引用本文： 李智, 吳海輝. 人尿液干細胞聯合硫酸軟骨素酶 ABC 對脊髓損傷后神經生長因子和腦源性神經營養因子表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(11): 1377-1383. doi: 10.7507/1002-1892.201706082 復制
人尿液干細胞（human urine-derived stem cells，hUSCs）是近年來發現的新型干細胞，相對于其他干細胞，hUSCs 從尿液中提取，避免了額外創傷。研究顯示，hUSCs 具有多向分化潛能，能向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞以及骨骼肌/平滑肌細胞分化[1]，可用于組織工程研究和細胞治療。硫酸軟骨素酶 ABC（chondroitinase ABC，chABC）是硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG）分解酶，可特異性阻斷 CSPG 對神經軸突再生的抑制作用[2]。相關研究表明，chABC 可單獨或聯合其他 MSCs 對脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）發揮保護作用[3-4]。目前，國內外對于 hUSCs 的研究多集中于泌尿系組織工程研究以及成骨方向的細胞水平研究，缺少對神經軸突再生和 SCI 體內研究報道。基于此，本實驗利用 Allen 法建立大鼠 SCI 模型，經 hUSCs 聯合 chABC 鞘內注射后觀察其對大鼠 SCI 后神經生長因子（nerve growth factor，NGF）和腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的影響，探討相關作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 60 只，體質量 240～280 g；由中南大學湘雅醫院醫學實驗中心提供。
chABC、兔抗鼠 Bax、兔抗鼠 Bcl-2（Sigma 公司，美國）；DMEM/F12（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）；Giemsa 染液（中南大學湘雅醫學院醫學實驗中心）；戊巴比妥鈉（Bio-Rad 公司，美國）；0.9% 氯化鈉注射液（安徽雙鶴藥業有限責任公司）；PrimeScriptTM RT-PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；山羊抗大鼠 NGF、BDNF 多克隆抗體（Oncogen 公司，美國）；山羊抗兔二抗、小鼠抗山羊二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司）；GAPDH、DAB 顯色試劑盒（Santa Cruz 公司，美國）。Image Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 hUSCs 分離及鑒定
供體留取尿液前充分清洗尿道，無菌條件下收集健康男性中段尿液 400 mL，按照參考文獻[5]方法提取 hUSCs 原代細胞。取原代細胞分別行 Giemsa 染色，成軟骨誘導 21 d 后甲苯胺藍染色，成骨誘導 21 d 后茜素紅染色；染色后均于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。細胞傳至第 3 代，以半徑 3 cm、1 000 r/min 離心，取 10 mL 密度為 1.0×108 個/mL 的細胞轉移至流式管內，根據參考文獻[6]方法，利用流式細胞儀檢測細胞 CD29、CD73 和 CD34 表達。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 SCI 模型制備方法
大鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥麻醉后，無菌條件下行 T9～11 椎板切除，暴露 T10 脊髓，采用 Allen 法將 10 g 打擊錘固定在 6 cm 高度，松開打擊錘，致傷量為 60 g/cm。大鼠出現擺尾反射，雙后肢遲緩性痙攣，提示 SCI 模型制備成功。
1.3.2 實驗分組及處理
將 60 只大鼠隨機分為 5 組，每組 12 只，分別為假手術組（A 組）、SCI 組（B 組）、SCI+hUSCs 組（C 組）、SCI+chABC 組（D 組）、SCI+hUSCs+chABC 組（E 組）。A 組大鼠僅手術切除 T9～11 椎板。B、C、D、E 組大鼠參照 1.3.1 方法制備 SCI 模型。模型制備后，B 組不作處理；C 組采用微量注射器于鞘內注射 10 μL 密度為 3.0×104 個/μL 的 hUSCs 單細胞懸液，每日 1 次，連續 7 d；D 組采用微量注射器于蛛網膜下腔注射 10 μL 濃度為 5 U/mL 的 chABC[7]，每日 1 次，連續 7 d；E 組參照 C、D 組方法聯合注射。
1.4 觀測指標
1.4.1 大鼠下肢運動功能觀察
模型制備后 10、20、30 d，采用 BBB 評分法評價各組大鼠下肢運動功能，觀察大鼠下肢關節活動以及下肢的步態和協調能力，運動時爪子精細運動。每只大鼠重復評定 4 次，取左、右側肢體評分均值作為實驗數據。
1.4.2 實時熒光定量 PCR 檢測 NGF、BDNF 基因表達
模型制備后 30 d，各組隨機取 5 只大鼠，同上法麻醉后，按照原手術切口入路，切取 T10 節段脊髓，長約 10 mm。取部分脊髓組織，按照 Trizol 試劑盒說明書提取總 RNA；參照 Prime ScriptTM RT-PCR 試劑盒說明書，取逆轉錄反應產物于 25 μL 反應體積中進行 PCR 反應。以 GAPDH 作為內參，按照 2–ΔΔCt 法計算 NGF、BDNF 基因相對表達量。引物由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列見表 1。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.4.3 免疫組織化學染色檢測 NGF、BDNF 表達
模型制備后 30 d，各組隨機取 7 只大鼠，同 1.4.2 方法切取 T10 節段脊髓；置于 10% 多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，連續切片，片厚 5 μm。分別行 NGF、BDNF 免疫組織化學染色，熒光倒置顯微鏡下觀察 NGF、BDNF 陽性表達（組織中出現棕黃色顆粒）；每組取 12 張切片，每張切片分別取 3 個不同視野，利用 Image Pro Plus 6.0 軟件檢測 NGF、BDNF 吸光度（A）值。
1.4.4 Western blot 檢測 Bax、Bcl-2 蛋白表達
取各時間點各組 1.4.2 中獲得的部分大鼠 T10 節段脊髓，組織剪盡量剪碎，加入裂解液后裂解 30 min，于離心半徑 3 cm、12 000 r/min 離心 30 min，取上清，BCA 法蛋白定量后調整至同等濃度，每孔上樣 40 μg，經 12%SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移至聚偏氟乙烯膜上，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，加入 TBST 稀釋的山羊抗大鼠 Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶5 000）一抗，4℃ 過夜，TBST 洗膜 3 次，加入對應二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，DAB 顯色，加入化學顯示劑后定影。
1.5 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內不同時間點 BBB 評分采用重復測量方差分析，兩兩比較采用配對t 檢驗；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hUSCs 形態學觀察及鑒定
鏡下觀察見，原代 hUSCs Giemsa 染色可見細胞呈長梭形或不規則形，成軟骨誘導后甲苯胺藍染色可見細胞質藍染，成骨誘導后茜素紅染色可見紅色鈣化灶，提示 hUSCs 具有多向分化特性。見圖 1。第 3 代細胞流式細胞儀檢測細胞表面 CD29（97.16%±1.54%）、CD73（98.79%±1.49%）表達陽性，CD34（1.27%±0.31%）表達陰性。
圖1
倒置相差顯微鏡下 hUSCs 形態學觀察
a. 原代細胞形態（×40）；b. 原代細胞 Giemsa 染色（×40）；c. 成軟骨誘導后甲苯胺藍染色（×40）；d. 成骨誘導后茜素紅染色（×10）
Figure1. Morphology observation of hUSCs under inverted phase contrast microscopea. Morphology of primary cells (×40); b. Giemsa staining of primary cells (×40); c. Toluidine blue staining of hUSCs after chondrogenesis induction for 21 days (×40); d. Alizarin red staining of hUSCs after osteogenic induction for 21 days (×10)
2.2 大鼠下肢運動功能評價
各組大鼠均存活至實驗完成。術后各組大鼠下肢運動功能逐漸恢復，BBB 評分逐漸增加，比較差異有統計學意義（P<0.05）。模型制備后 10、20、30 d B 組下肢運動功能 BBB 評分均顯著低于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著低于 A 組，C、D 組低于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
各組各時間點大鼠 BBB 評分比較（n=12，
）
Table2.
BBB scores in each group at different time points (n=12,
)
2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 NGF、BDNF 基因表達
模型制備后 30 d，B 組 NGF、BDNF 基因相對表達量均顯著低于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著低于 A 組，C、D 組低于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
各組 NGF 及 BDNF 基因相對表達量
Figure2.
Relative mRNA expression of NGF and BDNF in each group
2.4 免疫組織化學染色檢測 NGF、BDNF 表達
模型制備后 30 d，鏡下觀察各組均可見 NGF、BDNF 陽性表達。其中，A 組染色較深，白質結構完整，組織間隙少；B 組染色較淺，不均勻，且組織間隙稀疏；C、D 組染色較 B 組深，白質結構輪廓存在，組織間隙略稀疏；E 組較 B、C、D 組染色深，組織結構致密，組織間隙較少，但較 A 組稀疏。見圖 3、4。B 組 NGF、BDNF A 值均顯著低于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著低于 A 組，C、D 組低于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
圖3
各組 NGF 免疫組織化學染色觀察（×40）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure3. NGF protein expression in the spinal cord by immunohistochemistry staining in each group (×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
圖4
各組 BDNF 免疫組織化學染色觀察（×40）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure4. BDNF protein expression in the spinal cord by immunohistochemistry staining in each group (×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
表3
免疫組織化學染色測量各組 NGF、BDNF A 值（n=7，
s）
Table3.
Absorbance value of NGF and BDNF in each group detected by immunohistochemistry staining (n=7,
)
2.5 Western blot 檢測 Bax、Bcl-2 蛋白表達
Western blot 檢測顯示，A、B、C、D、E 組 Bax 蛋白相對表達量分別為 0.31±0.04、1.05±0.09、0.81±0.07、0.79±0.08、0.46±0.05。B 組 Bax 蛋白相對表達量明顯高于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著高于 A 組，C、D 組高于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）； C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
A、B、C、D、E 組 Bcl-2 蛋白相對表達量分別為 1.03±0.06、0.35±0.04、0.58±0.07、0.57±0.06、0.82±0.07。B 組 Bcl-2 蛋白相對表達量顯著低于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著低于 A 組，C、D 組低于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測各組 Bax、Bcl-2 蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 5：E 組
Figure5. The protein expression of Bax and Bcl-2 by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B3: Group C 4: Group D 5: Group E
3 討論
hUSCs 是 MSCs 的一種，在體外可自我增殖和多向分化，具有與人脂肪間充質干細胞、BMSCs 相似的生物特性。因 hUSCs 具有無創獲取、來源便捷等優勢，近年來受到研究者青睞[5, 8]。細胞表面抗原決定其生物學特性，研究顯示，第 1～4 代 hUSCs 可高表達 CD29、CD44、CD73、CD90 和 CD105，低表達 CD117 和 CD133，幾乎不表達 CD31、CD34、CD45[9]。為驗證 hUSCs 細胞表型，本實驗通過提純健康男性 hUSCs 后，利用流式細胞儀檢測其細胞表型，發現 hUSCs 高表達 CD29、CD73，極低表達 CD34，具有與其他 MSCs 相似的抗原表型。因此，進一步設想 hUSCs 與其他 MSCs 一樣具有神經修復作用。chABC 是目前已知的對 SCI 繼發性損傷具有阻斷功能的酶類，Bradbury 等[10]對 chABC 的修復機制進行了研究，主要表現在以下幾方面：減少硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）受體介導的生長抑制作用；克服 CSPGs 和基質分子間的相互作用；調節免疫和炎性反應對軸突生長的抑制作用；保護未受損的神經元。有研究報道，chABC 與 MSCs 聯合使用修復 SCI 的效果更顯著[11]。基于此，本實驗嘗試利用 hUSCs 聯合 chABC 鞘內注射，以觀察其對大鼠 SCI 的影響。
本研究結果顯示，模型制備后 10、20、30 d，單獨給予 hUSCs 可提高大鼠下肢運動功能評分，而聯合用藥后大鼠下肢運動功能評分進一步提高，提示 hUSCs 對 SCI 后大鼠下肢運動功能具有一定改善作用，并且聯合 chABC 后治療效果更好。為探究其分子機制，我們設計實驗從基因和蛋白水平探索了 NGF 和 BDNF 表達。NGF 是一類可維持神經細胞生長和分化的特殊蛋白，可對損傷的神經元細胞起到保護作用，刺激和誘導神經元細胞存活[12]。研究報道，NGF 可促進神經元的生長和損傷神經元的修復[13]。BDNF 可有效預防 SCI 后神經細胞壞死、改善神經元的病理狀態、促進受損傷神經元修復、再生[14]。研究表明，BDNF 可促進脊髓神經元的存活和神經纖維的延長，抑制 SCI 神經元胞體萎縮和凋亡[15]。通過實時熒光定量 PCR 和免疫組織化學染色分析發現，單獨給予 hUSCs 可提高 NGF 和 BDNF 基因和蛋白表達，且聯合用藥后基因和蛋白表達量進一步提高，提示 hUSCs 聯合 chABC 用藥可促進損傷脊髓 NGF 和 BDNF 基因和蛋白表達，從而發揮保護作用。
神經細胞凋亡一直是 SCI 治療難以解決的問題，SCI 主要以神經元和神經膠質細胞凋亡為主，Bax 蛋白存在于胞質線粒體內，SCI 刺激可激活 Bax 蛋白使線粒體膜通透性改變，從而誘發神經細胞凋亡[16]。而 Bcl-2 是一種細胞質蛋白，在神經細胞中表達水平較高，并且隨著神經系統的逐漸完善，其表達維持在較低水平[17]。Bcl-2 可抑制 SCI 后各種途徑引起的細胞凋亡[18]。此外，Bcl-2 是一種可誘導基因，可通過轉基因方式使動物高表達 Bcl-2，從而減輕脊髓神經損傷，提高脊髓組織抗凋亡的能力，有效阻止神經細胞凋亡[19]。本實驗 Western blot 檢測顯示，hUSCs 可明顯抑制 Bax 表達，促進 Bcl-2 恢復，而聯合用藥治療效果較單純給予 hUSCs 更為顯著，提示 hUSCs 聯合 chABC 用藥可顯著抑制 SCI 神經細胞凋亡，從而發揮保護作用。探究其機制，可能有以下原因：一方面，SCI 后膠質細胞活化增生，產生不利于脊髓修復的微環境，脊髓組織結構受到嚴重破壞導致細胞大量死亡，炎性因子以及壞死細胞內釋放的蛋白酶導致細胞骨架蛋白降解，Bcl-2 蛋白受抑制，而 Bax 蛋白表達大量增加。當 hUSCs 移植進入損傷區后，可釋放 NGF 和 BDNF 等神經營養因子，對 SCI 修復起到積極作用。另一方面，chABC 可抑制 CSPGs 受體介導的神經損傷作用，調節免疫和炎性反應對軸突生長的抑制作用。此外，chABC 也會促進星形膠質細胞釋放神經營養因子，協同 hUSCs 對損傷脊髓產生修復作用。
綜上述，本研究結果顯示 hUSCs 對 SCI 具有一定修復功能，與 chABC 聯合運用后可明顯增加其治療效果，這一作用可能是通過提高 NGF、BDNF 基因和蛋白表達，以及通過抑制神經細胞凋亡途徑發揮作用，這為今后干細胞治療 SCI 提供了新的參考。
人尿液干細胞（human urine-derived stem cells，hUSCs）是近年來發現的新型干細胞，相對于其他干細胞，hUSCs 從尿液中提取，避免了額外創傷。研究顯示，hUSCs 具有多向分化潛能，能向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞以及骨骼肌/平滑肌細胞分化[1]，可用于組織工程研究和細胞治療。硫酸軟骨素酶 ABC（chondroitinase ABC，chABC）是硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG）分解酶，可特異性阻斷 CSPG 對神經軸突再生的抑制作用[2]。相關研究表明，chABC 可單獨或聯合其他 MSCs 對脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）發揮保護作用[3-4]。目前，國內外對于 hUSCs 的研究多集中于泌尿系組織工程研究以及成骨方向的細胞水平研究，缺少對神經軸突再生和 SCI 體內研究報道。基于此，本實驗利用 Allen 法建立大鼠 SCI 模型，經 hUSCs 聯合 chABC 鞘內注射后觀察其對大鼠 SCI 后神經生長因子（nerve growth factor，NGF）和腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的影響，探討相關作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 60 只，體質量 240～280 g；由中南大學湘雅醫院醫學實驗中心提供。
chABC、兔抗鼠 Bax、兔抗鼠 Bcl-2（Sigma 公司，美國）；DMEM/F12（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）；Giemsa 染液（中南大學湘雅醫學院醫學實驗中心）；戊巴比妥鈉（Bio-Rad 公司，美國）；0.9% 氯化鈉注射液（安徽雙鶴藥業有限責任公司）；PrimeScriptTM RT-PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；山羊抗大鼠 NGF、BDNF 多克隆抗體（Oncogen 公司，美國）；山羊抗兔二抗、小鼠抗山羊二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司）；GAPDH、DAB 顯色試劑盒（Santa Cruz 公司，美國）。Image Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 hUSCs 分離及鑒定
供體留取尿液前充分清洗尿道，無菌條件下收集健康男性中段尿液 400 mL，按照參考文獻[5]方法提取 hUSCs 原代細胞。取原代細胞分別行 Giemsa 染色，成軟骨誘導 21 d 后甲苯胺藍染色，成骨誘導 21 d 后茜素紅染色；染色后均于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。細胞傳至第 3 代，以半徑 3 cm、1 000 r/min 離心，取 10 mL 密度為 1.0×108 個/mL 的細胞轉移至流式管內，根據參考文獻[6]方法，利用流式細胞儀檢測細胞 CD29、CD73 和 CD34 表達。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 SCI 模型制備方法
大鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥麻醉后，無菌條件下行 T9～11 椎板切除，暴露 T10 脊髓，采用 Allen 法將 10 g 打擊錘固定在 6 cm 高度，松開打擊錘，致傷量為 60 g/cm。大鼠出現擺尾反射，雙后肢遲緩性痙攣，提示 SCI 模型制備成功。
1.3.2 實驗分組及處理
將 60 只大鼠隨機分為 5 組，每組 12 只，分別為假手術組（A 組）、SCI 組（B 組）、SCI+hUSCs 組（C 組）、SCI+chABC 組（D 組）、SCI+hUSCs+chABC 組（E 組）。A 組大鼠僅手術切除 T9～11 椎板。B、C、D、E 組大鼠參照 1.3.1 方法制備 SCI 模型。模型制備后，B 組不作處理；C 組采用微量注射器于鞘內注射 10 μL 密度為 3.0×104 個/μL 的 hUSCs 單細胞懸液，每日 1 次，連續 7 d；D 組采用微量注射器于蛛網膜下腔注射 10 μL 濃度為 5 U/mL 的 chABC[7]，每日 1 次，連續 7 d；E 組參照 C、D 組方法聯合注射。
1.4 觀測指標
1.4.1 大鼠下肢運動功能觀察
模型制備后 10、20、30 d，采用 BBB 評分法評價各組大鼠下肢運動功能，觀察大鼠下肢關節活動以及下肢的步態和協調能力，運動時爪子精細運動。每只大鼠重復評定 4 次，取左、右側肢體評分均值作為實驗數據。
1.4.2 實時熒光定量 PCR 檢測 NGF、BDNF 基因表達
模型制備后 30 d，各組隨機取 5 只大鼠，同上法麻醉后，按照原手術切口入路，切取 T10 節段脊髓，長約 10 mm。取部分脊髓組織，按照 Trizol 試劑盒說明書提取總 RNA；參照 Prime ScriptTM RT-PCR 試劑盒說明書，取逆轉錄反應產物于 25 μL 反應體積中進行 PCR 反應。以 GAPDH 作為內參，按照 2–ΔΔCt 法計算 NGF、BDNF 基因相對表達量。引物由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列見表 1。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.4.3 免疫組織化學染色檢測 NGF、BDNF 表達
模型制備后 30 d，各組隨機取 7 只大鼠，同 1.4.2 方法切取 T10 節段脊髓；置于 10% 多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，連續切片，片厚 5 μm。分別行 NGF、BDNF 免疫組織化學染色，熒光倒置顯微鏡下觀察 NGF、BDNF 陽性表達（組織中出現棕黃色顆粒）；每組取 12 張切片，每張切片分別取 3 個不同視野，利用 Image Pro Plus 6.0 軟件檢測 NGF、BDNF 吸光度（A）值。
1.4.4 Western blot 檢測 Bax、Bcl-2 蛋白表達
取各時間點各組 1.4.2 中獲得的部分大鼠 T10 節段脊髓，組織剪盡量剪碎，加入裂解液后裂解 30 min，于離心半徑 3 cm、12 000 r/min 離心 30 min，取上清，BCA 法蛋白定量后調整至同等濃度，每孔上樣 40 μg，經 12%SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移至聚偏氟乙烯膜上，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，加入 TBST 稀釋的山羊抗大鼠 Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶5 000）一抗，4℃ 過夜，TBST 洗膜 3 次，加入對應二抗（1∶2 000）室溫孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，DAB 顯色，加入化學顯示劑后定影。
1.5 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內不同時間點 BBB 評分采用重復測量方差分析，兩兩比較采用配對t 檢驗；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hUSCs 形態學觀察及鑒定
鏡下觀察見，原代 hUSCs Giemsa 染色可見細胞呈長梭形或不規則形，成軟骨誘導后甲苯胺藍染色可見細胞質藍染，成骨誘導后茜素紅染色可見紅色鈣化灶，提示 hUSCs 具有多向分化特性。見圖 1。第 3 代細胞流式細胞儀檢測細胞表面 CD29（97.16%±1.54%）、CD73（98.79%±1.49%）表達陽性，CD34（1.27%±0.31%）表達陰性。
圖1
倒置相差顯微鏡下 hUSCs 形態學觀察
a. 原代細胞形態（×40）；b. 原代細胞 Giemsa 染色（×40）；c. 成軟骨誘導后甲苯胺藍染色（×40）；d. 成骨誘導后茜素紅染色（×10）
Figure1. Morphology observation of hUSCs under inverted phase contrast microscopea. Morphology of primary cells (×40); b. Giemsa staining of primary cells (×40); c. Toluidine blue staining of hUSCs after chondrogenesis induction for 21 days (×40); d. Alizarin red staining of hUSCs after osteogenic induction for 21 days (×10)
2.2 大鼠下肢運動功能評價
各組大鼠均存活至實驗完成。術后各組大鼠下肢運動功能逐漸恢復，BBB 評分逐漸增加，比較差異有統計學意義（P<0.05）。模型制備后 10、20、30 d B 組下肢運動功能 BBB 評分均顯著低于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著低于 A 組，C、D 組低于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
各組各時間點大鼠 BBB 評分比較（n=12，
）
Table2.
BBB scores in each group at different time points (n=12,
)
2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 NGF、BDNF 基因表達
模型制備后 30 d，B 組 NGF、BDNF 基因相對表達量均顯著低于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著低于 A 組，C、D 組低于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
各組 NGF 及 BDNF 基因相對表達量
Figure2.
Relative mRNA expression of NGF and BDNF in each group
2.4 免疫組織化學染色檢測 NGF、BDNF 表達
模型制備后 30 d，鏡下觀察各組均可見 NGF、BDNF 陽性表達。其中，A 組染色較深，白質結構完整，組織間隙少；B 組染色較淺，不均勻，且組織間隙稀疏；C、D 組染色較 B 組深，白質結構輪廓存在，組織間隙略稀疏；E 組較 B、C、D 組染色深，組織結構致密，組織間隙較少，但較 A 組稀疏。見圖 3、4。B 組 NGF、BDNF A 值均顯著低于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著低于 A 組，C、D 組低于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
圖3
各組 NGF 免疫組織化學染色觀察（×40）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure3. NGF protein expression in the spinal cord by immunohistochemistry staining in each group (×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
圖4
各組 BDNF 免疫組織化學染色觀察（×40）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure4. BDNF protein expression in the spinal cord by immunohistochemistry staining in each group (×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
表3
免疫組織化學染色測量各組 NGF、BDNF A 值（n=7，
s）
Table3.
Absorbance value of NGF and BDNF in each group detected by immunohistochemistry staining (n=7,
)
2.5 Western blot 檢測 Bax、Bcl-2 蛋白表達
Western blot 檢測顯示，A、B、C、D、E 組 Bax 蛋白相對表達量分別為 0.31±0.04、1.05±0.09、0.81±0.07、0.79±0.08、0.46±0.05。B 組 Bax 蛋白相對表達量明顯高于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著高于 A 組，C、D 組高于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）； C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
A、B、C、D、E 組 Bcl-2 蛋白相對表達量分別為 1.03±0.06、0.35±0.04、0.58±0.07、0.57±0.06、0.82±0.07。B 組 Bcl-2 蛋白相對表達量顯著低于 A、C、D、E 組，C、D、E 組顯著低于 A 組，C、D 組低于 E 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測各組 Bax、Bcl-2 蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 5：E 組
Figure5. The protein expression of Bax and Bcl-2 by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B3: Group C 4: Group D 5: Group E
3 討論
hUSCs 是 MSCs 的一種，在體外可自我增殖和多向分化，具有與人脂肪間充質干細胞、BMSCs 相似的生物特性。因 hUSCs 具有無創獲取、來源便捷等優勢，近年來受到研究者青睞[5, 8]。細胞表面抗原決定其生物學特性，研究顯示，第 1～4 代 hUSCs 可高表達 CD29、CD44、CD73、CD90 和 CD105，低表達 CD117 和 CD133，幾乎不表達 CD31、CD34、CD45[9]。為驗證 hUSCs 細胞表型，本實驗通過提純健康男性 hUSCs 后，利用流式細胞儀檢測其細胞表型，發現 hUSCs 高表達 CD29、CD73，極低表達 CD34，具有與其他 MSCs 相似的抗原表型。因此，進一步設想 hUSCs 與其他 MSCs 一樣具有神經修復作用。chABC 是目前已知的對 SCI 繼發性損傷具有阻斷功能的酶類，Bradbury 等[10]對 chABC 的修復機制進行了研究，主要表現在以下幾方面：減少硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）受體介導的生長抑制作用；克服 CSPGs 和基質分子間的相互作用；調節免疫和炎性反應對軸突生長的抑制作用；保護未受損的神經元。有研究報道，chABC 與 MSCs 聯合使用修復 SCI 的效果更顯著[11]。基于此，本實驗嘗試利用 hUSCs 聯合 chABC 鞘內注射，以觀察其對大鼠 SCI 的影響。
本研究結果顯示，模型制備后 10、20、30 d，單獨給予 hUSCs 可提高大鼠下肢運動功能評分，而聯合用藥后大鼠下肢運動功能評分進一步提高，提示 hUSCs 對 SCI 后大鼠下肢運動功能具有一定改善作用，并且聯合 chABC 后治療效果更好。為探究其分子機制，我們設計實驗從基因和蛋白水平探索了 NGF 和 BDNF 表達。NGF 是一類可維持神經細胞生長和分化的特殊蛋白，可對損傷的神經元細胞起到保護作用，刺激和誘導神經元細胞存活[12]。研究報道，NGF 可促進神經元的生長和損傷神經元的修復[13]。BDNF 可有效預防 SCI 后神經細胞壞死、改善神經元的病理狀態、促進受損傷神經元修復、再生[14]。研究表明，BDNF 可促進脊髓神經元的存活和神經纖維的延長，抑制 SCI 神經元胞體萎縮和凋亡[15]。通過實時熒光定量 PCR 和免疫組織化學染色分析發現，單獨給予 hUSCs 可提高 NGF 和 BDNF 基因和蛋白表達，且聯合用藥后基因和蛋白表達量進一步提高，提示 hUSCs 聯合 chABC 用藥可促進損傷脊髓 NGF 和 BDNF 基因和蛋白表達，從而發揮保護作用。
神經細胞凋亡一直是 SCI 治療難以解決的問題，SCI 主要以神經元和神經膠質細胞凋亡為主，Bax 蛋白存在于胞質線粒體內，SCI 刺激可激活 Bax 蛋白使線粒體膜通透性改變，從而誘發神經細胞凋亡[16]。而 Bcl-2 是一種細胞質蛋白，在神經細胞中表達水平較高，并且隨著神經系統的逐漸完善，其表達維持在較低水平[17]。Bcl-2 可抑制 SCI 后各種途徑引起的細胞凋亡[18]。此外，Bcl-2 是一種可誘導基因，可通過轉基因方式使動物高表達 Bcl-2，從而減輕脊髓神經損傷，提高脊髓組織抗凋亡的能力，有效阻止神經細胞凋亡[19]。本實驗 Western blot 檢測顯示，hUSCs 可明顯抑制 Bax 表達，促進 Bcl-2 恢復，而聯合用藥治療效果較單純給予 hUSCs 更為顯著，提示 hUSCs 聯合 chABC 用藥可顯著抑制 SCI 神經細胞凋亡，從而發揮保護作用。探究其機制，可能有以下原因：一方面，SCI 后膠質細胞活化增生，產生不利于脊髓修復的微環境，脊髓組織結構受到嚴重破壞導致細胞大量死亡，炎性因子以及壞死細胞內釋放的蛋白酶導致細胞骨架蛋白降解，Bcl-2 蛋白受抑制，而 Bax 蛋白表達大量增加。當 hUSCs 移植進入損傷區后，可釋放 NGF 和 BDNF 等神經營養因子，對 SCI 修復起到積極作用。另一方面，chABC 可抑制 CSPGs 受體介導的神經損傷作用，調節免疫和炎性反應對軸突生長的抑制作用。此外，chABC 也會促進星形膠質細胞釋放神經營養因子，協同 hUSCs 對損傷脊髓產生修復作用。
綜上述，本研究結果顯示 hUSCs 對 SCI 具有一定修復功能，與 chABC 聯合運用后可明顯增加其治療效果，這一作用可能是通過提高 NGF、BDNF 基因和蛋白表達，以及通過抑制神經細胞凋亡途徑發揮作用，這為今后干細胞治療 SCI 提供了新的參考。
