放效率[12]。神經示蹤技術在神經科學領域研究中具有舉足輕重的作用，其中逆行示蹤技術由于操作相對簡便、術后等待時間相對較短、示蹤效果明顯，而廣泛用于脊髓損傷后的神經示蹤研究中[13]。熒光金（fluorogold，FG）染料具有可自帶熒光、靈敏度高、使用方便的優點，能夠在神經元胞質積聚而不擴散，是一種常用的逆行示蹤劑。本課題組既往研究已成功應用 LOCS 結合 BDNF 修復大鼠半橫斷脊髓損傷[14]，但關于 LOCS 結合 CBD-BDNF 治療大鼠全橫斷脊髓損傷的研究尚未見報道，并且基于 LOCS 的修復方法療效評價中，可靠的示蹤技術仍需進一步探究。為此，本研究將 LOCS 與 CBD-BDNF 相結合構建一種分子緩釋平臺，用于修復大鼠全橫斷脊髓損傷組織，并探索性地利用 FG 逆行示蹤對修復效果進行評價，以期為脊髓損傷的臨床治療奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
清潔級成年雌性 SD 大鼠 32 只，體質量 180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
LOCS 及 CBD-BDNF 均為本實驗室自制[12, 14]。Triton X-100（Amresco 公司，美國）；丙酮（上海國藥集團化學試劑有限公司）；FBS、Alexa Fluor 488 驢抗小鼠 IgG 抗體、Alexa Fluor 568 驢抗兔 IgG 抗體（Invitrogen 公司，美國）；兔源神經絲（neurofilament，NF）單抗、小鼠源膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）單抗、小鼠源突觸小泡蛋白（Synaptophysin，Syn）單抗（Abcam 公司，英國）；DAPI（北京中杉金橋生物技術有限公司）；FG（Fluorochorom 公司，美國）；PBS 溶液（Thermo Fisher 公司，美國）；4% 多聚甲醛（北京雷根生物技術有限公司）；O.C.T.組織冰凍包埋劑（櫻花公司，美國）；水合氯醛、蔗糖（上海國藥集團化學試劑有限公司）。
手術器材（上海醫療器械有限公司手術器械廠）；微量進樣器（上海高鴿工貿有限公司）；陽離子防脫載玻片（北京中杉金橋生物技術有限公司）；肌電圖/誘發電位儀（Natus 公司，美國）；冰凍切片機、激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國）；熒光顯微鏡（Zeiss 公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
將 32 只 SD 大鼠隨機分成 4 組，每組 8 只。將所有大鼠以 10% 水合氯醛腹腔注射（0.35 mL/100 g）麻醉后，俯臥位固定于手術臺上，背部乙醇消毒并備皮。以 T10 棘突為中心在背部正中作一長約 2 cm 的縱切口，依次切開 T8～T11 段皮膚及肌肉，分離雙側棘突旁肌肉，行椎板切除術暴露 T9、T10 段脊髓。B、C、D 組用顯微剪切除 4 mm 長脊髓組織，A 組不切除脊髓組織。用明膠海綿輕輕壓迫止血后，C、D 組分別于損傷點移植入 4 mm 長 LOCS 和 4 mm 長結合了 CBD-BDNF 的 LOCS（移植前將 CBD-BDNF 固體粉末溶解于 PBS 中，配成濃度為 0.25 μg/μL 的溶液，并將 LOCS 浸潤其中孵化 2～3 min）。逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚，切口消毒。
1.3 觀測指標
1.3.1 BBB 運動功能評分
術前及術后 3 個月內每周 1 次，采用 BBB 評分標準對各組大鼠進行行為學評分[15]，評價大鼠后肢運動功能恢復情況。
1.3.2 神經電生理檢測
術后 3 個月每組隨機取 5 只大鼠，10% 水合氯醛腹腔注射（0.35 mL/100 g）麻醉后，用肌電圖/誘發電位儀測量運動誘發電位（motor evoked potential，MEP）。測量時刺激電極置于大鼠大腦皮層一側，記錄電極置于大鼠對側腓腸肌上，采用單次刺激，刺激電流為 45 mA，刺激時長為 0.1 ms，頻率為 2 Hz。記錄各組大鼠的 MEP 潛伏期。
1.3.3 注射 FG 逆行示蹤檢測
術后 3 個月，對所有大鼠行 10% 水合氯醛腹腔注射（0.35 mL/100 g）麻醉，俯臥位固定于手術臺上，背部乙醇消毒并備皮。以 L1 棘突為標記在腰背部正中向尾側作一長約 2 cm 的縱切口，采用椎板切除術暴露脊髓；然后借助立體定位儀支架固定微量進樣器，以 L2 段脊髓后正中靜脈為中心于左右各 1 mm 處進針，分別在進針深度 0.5、1.0、1.5 mm 處各注射 0.1 μL FG，每個點留針 5 min，注射完畢后緩慢拔針。逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚，傷口消毒。
FG 逆行示蹤后 1 周，每只大鼠以 4% 多聚甲醛經心臟灌注固定，取出大腦及胸段脊髓組織置于 4% 多聚甲醛固定過夜；固定后的脊髓組織依次用 20%、30% 梯度蔗糖溶液 4℃ 脫水各 12 h。脫水完畢后大體觀察脊髓組織形態。然后切取包含損傷區在內的約 2 cm 長脊髓組織，再分別將損傷區以上 1 cm 左右胸段脊髓和損傷區以下 1 cm 腰段脊髓截成約 4 mm 的多個小段。所有腦組織用 O.C.T.包埋劑包埋，采用冷凍連續冠狀切片，片厚 30 μm；包含損傷區的胸段脊髓采用冷凍連續水平切片，片厚 15 μm；上述分別截取的胸段、腰段 4 mm 脊髓小段采用連續冠狀切片，片厚 30 μm。
逆行示蹤結果觀測：每只大鼠各取 5 張腦部及脊髓冠狀切片，直接置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，由于 FG 在 405 nm 激發光下受光源顏色干擾不利于觀察，因此掃描時使用程序設定成藍色。將掃描所得圖像參數調節一致后，利用 Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統，計算 FG 陽性細胞積分吸光度（IA）值，取均值。
1.3.4 免疫熒光染色觀察
① 全橫斷脊髓損傷模型的免疫熒光染色觀察：從 D 組水平切片中分別挑選出自脊髓背側至腹側的組織切片，冷丙酮固定，PBS 洗滌 3 次；0.3%Triton X-100 透膜 10 min，PBS 洗滌 3 次；5%FBS 室溫封閉 1 h，棄去血清，滴加一抗（小鼠源 GFAP 單抗，1∶500），4℃ 孵育過夜；PBS 洗滌 3 次并吸干液體后，滴加相應二抗（Alexa Fluor 488 驢抗小鼠 IgG 抗體，1∶500），室溫孵育 1 h；PBS 洗滌 3 次，最后用 DAPI 進行細胞核染色，封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。
② 脊髓損傷區軸突再生情況觀察：取各組脊髓水平切片，同 ① 方法采用免疫熒光染色法觀察各組脊髓損傷區軸突再生情況。一抗采用小鼠源 GFAP 單抗（1∶500）、兔源 NF 單抗（1∶500），二抗采用 Alexa Fluor 488 驢抗小鼠 IgG 抗體（1∶500）、Alexa Fluor 568 驢抗兔 IgG 抗體（1∶500）。從每只大鼠損傷中心的高倍鏡圖片中隨機選取 5 張，計算 NF 陽性軸突數。
③ D 組再生軸突的突觸形成檢測：同 ① 方法采用免疫熒光染色法觀察 D 組脊髓損傷區再生軸突的突觸形成情況。一抗采用小鼠源 Syn 單抗（1∶500）、兔源 NF 單抗（1∶500），二抗采用 Alexa Fluor 488 驢抗小鼠 IgG 抗體（1∶500）、Alexa Fluor 568 驢抗兔 IgG 抗體（1∶500）。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BBB 運動功能評分
術前各組大鼠 BBB 評分均為 21 分，術后即刻均降為 0 分。術后 1 周，A 組大鼠運動功能恢復至正常水平（21 分），B～D 組 BBB 評分在術后 2 個月內呈上升狀態，2 個月后基本維持在平臺期。術后各時間點 B、C、D 組 BBB 評分均顯著低于 A 組（P<0.05）。術后 2～12 周 D 組 BBB 評分均明顯高于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；C 組 BBB 評分在術后 3～8 周及 11、12 周明顯高于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
2.2 神經電生理檢測
A、C、D 組均可檢測到 MEP 電位，其中 A 組 MEP 電位波形穩定，潛伏期短且振幅大。C、D 組 MEP 潛伏期明顯長于 A 組，C 組長于 D 組；MEP 振幅明顯小于 A 組，但 C、D 組間相差不明顯。B 組只有 1 只大鼠可檢測到輕微振幅，其余 4 只未檢測到 MEP。見圖 2。A、C、D 組 MEP 潛伏期分別為（3.420±0.928）、（15.030±2.745）以及（7.610±2.039）ms，C、D 組顯著長于 A 組，C 組顯著長于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 脊髓組織形態觀察
術后 3 個月 A 組脊髓未見明顯損傷點，脊髓形態保持完整。B 組脊髓損傷區域向兩端延伸，組織再生長較少且有明顯空洞、瘢痕，損傷部位組織破壞嚴重。C、D 組脊髓形態恢復較好，粗細程度和形態基本與正常脊髓相似，D 組修復效果優于 C 組。見圖 3。
2.4 FG 逆行示蹤結果觀測
各組大鼠腦部冠狀面圖像觀察示，A 組大鼠大腦皮層的錐體細胞層可清晰見到 FG 陽性標記細胞中體積較大的突觸，其余各組均未檢測到相應錐體細胞層中 FG 陽性細胞的存在。見圖 4。
各組大鼠損傷區以下腰段脊髓冠狀面圖像觀察示，脊髓灰質中均充滿了 FG 陽性細胞，整片區域亮度顯著。見圖 5。A～D 組 IA 值分別為 2 633 674±296 048、2 239 275±260 029、2 400 895±276 230、2 471 926±272 964，比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
損傷區以上胸段脊髓冠狀面圖像觀察示，A 組 FG 陽性區域基本布滿整個脊髓灰質；B 組脊髓灰質中只有極少 FG 陽性區域存在；C、D 組脊髓灰質中出現了少許陽性細胞區域，D 組陽性區域略大于 C 組。見圖 6。A～D 組 IA 值分別為 1 927 617±250 029、44 839±368、291 713±62 828、330 619±80 252，A 組顯著高于 B、C、D 組，C、D 組高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
2.5 免疫熒光染色觀察
2.5.1 全橫斷脊髓損傷模型觀察
D 組同一脊髓組織背側至腹側的水平切片中，切片兩側 GFAP 陽性信號富集的區域之間可見明顯的全橫斷脊髓損傷區，脊髓組織已明顯離斷，并且損傷區的組織形態明顯異于正常組織，提示全橫斷脊髓損傷造模成功。見圖 7。
2.5.2 脊髓損傷區軸突再生情況
術后 3 個月，A 組 T9、T10 節段脊髓存在大量 NF 陽性信號；B 組僅在損傷區邊緣出現部分 NF 陽性信號，損傷中心只存在極少 NF 陽性信號；C 組脊髓損傷區有少量 NF 陽性信號；D 組損傷區出現大量 NF 陽性信號，并且 NF 陽性信號從正常組織向損傷區延伸。見圖 8。各組脊髓損傷中心放大像顯示，A、B、C、D 組 NF 陽性軸突數分別為（35.2±3.1）、（3.5±1.3）、（10.8±1.7）、（22.3±2.2）個/視野，A 組明顯多于 B、C、D 組，C、D 組多于 B 組，D 組多于 C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 9。
D 組脊髓損傷中心 NF 陽性軸突富集區域檢測到多個 NF 與突觸信號標志物 Syn 雙陽性信號，二者緊密接觸，提示部分再生的軸突在損傷區內能形成突觸連接。見圖 10。
圖1
各時間點各組大鼠 BBB 評分
Figure1.
BBB scores of rats in each group at each time point
圖2
術后 3 個月各組 MEP 測量
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure2. MEP tests of each group at 3 months after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖3
術后 3 個月各組脊髓組織形態觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure3. Morphological observation of spinal cords in each group at 3 months after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖4
FG 逆行示蹤后大鼠腦部冠狀面觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×20）
a. A 組；b. D 組
Figure4. Observation of brain coronal section after retrograde tracing with FG (Laser scanning confocal microscope×20)a. Group A; b. Group D
圖5
FG 逆行示蹤后各組損傷區以下腰段脊髓冠狀面觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×20）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Observation of coronal sections of lumbar spinal cords below lesion sites in each group after retrograde tracing with FG (Laser scanning confocal microscope×20)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖6
FG 逆行示蹤后各組損傷區以上胸段脊髓冠狀面觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×20）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure6. Observation of coronal sections of cervical spinal cords above lesion sites in each group after retrograde tracing with FG (Laser scanning confocal microscope×20)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖7
全橫斷脊髓損傷模型的免疫熒光染色觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×10）
藍色示 DAPI，綠色示 GFAP；從上至下依次為脊髓背側至腹側，從左至右為頭側至尾側
Figure7. Immunofluorescent stained observation of transected spinal cord injury model (Laser scanning confocal microscope×10)Blue for DAPI, green for GFAP; from top to bottom for dorsal to ventral spinal cord respectively, from left to right for rostral to caudal
圖8
術后 3 個月各組脊髓損傷區域軸突再生情況（激光掃描共聚焦顯微鏡×10）
藍色示 DAPI，綠色示 GFAP，紅色示 NF；從左至右為頭側至尾側 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure8. Axonal regeneration in lesion area of each group at3 months after operation (Laser scanning confocal microscope×10)Blue for DAPI, green for GFAP, red for NF; from left to right for rostral to caudal a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖9
術后 3 個月各組脊髓損傷中心軸突再生情況（激光掃描共聚焦顯微鏡×40）
藍色示 DAPI，綠色示 GFAP，紅色示 NF a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure9. Axonal regeneration in lesion center of each group at 3 months after operation (Laser scanning confocal microscope×40)Blue for DAPI, green for GFAP, red for NF a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖10
術后 3 個月 D 組再生軸突突觸形成觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×120）
從左至右依次為 DAPI、NF、Syn 及三者疊加
Figure10. Synapse formation of regenerated axons in group D at 3 months after operation (Laser scanning confocal microscope×120)From left to right for DAPI, NF, Syn, and merge, respectively
3 討論
脊髓損傷后，脊髓下行運動神經和上行感覺神經遭到嚴重破壞，損傷后的出血、炎性反應等次級傷害會進一步導致局部神經組織和損傷平面以下神經環路的損害[16]。脊髓損傷后膠質瘢痕、空洞等物理屏障的形成，極大地阻礙了軸突的再生[17]。脊髓損傷類型有多種，全橫斷損傷是其中最為嚴重的類型，它能導致損傷區域所有運動及感覺神經軸突束的丟失，損傷后軸突很難再生[18]，治療難度最大。
目前針對脊髓損傷修復的一種觀點是，通過應用生物材料在損傷脊髓之間搭建橋接來連接脊髓組織，并通過改善微環境來誘導軸突再生[19-20]。神經再生膠原支架 LOCS 來源于天然動物膠原蛋白，它通過模擬正常中樞神經系統的細胞外基質，能在體內為神經組織提供一個良好的再生微環境，有序引導神經再生的方向，同時支架本身也有治療作用，能抑制瘢痕的生成[20]。本實驗術后 3 個月脊髓形態觀察發現，B 組脊髓損傷向兩端延伸，而 C、D 組大鼠脊髓形態恢復較好，雖然 C 組脊髓內部也有空洞形成，但阻止了損傷的持續延伸，表明 LOCS 不僅能減小損傷面積，還能通過其橋接作用促進全橫斷損傷脊髓組織的連接及再生。
脊髓損傷后神經再生低下的一個重要因素在于神經生長因子的缺乏以及生長抑制因子的大量釋放[16]。目前對此的治療途徑之一是利用各種方法向體內遞送生長促進因子，如各種神經營養因子。神經營養因子不僅可以促進中樞和周圍神經系統神經元的生長發育，而且對成熟神經元的維持以及軸突生長和神經遞質傳遞等有重要作用[21]。其中，BDNF 可以促進神經元存活、受損軸突再生及髓鞘化，還能促進神經可塑性等，目前被認為是脊髓損傷治療中的有效治療因子[22]。本實驗中使用的 CBD-BDNF，是通過在天然 BDNF 上融合 CBD，賦予其特殊的膠原結合能力。我們前期研究已經證實了 CBD-BDNF 相比天然的 BDNF 能更好地結合膠原材料，從而保證因子在膠原支架上的緩慢釋放以及在體內形成持續作用[14, 23]。Han 等[14]應用 CBD-BDNF 與 LOCS 治療半橫斷脊髓損傷大鼠，術后 15 周內觀察到了大鼠運動功能的恢復。在另一個研究中，他們將 CBD-BDNF 與 EGF 受體中和性抗體與 LOCS 結合，成功用于修復長度為 6 mm 的大鼠全橫斷脊髓損傷，并在術后 8 周進行了分析評價[23]。值得注意的是，該研究中未探討其對于功能恢復的作用。基于此，本實驗所采用的損傷模型為4 mm 長全橫斷脊髓損傷大鼠模型，采用 CBD-BDNF 結合 LOCS 移植修復，術后 3 個月內觀察大鼠后肢功能的改善情況；軸突再生的相關研究則采用了免疫熒光染色和 FG 逆行示蹤，這也是類似治療方法中首次采用 FG 逆行示蹤進行評價。
本實驗結果顯示，C、D 組大鼠在術后 3 個月內表現出了明顯的后肢運動功能恢復，BBB 評分明顯高于未經治療的 B 組，提示 LOCS 移植治療能很好地促進全橫斷脊髓損傷后的后肢運動功能恢復。且 D 組 BBB 評分顯著高于 C 組，提示在結合了 CBD-BDNF 后，LOCS 在體內形成了有效的分子遞送平臺，進一步提升了運動功能的恢復。上述結果說明材料和因子具有一定的修復效果，但治療后大鼠的運動功能仍難以恢復至正常水平，修復方法尚需要進一步改進。電生理檢測結果顯示，在 C、D 組成功檢測到了全橫斷脊髓損傷大鼠的 MEP，而 B 組中大多數動物未檢測到 MEP，這與脊髓形態觀察結果基本對應，即 B 組脊髓組織缺損嚴重影響了神經電沖動傳導。C、D 組 MEP 潛伏期均長于 A 組，而 D 組明顯短于 C 組，說明相比于未經治療的 B 組，C 組中 LOCS 在一定程度上促進了全橫斷脊髓損傷后電生理的恢復，并且 D 組在結合 CBD-BDNF 后能進一步促進 MEP 傳導的恢復。提示脊髓損傷大鼠經過治療后，可能存在損傷平面以下神經環路與突觸聯系的重建。
神經示蹤技術可以很好地顯示中樞神經系統神經的走行及評價脊髓損傷后修復效果。順行示蹤一般用于下行傳導束的追蹤，可以清晰顯示皮質脊髓束的纖維走行等[24]；逆行示蹤技術常用于上行傳導束追蹤[25-26]，其操作更為簡便。本實驗采用的 FG 是一種耐紫外線照射、褪色較慢的逆行示蹤劑，可在熒光顯微鏡下直接觀察，所以既不需要在暗室內曝光顯色，也不需要通過底物反應顯色。本實驗中從損傷點以下的 L2 段脊髓注射 FG，A 組大腦皮層的錐體層細胞可檢測到 FG 標記陽性細胞，說明 FG 可以被脊髓神經元吸收并向上運輸；在 B、C、D 組的相同細胞層則并未檢測到 FG 陽性信號，可能原因是損傷后的脊髓神經組織再生有限，FG 僅限于損傷區以上胸段脊髓可檢測到，不足以上傳到腦皮層。在損傷區以上的胸段脊髓冠狀面切片觀察中，雖然 C、D 組灰質中 FG 陽性區域的 IA 值無統計學差異，但均明顯大于 B 組，表明全橫斷脊髓損傷后，通過在損傷點移植入 LOCS 或結合了 CBD-BDNF 的 LOCS 進行治療，能夠促進上行神經軸突跨越損傷區進行再生。但是，本次實驗中的示蹤效果并不十分理想，提示了此治療方法或示蹤方法仍需改進。
本實驗挑選出 D 組自脊髓背側至腹側的組織切片行免疫熒光染色，結果顯示各組織切片中間存在明顯的脊髓損傷區域，說明全橫斷脊髓損傷模型成功建立。D 組損傷區域出現了大量 NF 陽性的神經組織連接，并且損傷中心再生軸突明顯多于 B、C 組，說明 LOCS 結合 CBD-BDNF 的治療方法能有效促進脊髓損傷大鼠的軸突再生。Syn 是一種神經突觸的特異性標記，值得注意的是，在 D 組損傷中心再生軸突大量聚集的區域，部分再生軸突之間表現出了 Syn 陽性突觸的形成，提示 LOCS 結合 CBD-BDNF 的治療方法在促進軸突再生的同時重建了神經軸突之間的突觸聯系。此外，各組中再生軸突數量與 BBB 評分具有相關性，即神經軸突再生數量越多，大鼠的后肢運動功能恢復越好。
綜上述，本實驗于大鼠全橫斷脊髓損傷模型中植入生物支架 LOCS 和 CBD-BDNF，構建了一個有利于神經再生的局部微環境，并最終促進了全橫斷脊髓損傷后大鼠后肢功能的恢復及神經軸突的再生，FG 逆行示蹤可對修復效果進行評價，為脊髓損傷修復研究提供了一種可供參考的評價方法。
脊髓損傷可造成損傷平面以下運動和感覺功能不同程度的喪失[1]，損傷后脊髓微環境的改變可導致軸突回縮及再生低下[2]。應用生物支架材料橋接損傷的脊髓兩端從而引導軸突再生，已成為脊髓損傷修復研究領域一個重要的治療策略[3-5]。線性有序膠原支架（linear ordered collagen scaffolds，LOCS）不僅能為脊髓損傷后形成的缺損提供機械性支撐作用，還能結合生長因子和細胞作為其載體，參與脊髓損傷后微環境的重建[6-9]。NGF 可以對神經元起到營養保護作用，還能有助于軸突生長和神經環路的重建[10]。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是中樞神經系統創傷修復中最為常用的因子之一[11]。融合了膠原結合結構域（collagen binding domain，CBD）的 BDNF（CBD-BDNF）能特異性地結合在基于膠原的生物材料上，防止因子在體內發生快速擴散，從而在體內維持較為均勻的釋放效率[12]。神經示蹤技術在神經科學領域研究中具有舉足輕重的作用，其中逆行示蹤技術由于操作相對簡便、術后等待時間相對較短、示蹤效果明顯，而廣泛用于脊髓損傷后的神經示蹤研究中[13]。熒光金（fluorogold，FG）染料具有可自帶熒光、靈敏度高、使用方便的優點，能夠在神經元胞質積聚而不擴散，是一種常用的逆行示蹤劑。本課題組既往研究已成功應用 LOCS 結合 BDNF 修復大鼠半橫斷脊髓損傷[14]，但關于 LOCS 結合 CBD-BDNF 治療大鼠全橫斷脊髓損傷的研究尚未見報道，并且基于 LOCS 的修復方法療效評價中，可靠的示蹤技術仍需進一步探究。為此，本研究將 LOCS 與 CBD-BDNF 相結合構建一種分子緩釋平臺，用于修復大鼠全橫斷脊髓損傷組織，并探索性地利用 FG 逆行示蹤對修復效果進行評價，以期為脊髓損傷的臨床治療奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
清潔級成年雌性 SD 大鼠 32 只，體質量 180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
LOCS 及 CBD-BDNF 均為本實驗室自制[12, 14]。Triton X-100（Amresco 公司，美國）；丙酮（上海國藥集團化學試劑有限公司）；FBS、Alexa Fluor 488 驢抗小鼠 IgG 抗體、Alexa Fluor 568 驢抗兔 IgG 抗體（Invitrogen 公司，美國）；兔源神經絲（neurofilament，NF）單抗、小鼠源膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）單抗、小鼠源突觸小泡蛋白（Synaptophysin，Syn）單抗（Abcam 公司，英國）；DAPI（北京中杉金橋生物技術有限公司）；FG（Fluorochorom 公司，美國）；PBS 溶液（Thermo Fisher 公司，美國）；4% 多聚甲醛（北京雷根生物技術有限公司）；O.C.T.組織冰凍包埋劑（櫻花公司，美國）；水合氯醛、蔗糖（上海國藥集團化學試劑有限公司）。
手術器材（上海醫療器械有限公司手術器械廠）；微量進樣器（上海高鴿工貿有限公司）；陽離子防脫載玻片（北京中杉金橋生物技術有限公司）；肌電圖/誘發電位儀（Natus 公司，美國）；冰凍切片機、激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國）；熒光顯微鏡（Zeiss 公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
將 32 只 SD 大鼠隨機分成 4 組，每組 8 只。將所有大鼠以 10% 水合氯醛腹腔注射（0.35 mL/100 g）麻醉后，俯臥位固定于手術臺上，背部乙醇消毒并備皮。以 T10 棘突為中心在背部正中作一長約 2 cm 的縱切口，依次切開 T8～T11 段皮膚及肌肉，分離雙側棘突旁肌肉，行椎板切除術暴露 T9、T10 段脊髓。B、C、D 組用顯微剪切除 4 mm 長脊髓組織，A 組不切除脊髓組織。用明膠海綿輕輕壓迫止血后，C、D 組分別于損傷點移植入 4 mm 長 LOCS 和 4 mm 長結合了 CBD-BDNF 的 LOCS（移植前將 CBD-BDNF 固體粉末溶解于 PBS 中，配成濃度為 0.25 μg/μL 的溶液，并將 LOCS 浸潤其中孵化 2～3 min）。逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚，切口消毒。
1.3 觀測指標
1.3.1 BBB 運動功能評分
術前及術后 3 個月內每周 1 次，采用 BBB 評分標準對各組大鼠進行行為學評分[15]，評價大鼠后肢運動功能恢復情況。
1.3.2 神經電生理檢測
術后 3 個月每組隨機取 5 只大鼠，10% 水合氯醛腹腔注射（0.35 mL/100 g）麻醉后，用肌電圖/誘發電位儀測量運動誘發電位（motor evoked potential，MEP）。測量時刺激電極置于大鼠大腦皮層一側，記錄電極置于大鼠對側腓腸肌上，采用單次刺激，刺激電流為 45 mA，刺激時長為 0.1 ms，頻率為 2 Hz。記錄各組大鼠的 MEP 潛伏期。
1.3.3 注射 FG 逆行示蹤檢測
術后 3 個月，對所有大鼠行 10% 水合氯醛腹腔注射（0.35 mL/100 g）麻醉，俯臥位固定于手術臺上，背部乙醇消毒并備皮。以 L1 棘突為標記在腰背部正中向尾側作一長約 2 cm 的縱切口，采用椎板切除術暴露脊髓；然后借助立體定位儀支架固定微量進樣器，以 L2 段脊髓后正中靜脈為中心于左右各 1 mm 處進針，分別在進針深度 0.5、1.0、1.5 mm 處各注射 0.1 μL FG，每個點留針 5 min，注射完畢后緩慢拔針。逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚，傷口消毒。
FG 逆行示蹤后 1 周，每只大鼠以 4% 多聚甲醛經心臟灌注固定，取出大腦及胸段脊髓組織置于 4% 多聚甲醛固定過夜；固定后的脊髓組織依次用 20%、30% 梯度蔗糖溶液 4℃ 脫水各 12 h。脫水完畢后大體觀察脊髓組織形態。然后切取包含損傷區在內的約 2 cm 長脊髓組織，再分別將損傷區以上 1 cm 左右胸段脊髓和損傷區以下 1 cm 腰段脊髓截成約 4 mm 的多個小段。所有腦組織用 O.C.T.包埋劑包埋，采用冷凍連續冠狀切片，片厚 30 μm；包含損傷區的胸段脊髓采用冷凍連續水平切片，片厚 15 μm；上述分別截取的胸段、腰段 4 mm 脊髓小段采用連續冠狀切片，片厚 30 μm。
逆行示蹤結果觀測：每只大鼠各取 5 張腦部及脊髓冠狀切片，直接置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，由于 FG 在 405 nm 激發光下受光源顏色干擾不利于觀察，因此掃描時使用程序設定成藍色。將掃描所得圖像參數調節一致后，利用 Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統，計算 FG 陽性細胞積分吸光度（IA）值，取均值。
1.3.4 免疫熒光染色觀察
① 全橫斷脊髓損傷模型的免疫熒光染色觀察：從 D 組水平切片中分別挑選出自脊髓背側至腹側的組織切片，冷丙酮固定，PBS 洗滌 3 次；0.3%Triton X-100 透膜 10 min，PBS 洗滌 3 次；5%FBS 室溫封閉 1 h，棄去血清，滴加一抗（小鼠源 GFAP 單抗，1∶500），4℃ 孵育過夜；PBS 洗滌 3 次并吸干液體后，滴加相應二抗（Alexa Fluor 488 驢抗小鼠 IgG 抗體，1∶500），室溫孵育 1 h；PBS 洗滌 3 次，最后用 DAPI 進行細胞核染色，封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。
② 脊髓損傷區軸突再生情況觀察：取各組脊髓水平切片，同 ① 方法采用免疫熒光染色法觀察各組脊髓損傷區軸突再生情況。一抗采用小鼠源 GFAP 單抗（1∶500）、兔源 NF 單抗（1∶500），二抗采用 Alexa Fluor 488 驢抗小鼠 IgG 抗體（1∶500）、Alexa Fluor 568 驢抗兔 IgG 抗體（1∶500）。從每只大鼠損傷中心的高倍鏡圖片中隨機選取 5 張，計算 NF 陽性軸突數。
③ D 組再生軸突的突觸形成檢測：同 ① 方法采用免疫熒光染色法觀察 D 組脊髓損傷區再生軸突的突觸形成情況。一抗采用小鼠源 Syn 單抗（1∶500）、兔源 NF 單抗（1∶500），二抗采用 Alexa Fluor 488 驢抗小鼠 IgG 抗體（1∶500）、Alexa Fluor 568 驢抗兔 IgG 抗體（1∶500）。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BBB 運動功能評分
術前各組大鼠 BBB 評分均為 21 分，術后即刻均降為 0 分。術后 1 周，A 組大鼠運動功能恢復至正常水平（21 分），B～D 組 BBB 評分在術后 2 個月內呈上升狀態，2 個月后基本維持在平臺期。術后各時間點 B、C、D 組 BBB 評分均顯著低于 A 組（P<0.05）。術后 2～12 周 D 組 BBB 評分均明顯高于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；C 組 BBB 評分在術后 3～8 周及 11、12 周明顯高于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
2.2 神經電生理檢測
A、C、D 組均可檢測到 MEP 電位，其中 A 組 MEP 電位波形穩定，潛伏期短且振幅大。C、D 組 MEP 潛伏期明顯長于 A 組，C 組長于 D 組；MEP 振幅明顯小于 A 組，但 C、D 組間相差不明顯。B 組只有 1 只大鼠可檢測到輕微振幅，其余 4 只未檢測到 MEP。見圖 2。A、C、D 組 MEP 潛伏期分別為（3.420±0.928）、（15.030±2.745）以及（7.610±2.039）ms，C、D 組顯著長于 A 組，C 組顯著長于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 脊髓組織形態觀察
術后 3 個月 A 組脊髓未見明顯損傷點，脊髓形態保持完整。B 組脊髓損傷區域向兩端延伸，組織再生長較少且有明顯空洞、瘢痕，損傷部位組織破壞嚴重。C、D 組脊髓形態恢復較好，粗細程度和形態基本與正常脊髓相似，D 組修復效果優于 C 組。見圖 3。
2.4 FG 逆行示蹤結果觀測
各組大鼠腦部冠狀面圖像觀察示，A 組大鼠大腦皮層的錐體細胞層可清晰見到 FG 陽性標記細胞中體積較大的突觸，其余各組均未檢測到相應錐體細胞層中 FG 陽性細胞的存在。見圖 4。
各組大鼠損傷區以下腰段脊髓冠狀面圖像觀察示，脊髓灰質中均充滿了 FG 陽性細胞，整片區域亮度顯著。見圖 5。A～D 組 IA 值分別為 2 633 674±296 048、2 239 275±260 029、2 400 895±276 230、2 471 926±272 964，比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
損傷區以上胸段脊髓冠狀面圖像觀察示，A 組 FG 陽性區域基本布滿整個脊髓灰質；B 組脊髓灰質中只有極少 FG 陽性區域存在；C、D 組脊髓灰質中出現了少許陽性細胞區域，D 組陽性區域略大于 C 組。見圖 6。A～D 組 IA 值分別為 1 927 617±250 029、44 839±368、291 713±62 828、330 619±80 252，A 組顯著高于 B、C、D 組，C、D 組高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間差異無統計學意義（P>0.05）。
2.5 免疫熒光染色觀察
2.5.1 全橫斷脊髓損傷模型觀察
D 組同一脊髓組織背側至腹側的水平切片中，切片兩側 GFAP 陽性信號富集的區域之間可見明顯的全橫斷脊髓損傷區，脊髓組織已明顯離斷，并且損傷區的組織形態明顯異于正常組織，提示全橫斷脊髓損傷造模成功。見圖 7。
2.5.2 脊髓損傷區軸突再生情況
術后 3 個月，A 組 T9、T10 節段脊髓存在大量 NF 陽性信號；B 組僅在損傷區邊緣出現部分 NF 陽性信號，損傷中心只存在極少 NF 陽性信號；C 組脊髓損傷區有少量 NF 陽性信號；D 組損傷區出現大量 NF 陽性信號，并且 NF 陽性信號從正常組織向損傷區延伸。見圖 8。各組脊髓損傷中心放大像顯示，A、B、C、D 組 NF 陽性軸突數分別為（35.2±3.1）、（3.5±1.3）、（10.8±1.7）、（22.3±2.2）個/視野，A 組明顯多于 B、C、D 組，C、D 組多于 B 組，D 組多于 C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 9。
D 組脊髓損傷中心 NF 陽性軸突富集區域檢測到多個 NF 與突觸信號標志物 Syn 雙陽性信號，二者緊密接觸，提示部分再生的軸突在損傷區內能形成突觸連接。見圖 10。
圖1
各時間點各組大鼠 BBB 評分
Figure1.
BBB scores of rats in each group at each time point
圖2
術后 3 個月各組 MEP 測量
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure2. MEP tests of each group at 3 months after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖3
術后 3 個月各組脊髓組織形態觀察
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure3. Morphological observation of spinal cords in each group at 3 months after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖4
FG 逆行示蹤后大鼠腦部冠狀面觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×20）
a. A 組；b. D 組
Figure4. Observation of brain coronal section after retrograde tracing with FG (Laser scanning confocal microscope×20)a. Group A; b. Group D
圖5
FG 逆行示蹤后各組損傷區以下腰段脊髓冠狀面觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×20）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Observation of coronal sections of lumbar spinal cords below lesion sites in each group after retrograde tracing with FG (Laser scanning confocal microscope×20)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖6
FG 逆行示蹤后各組損傷區以上胸段脊髓冠狀面觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×20）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure6. Observation of coronal sections of cervical spinal cords above lesion sites in each group after retrograde tracing with FG (Laser scanning confocal microscope×20)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖7
全橫斷脊髓損傷模型的免疫熒光染色觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×10）
藍色示 DAPI，綠色示 GFAP；從上至下依次為脊髓背側至腹側，從左至右為頭側至尾側
Figure7. Immunofluorescent stained observation of transected spinal cord injury model (Laser scanning confocal microscope×10)Blue for DAPI, green for GFAP; from top to bottom for dorsal to ventral spinal cord respectively, from left to right for rostral to caudal
圖8
術后 3 個月各組脊髓損傷區域軸突再生情況（激光掃描共聚焦顯微鏡×10）
藍色示 DAPI，綠色示 GFAP，紅色示 NF；從左至右為頭側至尾側 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure8. Axonal regeneration in lesion area of each group at3 months after operation (Laser scanning confocal microscope×10)Blue for DAPI, green for GFAP, red for NF; from left to right for rostral to caudal a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖9
術后 3 個月各組脊髓損傷中心軸突再生情況（激光掃描共聚焦顯微鏡×40）
藍色示 DAPI，綠色示 GFAP，紅色示 NF a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure9. Axonal regeneration in lesion center of each group at 3 months after operation (Laser scanning confocal microscope×40)Blue for DAPI, green for GFAP, red for NF a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖10
術后 3 個月 D 組再生軸突突觸形成觀察（激光掃描共聚焦顯微鏡×120）
從左至右依次為 DAPI、NF、Syn 及三者疊加
Figure10. Synapse formation of regenerated axons in group D at 3 months after operation (Laser scanning confocal microscope×120)From left to right for DAPI, NF, Syn, and merge, respectively
3 討論
脊髓損傷后，脊髓下行運動神經和上行感覺神經遭到嚴重破壞，損傷后的出血、炎性反應等次級傷害會進一步導致局部神經組織和損傷平面以下神經環路的損害[16]。脊髓損傷后膠質瘢痕、空洞等物理屏障的形成，極大地阻礙了軸突的再生[17]。脊髓損傷類型有多種，全橫斷損傷是其中最為嚴重的類型，它能導致損傷區域所有運動及感覺神經軸突束的丟失，損傷后軸突很難再生[18]，治療難度最大。
目前針對脊髓損傷修復的一種觀點是，通過應用生物材料在損傷脊髓之間搭建橋接來連接脊髓組織，并通過改善微環境來誘導軸突再生[19-20]。神經再生膠原支架 LOCS 來源于天然動物膠原蛋白，它通過模擬正常中樞神經系統的細胞外基質，能在體內為神經組織提供一個良好的再生微環境，有序引導神經再生的方向，同時支架本身也有治療作用，能抑制瘢痕的生成[20]。本實驗術后 3 個月脊髓形態觀察發現，B 組脊髓損傷向兩端延伸，而 C、D 組大鼠脊髓形態恢復較好，雖然 C 組脊髓內部也有空洞形成，但阻止了損傷的持續延伸，表明 LOCS 不僅能減小損傷面積，還能通過其橋接作用促進全橫斷損傷脊髓組織的連接及再生。
脊髓損傷后神經再生低下的一個重要因素在于神經生長因子的缺乏以及生長抑制因子的大量釋放[16]。目前對此的治療途徑之一是利用各種方法向體內遞送生長促進因子，如各種神經營養因子。神經營養因子不僅可以促進中樞和周圍神經系統神經元的生長發育，而且對成熟神經元的維持以及軸突生長和神經遞質傳遞等有重要作用[21]。其中，BDNF 可以促進神經元存活、受損軸突再生及髓鞘化，還能促進神經可塑性等，目前被認為是脊髓損傷治療中的有效治療因子[22]。本實驗中使用的 CBD-BDNF，是通過在天然 BDNF 上融合 CBD，賦予其特殊的膠原結合能力。我們前期研究已經證實了 CBD-BDNF 相比天然的 BDNF 能更好地結合膠原材料，從而保證因子在膠原支架上的緩慢釋放以及在體內形成持續作用[14, 23]。Han 等[14]應用 CBD-BDNF 與 LOCS 治療半橫斷脊髓損傷大鼠，術后 15 周內觀察到了大鼠運動功能的恢復。在另一個研究中，他們將 CBD-BDNF 與 EGF 受體中和性抗體與 LOCS 結合，成功用于修復長度為 6 mm 的大鼠全橫斷脊髓損傷，并在術后 8 周進行了分析評價[23]。值得注意的是，該研究中未探討其對于功能恢復的作用。基于此，本實驗所采用的損傷模型為4 mm 長全橫斷脊髓損傷大鼠模型，采用 CBD-BDNF 結合 LOCS 移植修復，術后 3 個月內觀察大鼠后肢功能的改善情況；軸突再生的相關研究則采用了免疫熒光染色和 FG 逆行示蹤，這也是類似治療方法中首次采用 FG 逆行示蹤進行評價。
本實驗結果顯示，C、D 組大鼠在術后 3 個月內表現出了明顯的后肢運動功能恢復，BBB 評分明顯高于未經治療的 B 組，提示 LOCS 移植治療能很好地促進全橫斷脊髓損傷后的后肢運動功能恢復。且 D 組 BBB 評分顯著高于 C 組，提示在結合了 CBD-BDNF 后，LOCS 在體內形成了有效的分子遞送平臺，進一步提升了運動功能的恢復。上述結果說明材料和因子具有一定的修復效果，但治療后大鼠的運動功能仍難以恢復至正常水平，修復方法尚需要進一步改進。電生理檢測結果顯示，在 C、D 組成功檢測到了全橫斷脊髓損傷大鼠的 MEP，而 B 組中大多數動物未檢測到 MEP，這與脊髓形態觀察結果基本對應，即 B 組脊髓組織缺損嚴重影響了神經電沖動傳導。C、D 組 MEP 潛伏期均長于 A 組，而 D 組明顯短于 C 組，說明相比于未經治療的 B 組，C 組中 LOCS 在一定程度上促進了全橫斷脊髓損傷后電生理的恢復，并且 D 組在結合 CBD-BDNF 后能進一步促進 MEP 傳導的恢復。提示脊髓損傷大鼠經過治療后，可能存在損傷平面以下神經環路與突觸聯系的重建。
神經示蹤技術可以很好地顯示中樞神經系統神經的走行及評價脊髓損傷后修復效果。順行示蹤一般用于下行傳導束的追蹤，可以清晰顯示皮質脊髓束的纖維走行等[24]；逆行示蹤技術常用于上行傳導束追蹤[25-26]，其操作更為簡便。本實驗采用的 FG 是一種耐紫外線照射、褪色較慢的逆行示蹤劑，可在熒光顯微鏡下直接觀察，所以既不需要在暗室內曝光顯色，也不需要通過底物反應顯色。本實驗中從損傷點以下的 L2 段脊髓注射 FG，A 組大腦皮層的錐體層細胞可檢測到 FG 標記陽性細胞，說明 FG 可以被脊髓神經元吸收并向上運輸；在 B、C、D 組的相同細胞層則并未檢測到 FG 陽性信號，可能原因是損傷后的脊髓神經組織再生有限，FG 僅限于損傷區以上胸段脊髓可檢測到，不足以上傳到腦皮層。在損傷區以上的胸段脊髓冠狀面切片觀察中，雖然 C、D 組灰質中 FG 陽性區域的 IA 值無統計學差異，但均明顯大于 B 組，表明全橫斷脊髓損傷后，通過在損傷點移植入 LOCS 或結合了 CBD-BDNF 的 LOCS 進行治療，能夠促進上行神經軸突跨越損傷區進行再生。但是，本次實驗中的示蹤效果并不十分理想，提示了此治療方法或示蹤方法仍需改進。
本實驗挑選出 D 組自脊髓背側至腹側的組織切片行免疫熒光染色，結果顯示各組織切片中間存在明顯的脊髓損傷區域，說明全橫斷脊髓損傷模型成功建立。D 組損傷區域出現了大量 NF 陽性的神經組織連接，并且損傷中心再生軸突明顯多于 B、C 組，說明 LOCS 結合 CBD-BDNF 的治療方法能有效促進脊髓損傷大鼠的軸突再生。Syn 是一種神經突觸的特異性標記，值得注意的是，在 D 組損傷中心再生軸突大量聚集的區域，部分再生軸突之間表現出了 Syn 陽性突觸的形成，提示 LOCS 結合 CBD-BDNF 的治療方法在促進軸突再生的同時重建了神經軸突之間的突觸聯系。此外，各組中再生軸突數量與 BBB 評分具有相關性，即神經軸突再生數量越多，大鼠的后肢運動功能恢復越好。
綜上述，本實驗于大鼠全橫斷脊髓損傷模型中植入生物支架 LOCS 和 CBD-BDNF，構建了一個有利于神經再生的局部微環境，并最終促進了全橫斷脊髓損傷后大鼠后肢功能的恢復及神經軸突的再生，FG 逆行示蹤可對修復效果進行評價，為脊髓損傷修復研究提供了一種可供參考的評價方法。
